细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞因子变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠脾细胞因子的变化。方法 56只雌性BALB/c小鼠随机均分7组,A组和B组分别皮下和肌肉注射5×106蛋白克隆形成单位(CFU)疫苗悬浮于100μl双歧杆菌液体培养基(MRS)、C组鼻腔内接种5×105CFU+10μlMRS、D组经口灌胃5×108CFU+100μlMRS、E组(空载体对照组)5×106CFUBb(pGEX-1λT)+100μlMRS、F组为双歧杆菌(Bb)对照组和G组为双歧杆菌液体培养基(MRS)对照组。免疫后8周各组鼠攻击感染50个Eg原头节,感染后25周剖杀小鼠,取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)刺激培养,同时设伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激对照和非刺激组。收集脾细胞培养上清液,ELISA法检测脾细胞培养上清液中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-12(IL-12)、α肿瘤坏死因子(TNF-α)和IL-10水平。结果 A、B、C和D组小鼠脾细胞培养上清液中,IFN-γ水平分别为(137.5±23.2)、(162.5±23.2)、(250.0±53.5)和(215.0±37.4)pg/ml,均高于MRS对照组(50.0±10.7)pg/ml(P0.01);IL-12水平分别为(27.5±4.6)、(32.5±4.6)、(45.0±5.4和(35.0±5.4)pg/ml,均高于MRS对照组(15.0±5.4)pg/ml(P0.01);TNF-α水平分别为(275.0±46.3)、(325.0±46.3)、(450.0±53.5)和(350.0±53.5)pg/ml,均高于MRS对照组(150.0±53.5)pg/ml(P0.01);IL-10水平分别为(37.5±4.6)、(35.0±5.4)、(25.0±5.4)和(32.5±4.6)pg/ml,均低于MRS对照组(45.0±5.4)pg/ml(P0.05或P0.01)。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生Th1型保护性免疫应答。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合基因疫苗。方法自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,抽提质粒进行双酶切鉴定,电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb),构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT-PCR扩增出约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小片段,以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到约1016bp的Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了实验基础。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。     

细粒棘球绦虫EgA31疫苗的分子生物学特征

免疫预防是控制棘球蚴病经济、快速且有效的方法。近年来棘球蚴病的免疫学和疫苗研制方面均取得了很大进展，分子疫苗成为预防包虫病流行较理想的方法。其中细粒棘球绦虫EgA31疫苗是一有希望的疫苗候选分子，本文从EgA31抗原的基因结构和免疫特性等方面介绍了其分子生物学特征。     

细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建

目的 构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)。 方法 分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板, PCR扩增获117 bp 的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和 471 bp 的Eg95基因序列。将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261, 经酶切、 PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95。电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗, 卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定。 结果质粒pSMEg95经双酶切、 PCR扩增及测序鉴定, 证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261, 并将此重组质粒导入BCG菌, 经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗 (rsBCG-Eg95)构建成功。 结论 构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导BALB/c小鼠的保护力观察

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率、抗体及其亚类的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;收集血清,常规ELISA测定血清IgG及其亚类和IgE水平,试验设有空载体、Bb和MRS对照。结果皮下注射组、肌肉注射组、鼻腔内接种组和口服灌胃组免疫小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%,血清IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1水平显著升高,IgG3和IgE水平显著降低。结论接种Bb-Eg95-EgA31疫苗能诱导小鼠产生保护力,IgGI、gG2aI、gG2b和IgG1起重要作用。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞亚群变化的研究

目的探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞亚群的变化。方法将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,流式细胞仪检测脾CD4+和CD8+T细胞亚群的百分比,同时设有空载体、Bb和MRS对照。结果以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;疫苗接种组的脾CD4+和CD8+T细胞亚群显著增加,鼻腔内接种和口服免疫组的的CD4+T细胞亚群和CD4+/CD8+比值显著高于皮下和肌肉注射组。结论CD4+和CD8+T细胞亚群在疫苗诱导的保护力中起重要作用。疫苗鼻腔内接种和口服免疫是两种较好的免疫途径。     

细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒构建及鉴定

目的构建并鉴定细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒。方法从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法分别扩增Eg95和EgA31编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)扩增Eg95-EgA31融合基因;将该融合基因定向克隆到植物表达载体pBI121中构建pBI-Eg95-EgA31重组质粒;电穿孔转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,At)LBA4404株,抽提质粒进行酶切及PCR鉴定。结果电泳及测序证实1 016bpEg95-EgA31融合基因克隆成功。经酶切及PCR证实重组质粒pBI-Eg95-EgA31成功转入根癌农杆菌。结论成功构建了细粒棘球绦虫转基因植物载体重组pBI-Eg95-EgA31质粒,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.     

