EphB2在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中的表达

目的 观察EphB2在大鼠正常和畸形肛门直肠发育过程中的表达,探讨EphB2在正常和肛门直肠畸形的胚胎发牛机制中的作用.方法 ①用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸wistar孕鼠24只,制成肛门直肠畸形动物模型,根据切片观察后分为给药无畸形组(n=90)和畸形组(n=108),胎龄13～20 d的正常胎鼠(n=111)作为正常对照组;②正中矢状面、水平面连续切片,EphB2免疫组化染色.连续动态对比观察EphB2在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的表达;③常规制备胎鼠冰冻切片,解剖显微镜下手丁显微切割方法 准确切取泄殖腔标本,从中提取总RNA,通过RT-PCR方法 研究EphB2 mRNA在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠的表达.结果 免疫组化结果 :①EphB2在大鼠发育过程中正常及给药无畸形绢胚胎泄殖腔中表达,在13d和14d主要表达于尿直肠隔和泄殖腔膜.胚胎15d时在尿牛殖膈与泄殖腔膜融合处EphB2表达较强,16 d时肛膜破裂,肛门直肠形成,EphB2在直肠黏膜层表达;②EphB2在肛门直肠畸形胎鼠泄殖腔和直肠黏膜层亦有表达,测量单位面积内累积光密度值,胎龄13～16 d时与正常对照组和给药无畸形组比较,光密度值明显减小,有统(P0.05).RT-PCR半定量检测结果 :①在正常和畸形组大鼠胚胎中均能检测出EphB2表达,在胎龄13～16 d为表达高峰期,胎龄16d后逐渐降低;②畸形组与正常对照组和给药无畸形组相比较,EphB2 mRNA的表达在13～16d明显降低,有统计学意义(P<0.05).结论 EphB2可能在正常大鼠胚胎期泄殖腔和直肠发育过程中起重要作用.泄殖腔EphB2的表达减弱可能与肛门直肠畸形的发生有关.     

Wnt5a及Frizzled-1基因在肛门直肠畸形大鼠直肠发育过程中的表达及义

目的 检测Wnt5a及Frizzled-1(Fzd-1)基因在肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARM)胎鼠直肠肠壁的胚胎发育过程中的表达变化,探讨其可能与肠壁神经肌肉发育的关系.方法 将Wistar大鼠随机分为正常组与乙烯硫脲致畸的ARM组,应用免疫组化、Western Blot方法检测正常与ARM组胎鼠直肠末端组织Wnt5a及Fzd-1蛋白的定位及定量表达,RT-PCR方法检测Wnt5a及Fzd-1 mRNA的表达差异.结果 Wnt5a/Fzd-1在正常大鼠胚胎直肠发育过程中,在肠壁肌间神经丛(myenteric nerve plexus,MP)、肠壁平滑肌及黏膜层均有表达,随胚胎发育,表达强度逐渐增强,胚胎晚期主要集中在肠壁平滑肌及MP处;ARM组:越接近直肠末端的肠壁内阳性表达细胞明显减少.western blot及RT-PCR结果显示正常胎鼠直肠末端组织中Wnt5a及Fzd-1总蛋白量及mRNA明显高于畸形组(E21:Wnt5amRNA:0.81±0.14比0.21±0.03;Fzd-1mRNA:0.72±0.11比0.20±0.04;Wnt5a:1.12±0.11比0.48±0.05;Fzd-1:0.91±0.10比0.32±0.04,P<0.05).结论 Wnt5a/Fzd-1基因在肛门直肠畸形的神经肌肉发育过程中表达下调,可能与其发育不良有一定关系.     

TrkA、p75NTR mRNA在肛门直肠畸形胎鼠直肠末端的表达

目的通过检测肛门直肠畸形(ARM)胎鼠直肠末端神经生长因子受体TrkA、p75NTR mRNA的表达水平,探讨ARM直肠末端肠神经系统发育情况。方法成年SD孕鼠16只。其中实验组10只,对照组6只。实验组孕鼠在孕11 d、13 d 2次给予10 g.L-1乙烯硫脲(125 mg.kg-1)灌胃,制作先天性ARM动物模型;对照组灌胃注入等量9 g.L-1盐水。2组孕鼠在孕20 d时行剖宫手术取出胎鼠,取其直肠末端并保存于-80℃冰箱;采用反转录/实时定量PCR(RT-PCR)方法检测正常胎鼠和ARM胎鼠直肠末端TrkA、p75NTR mRNA表达情况。结果 TrkA、p75NTR mRNA在正常胎鼠直肠末端的相对表达量分别是162.221±104.675,129.778±51.976,在ARM胎鼠直肠末端中表达分别是78.937±33.425,87.145±25.812,两组比较差异均有统计学意义(Pa<0.05);琼脂糖凝胶电泳显示TrkA、p75NTR基因扩增后产物cDNA片段与引物设计的扩增片段完全吻合,TrkA、p75NTR基因条带亮度对照组均高于实验组。结论 TrkA、p75NTR mRNA在ARM胎鼠直肠末端的表达异常,提示神经生长因子及受体TrkA、p75NTR可能参与ARM肠神经系统的发育。     

Tcf4在肛门直肠畸形大鼠胚胎发育中的表达

目的 观察Tcf4在大鼠正常和畸形肛门直肠发育过程中的表达,探讨Tcf4在正常和肛门直肠畸形的胚胎发生机制中的作用.方法 用乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸Wistar孕鼠24只肛门直肠畸形动物模型,切片于显微镜下观察,确定肛门直肠畸形的存在.标本经显微镜下观察后分为正常组和肛门直肠畸形组.正中矢状面、连续切片,Tcf4免疫组化染色.连续动态对比观察Tcf4在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠发育过程中的空间分布情况.常规制备胎鼠冰冻切片,解剖显微镜下手工显微切割方法准确切取泄殖腔标本,从中提取总RNA和总蛋白,通过RT-PCR和Western blot方法分别研究Tcf4 mRNA和Tcf4蛋白在正常和畸形大鼠胚胎泄殖腔及肛门直肠的表达.结果 ①免疫组化结果:Tcf4在大鼠发育过程中正常胚胎泄殖腔中表达,在13 d和14 d主要表达于尿直肠隔和泄殖腔膜,胚胎15 d时在尿生殖膈与泄殖腔膜融合处Tcf4表达较强,16 d时肛膜破裂,肛门直肠形成,Tcf4在直肠黏膜层表达.Tcf4在肛门直肠畸形胎鼠泄殖腔和直肠黏膜层表达较弱或呈现阴性表达.②Western blot和RT-PCR半定量检测结果:在发育期的后肠中Tcf4蛋白和Tcf4 mRNA的表达表现出时间依赖性的特点,在肛门形成的关键时期即14 d、14.5 d和15 d时Tcf4的表达水平达到高峰,一旦肛门形成其表达量随即开始降低,畸形组与正常组相比较,Tcf4蛋白和Tcf4 mRNA的表达在14～15 d明显降低,有统计学意义(P<0.05).结论 在肛门直肠畸形大鼠胚胎中,在肛门直肠形成的关键时期(13～16d),Tcf4存在着时空表达不平衡的特点;在正常大鼠胚胎期泄殖腔和直肠发育过程中,Tcf4可能起重要作用.泄殖腔/后肠Tcf4的表达下调可能与肛门直肠畸形的发生有关.     

神经生长因子及其受体在肛门直肠畸形动物模型直肠末端的表达及意义

目的 观察肛门直肠畸形(ARM)动物模型直肠末端组织中神经生长因子(NGF)及其受体(NGFR)的表达,探讨ARM排便功能障碍的机制.方法 应用免疫组织化学和RT-PCR检测正常与肛门直肠畸形动物胎鼠直肠末端组织中NGF及其高亲和力受体(TrkA)、低亲和力受体(p75NTR)的表达.结果 NGF、TrkA、p75NTR在正常胎鼠直肠末端肠黏膜皱襞及肌层细胞质及细胞核中有大量表达,其平均光密度(IOD值)分别为731.749±232.177,262.815±101.722,134.674±67.127,而在肛门直肠畸形直肠末端表达较少,其平均光密度(IOD值)分别为17.973±74.945,33.145±11.128,113.010±36.468,两组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)；TrkAmRNA、P75NTRmRNA在正常胎鼠直肠末端组织中的相对表达量分别为162.221±104.675,129.778±51.967,在肛门直肠畸形胎鼠中的相对表达量分别为78.973±33.425,87.145±25.812,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NGF及其受体TrkA、p75NTR在ARM动物模型直肠末端的表达异常可能是导致其排便功能障碍的原因之一.     