细粒棘球绦虫Eg95疫苗研究进展

囊型包虫病（Cystic echinococcosis，CE）是由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus，Eg）的续绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人体健康的人畜共患寄生虫病，是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。现已证实全国有31个省市区存在包虫病感染病例，有100多万包虫病现症患者，受威胁人口达几千万，包虫病畜超过4000万头，每年新发病畜达800多万头，年经济损失超过10亿元。该病已成为西部牧区群众因病致贫、因病返贫的主要原因。随着现代社会的发展，人口流动的增加，宠物犬和经济动物狐狸的养殖数量日益增多，导致包虫病蔓延扩散。     

细粒棘球绦虫EgA31蛋白分子研究进展

本文综述了细粒棘球绦虫EgA31蛋白分子的分子生物学和分子免疫学研究进展,为进一步研究细粒棘球绦虫疫苗提供参考。     

细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建

目的分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗。方法分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列。先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95。再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95。电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌。结果双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因Eg95序列和Ag85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功。结论构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的动态观察

目的 动态观察细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫小鼠后脾细胞因子的变化.方法 将5×108克隆形成单位(CFU)和5×105 CFU疫苗分别采用口服灌胃和鼻腔黏膜接种免疫Balb/c小鼠,在免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20周各剖杀4只小鼠,取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)、刀豆蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激培养,同时设有双歧杆菌液体培养基(MRS)对照.收集脾细胞培养上清液,ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-12、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-10水平.结果 口服灌胃组的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2～8、2～8、4、6～10周升高,分别在免疫后4、2、4、6周达最高水平,其EgAg刺激组IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别为(700.0±115.5)、(45.0±5.8)、(350.0±57.7)、(112.5±14.4)ng/L,与0周[(35.0±5.8)、(12.5±2.9)、(190.0±11.6)、(25.0±5.8)ng/L]及MRS对照组[(37.5±5.0)、(13.8±2.5)、(195.0±5.8)、(27.5±2.9)ng/L]比较,差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01);鼻腔接种组的IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别在免疫后2～8、2～8、2～6、6～16周升高,分别在免疫后2、2、4、8周达最高水平,其EgAg刺激组IFN-γ、IL-12、TNF-α和IL-10水平分别为(700.0±115.5)、(55.0±5.8)、(275.0±28.9)、(140.0±11.6)ng/L,与0周[(35.0±5.8)、(12.5±2.9)、(190.0±11.6)、(25.0±5.8)ng/L]及MRS对照组[(37.5±5.0)、(13.8±2.5)、(195.0±5.8)、(27.5±2.9)ng/L]比较,差异有统计学意义(P＜0.05或＜0.01).EgAg、ConA、LPS刺激组的细胞因子水平高于相应的脾细胞悬液组(P＜0.05或＜0.01),ConA或LPS刺激组的细胞因子水平高于相应的EgAg刺激组(P＜0.05或＜0.01).结论 细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗在免疫早期(2～6周)可诱导小鼠脾细胞产生Th1和Th2混合型免疫应答.     

细粒棘球绦虫FABP与Eg95融合基因的表达与抗原性鉴定

目的构建细粒棘球绦虫脂肪酸结合蛋白(FABP)和Eg95两个保护性抗原基因的融合基因,并研究其重组蛋白的免疫学特性。方法以细粒棘球绦虫青海绵羊株保护基因FABP和Eg95的cDNA为模板,通过编码4个甘氨酸残基的连接序列,用非对称聚合酶链反应扩增融合基因FABP·Eg95,克隆至表达载体pET28a(+)中,在大肠埃希菌BL21(DB3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。通过Ni-IDA亲和层析获得高纯度目的蛋白,利用蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫反应性。结果获得的融合基因FABP·Eg95长约795bp,双酶切和测序鉴定结果均显示pET-28a(+)-FABP-Eg95重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,重组质粒pET-28a(+)-FABP-Eg95在大肠埃希菌BL21(DB3)中获得高效表达,表达相对分子质量(Mr)约为31000的重组蛋白,主要以包涵体形式存在,经亲和层析获得目的蛋白。Western blotting分析结果显示,重组蛋白与细粒棘球蚴病患者血清有良好的免疫反应性,而不与健康人血清和血吸虫病患者血清反应。结论 FABP·Eg95融合基因构建成功,纯化的重组蛋白具有一定的抗原性。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗诱导小鼠体液免疫应答的动态观察