大鼠肛门直肠畸形的胚胎发育研究

目的：观察大鼠正常的和畸形的肛门直肠发育过程，探讨肛门直肠畸形的胚胎发生机制。方法：用乙烯硫脲（ethylenethiourea,ETU）致畸21只孕鼠共生产泄殖腔畸形和无肛畸形胎鼠（204只）。胎龄12．5－20d的正常（n=223)及泄殖腔发育畸形的胎鼠正中矢状连续切片HE染色。连续动态对比观察泄殖腔及肛门直肠的发育过程。结果：泄殖腔发育过程中，胎龄15d前的正常鼠胚，尿直肠隔将泄殖分为腹侧的尿生殖窦和背侧的直肠两部分，二者共同相通于泄殖腔管，尿直肠隔下降与泄殖腔膜的距离逐渐减小，直至胚胎15d时与泄殖腔膜融合，直肠与膀胱分离。16d时肛膜破裂，直肠与尾沟相通。ETU致畸的胎鼠泄殖腔发育中有以下下特点；（1）尿直肠隔始终未与泄殖腔膜融合；（2）泄殖腔构型异常；（3）泄殖腔膜过短；（4）没有尾沟形成。ETU致畸胎鼠中所有的无肛畸形均为泄殖腔畸形和直肠尿道瘘。结论：鼠胚胎15d时尿直肠隔与泄殖腔膜融合。胚胎16d肛膜完全破裂，直肠与外界相通。泄殖腔构型的变化以及尿直肠隔下降并与泄殖腔隔合使直肠与膀胱分离。尿直肠隔与泄殖腔膜融合是直肠和膀胱分离的决定因素。肛门直肠畸形发生与泄殖腔构型异常以及尿直肠隔未与泄殖腔膜融合等因素有关。尿直肠隔未与泄殖腔融合是ETU诱导的大鼠肛门直肠畸形发生的直接原因。     

乙烯硫脲致畸胎鼠直肠末端Sonic hedgehog基因的表达

目的 探讨乙烯硫脲(ETU)致畸胎鼠直肠末端Sonic hedgehog(Shh)基因在胎鼠直肠肛门及其畸形发生过程中的表达和作用.方法 妊娠SD大鼠30只按受孕时间配对分为2组,实验组(n=15)在孕10 d予10 g/LETU(125 mg/kg)胃管注入,正常对照组(n=15)予等量蒸馏水.2组分别于孕13、14、15、16和17 d剖宫取胎鼠直肠末端1 cm提取RNA和组织蛋白,采用RT-PCR法和Western blot法检测Shh基因mRNA和蛋白表达情况.结果 在后肠发育的关键时期,实验组直肠末端Shh基因mRNA水平明显低于正常对照组,第14天实验组直肠末端的mRNA相对灰度值为0.29±0.22,正常对照组为2.23±0.54(t=5.72 P<0.05);第15天实验组直肠末端的mRNA相对灰度值为0.39±0.12,正常对照组为1.30±0.49(t=3.08 P<0.05).实验组Shh蛋白表达明显下降,胚胎第14天实验组直肠末端Shh基因蛋白相对灰度值为1.04±0.46,正常对照组为2.09±0.04(t=4.55 P<0.05);第15天,实验组直肠末端Shh基因蛋白相对灰度值为0.59±0.21,而正常对照组为0.95±0.16(t=26.0 P<0.05).结论 Shh的表达情况与直肠发育呈时间依赖性改变.Shh基因表达在肛门直肠及其畸形发生过程中发挥重要作用,ETU可能影响Shh信号转导系统和肛门直肠畸形发生.     