目的观察细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95疫苗免疫小鼠体液免疫应答的动态变化。方法将疫苗分别采用经口灌胃和鼻内接种法免疫BALB/c鼠,分别于免疫后0、2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周采血,分离血清,用ELISA法测定IgG及其亚类和IgE水平。结果经口灌胃免疫组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8、6、6、6、6和10周达最高水平;鼻内接种组小鼠血清IgG、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG3和IgE水平分别在免疫后8、8、10、8、6和10周达最高水平。结论细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠脾细胞淋巴因子变化的研究

目的 探讨细粒棘球绦虫（Eg）重组BCG-Eg95疫苗免疫后对受攻击小鼠的包囊减重率及脾细胞淋巴因子的影响。方法 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗分别采用皮下注射、鼻腔内接种、口服灌胃和肌肉注射4种途径免疫BALB/C小鼠，免疫后8周用Eg原头节攻击感染，50个Eg原头节/每只小鼠，感染后18周剖杀小鼠，分离并称重细粒棘球蚴，计算包囊减重率；取脾，分离脾细胞，用Eg粗抗原（EgAg）或伴刀豆球蛋白A（ConA）刺激培养，收集脾细胞培养上清液，检测脾细胞培养上清液的白介素-2（IL-2）、γ干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-4（IL-4）水平。同时设卡介苗（BCG）和磷酸盐缓冲液（PBS）对照。 结果 以上4种疫苗接种组的包囊减重率分别为45.77%、18.20%、88.05%和92.46%；疫苗肌肉接种组的IL-2、IFN-γ和TNF-α均较PBS对照为高，分别为（30.0±0）pg/ml、（65.0±0）pg/ml和（425.0±10.7） pg/ml， IL-4低于PBS对照组， 为（10.0±0） pg/ml。 结论 细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗诱导小鼠产生辅助性T细胞1型（Th1）反应，从而对抗Eg原头节攻击感染。     

细粒棘球绦虫Eg95基因工程疫苗研究进展

细粒棘球蚴病(echinococcosis)是由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,Eg)的中绦期幼虫寄生在人体肝、肺等脏器引起的一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病.手术及药物治疗都因其局限性而受到限制,有保护作用的疫苗将成为控制该病流行的有效工具.目前最为成功的棘球蚴病疫苗为Eg95疫苗,作者综述了细粒棘球绦虫Eg95基因工程疫苗的研究进展.     

细粒棘球绦虫Eg95基因疫苗和重组抗原诱导小鼠免疫应答的比较研究

目的观察比较细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗诱导小鼠的免疫应答状况。方法实验组和对照组小鼠分别注射Eg95重组抗原(rEg95)、费氏佐剂(FCA)、pcDNA3-Eg95基因疫苗、pcDNA3质粒和生理盐水,收集各组血清用酶联免疫吸附(ELISA法)检测抗体IgG和IgG2a亚类水平;采集脾细胞用四甲基偶氮唑盐试验(MTT法)检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖反应。结果rEg95免疫组小鼠在第二次免疫后开始检测到抗Eg95抗原的IgG,并随着免疫次数的增多,血清抗体效价升高,在第1次免疫后第10周时,免疫抗体滴度可达到1∶25,600。Eg95基因疫苗免疫的小鼠产生抗体滴度随免疫次数的增加而升高,最高可达1∶3,200,但是低于Eg95重组蛋白免疫小鼠产生的抗体滴度水平。pcDNA3-Eg95免疫组产生IgG2a亚类抗体水平明显高于对照组和rEg95组。在第四次免疫后,进行淋巴细胞转化试验,MTT法检测证实rEg95和pcD-NA3-Eg95免疫的小鼠,其脾细胞均可在体外被特异性刺激增生。结论细粒棘球绦虫Eg95重组抗原和基因疫苗均可诱发小鼠产生特异性免疫应答。     

细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404中的表达效率研究

目的分析细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31在根癌农杆菌LBA4404株中的表达效率。方法用IPTG诱导根癌农杆菌0、1、3、5、7、9、11和13h,用SDS-PAGE和Western blot鉴定所表达的蛋白质。结果表达产物分子质量单位约为37.5ku,且能被感染细粒棘球蚴的鼠血清特异识别,表达蛋白约占LBA4404菌体总蛋白的20%。结论细粒棘球绦虫重组质粒pBI-Eg95-EgA31能在LBA4404中表达,为进一步构建细粒棘球绦虫转基因植物疫苗奠定了基础。     

细粒棘球绦虫疫苗研究进展

细粒棘球绦虫疫苗是防治囊型包虫病的一种重要途径，它包括死疫苗、分子疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗和重组伤寒沙门氏杆菌疫苗等，文章综述了这几种疫苗的研究进展。