肛门直肠畸形大鼠泄殖腔胚胎发育过程中细胞凋亡的研究(英文)

目的肛门直肠正常胚胎发育过程中,细胞凋亡发挥重要作用。该研究调查了肛门直肠畸形(anorectal malformation,ARM)胎鼠泄殖腔胚胎发育过程中细胞凋亡情况,以了解ARM胚胎发育过程中细胞凋亡的作用。方法在胚胎发育的第10天,通过胃管注入乙烯硫脲(125 mg/kg)致畸孕鼠,诱导ARM胚胎。在胚胎发育的第13,13.5,14,15和16天,利用苏木素-伊红和TUNEL染色技术检测正常对照胚胎(n=102)和ARM胚胎(n=147)泄殖腔凋亡细胞的分布。结果对照组胚胎第13天尿直肠隔可见凋亡细胞,随着胚胎发育,尿直肠隔间质内的凋亡细胞逐渐增多;直肠背侧间质可见大量凋亡细胞。胚胎第14天,直肠末端和未来肛门开口处的泄殖腔膜开始出现凋亡细胞。胚胎第15天,尿直肠隔与泄殖腔膜融合,尿直肠隔间质内的凋亡细胞一直向下延伸到融合部位。ARM胎鼠与对照组胎鼠相比,在胚胎发育过程中尿直肠隔间质、直肠背侧间质和泄殖腔膜的凋亡细胞均明显减少。ARM胎鼠尿直肠隔的发育明显延迟,未与泄殖腔膜融合。结论在泄殖腔的胚胎发育过程中,尿直肠隔间质、直肠背侧间质和泄殖腔膜细胞凋亡的异常是导致ARM的原因之一。细胞凋亡的正常调控是保证肛门直肠胚胎期正常发育的关键机制之一。     

先天性肛门直肠畸形胎鼠直肠末端NGF及受体TrkA与p75的表达

目的 观察神经生长因子(NGF)及其受体TrkA、p75在先天性肛门直肠畸形(ARM)动物模型胎鼠直肠末端的表达及分布.方法 选用成年SD孕鼠16只,实验组10只,对照组6只,实验组在孕11d及13d时分别以1％乙烯硫脲(125mg/kg)灌胃制作ARM动物模型,对照组灌入等量生理盐水,两组孕鼠在孕20 d手术取出宫内胎鼠,进行形态学观察及畸形率统计,并取胎鼠盆腔、会阴部矢状面大体标本HE染色及直肠末端石蜡包埋切片,免疫组化检测NGF及其受体TrkA、p75在正常胎鼠和ARM胎鼠直肠末端的分布情况并半定量分析.结果 正常组:胎鼠存活率100％,肛门开口正常,实验组:存活率80.7％,实验组ARM发生率98.7％、短尾畸形5.1％、无尾畸形94.8％、双足内翻6.4％、脊柱裂6.4％,盆腔会阴部矢状切面HE染色显示:ARM胎鼠肛门为一闭合盲端,无正常肛门结构,直肠盲端为增生鳞状上皮组织及增厚的肌层,未见肠腺分布,直肠末端黏膜下及肌间神经丛数量:ARM组为46.40±16.08,对照组为96.33±18.57,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);免疫组化结果显示:NGF、TrkA、p75主要分布在胎鼠直肠末端黏膜下、肌间神经丛,其中NGF主要分布在细胞核,TrkA分布在细胞质,p75在细胞核、细胞质均有分布,其积分光密度(IOD值):对照组分别为731.75±232.18、262.82±101.72、134.67±67.13,ARM组分别为17.97±74.95、33.15±11.13、113.01±36.47,两组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NGF及其受体TrkA、p75可能共同参与ARM的发生、发展过程.     

Hoxd-13在肛门直肠畸形大鼠肛门直肠表达的研究

目的 通过观察Hoxd-13在正常和肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达情况,探讨Hoxd-13基因在肛门直肠畸形发生机制中的作用.方法 研究对象分为肛门直肠畸形组(n=75)和对照组(n=108),应用乙烯硫脲致畸Wistar大鼠(n=20)建立肛门直肠畸形动物模型,分别在E13、E14、E15、E16、E18和E21(Ex表示大鼠妊娠第x天)剖宫取胎,正中矢状面连续石蜡切片,进行Hoxd-13免疫组化染色,连续动态观察Hoxd-13在正常和肛门直肠畸形大鼠胚胎肛门直肠发育过程中的表达,并联合应用RT-PCR方法研究Hoxd-13 mRNA在各时期的表达情况.结果 ①免疫组化染色结果:正常大鼠胚胎中,Hoxd-13表达于尿直肠隔的间质以及后肠、泄殖腔膜和尿生殖窦的上皮层.肛门直肠畸形组大鼠胚胎中,在E13～16,Hoxd-13在尿直肠隔间质、后肠上皮层、泄殖腔膜或瘘管上皮层的表达减弱,平均光密度值明显减小,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05).在2组大鼠胚胎中,Hoxd-13的表达随着胎龄的增长呈总体增加的趋势.②RT-PCR结果:Hoxd-13mRNA扩增条带在肛门直肠畸形组呈弱带或无带,在对照组均呈亮带.其相对表达量随着胎龄的增长呈总体增加的趋势.在E13～16,肛门直肠畸形组Hoxd-13mRNA的表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).RT-PCR结果与免疫组化结果一致.结论 Hoxd-13在肛门直肠畸形大鼠胚胎尿直肠隔间质以及后肠上皮层、泄殖腔膜或瘘管上皮层表达减弱,Hoxd-13基因表达异常可能与肛门直肠畸形的发生有关.     

肛门直肠畸形动物模型末端直肠肠壁肠神经系统及突触素的胚胎发育的研究

目的 检测蛋白基因产物(protein gene product 9.5,PGP 9.5)及突触素(synaptophysin,SY)在肛门直肠畸形胎鼠直肠肠壁胚胎发育过程中的分布,探讨其可能与排便功能的关系.方法 应用免疫组化、免疫荧光和Western Blot方法检测正常与肛门直肠畸形动物胎鼠直肠末端组织PGP 9.5、SY的表达情况.结果 正常组末端结肠及直肠壁内有神经节细胞,肠壁肌层及黏膜肌层PGP 9.5、SY大量表达;畸形组胎鼠直肠末端壁内的分布均比对照组明显减少,发育延迟,但随着远离肓端.PGP 9.5、SY出现并逐渐增多.正常胎鼠直肠末端壁内中PGP 9.5、SY总蛋白量明显高于畸形组(P<0.05).结论 肠神经系统及突触素的分布异常是肛门直肠畸形动物模型直肠末端壁的重要病理改变.     

TXNIP/NLRP3通过调控Wnt/β-catenin通路促进大鼠先天性肛门直肠畸形的发生

目的研究胎鼠肛门直肠发育过程中硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)/NOD样受体家族含pyrin结构域3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)轴在泄殖腔发育中的作用。方法 50只Wistar孕鼠被随机分为先天性肛门直肠畸形(anorectal malformation, ARM)组和正常组, 每组各25只, 孕10 d分别按125 mg/kg给予乙烯硫脲(ethylene thiourea, ETU)及等量生理盐水灌胃, 孕14 d、孕15 d和孕16 d剖宫取胎, 显微镜下收集胎鼠的后肠组织。通过蛋白印迹法和免疫组织化学检测NLRP3炎性小体和TXNIP蛋白的表达量。进一步在IEC-6中转染si-NC/TXNIP, 通过实时定量PCR和蛋白印迹法检测TXNIP在mRNA和蛋白水平的敲减效率, 用蛋白印迹法、细胞免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测si-NC组和si-TXNIP组NLRP3炎性小体、β-c...     

Sfrp5/Dkk4基因在ETU诱导大鼠胚胎肛门直肠畸形中表达的初步研究北大核心CSCD

目的利用分子生物学方法检测肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARM)大鼠胚胎发育中Sfrp5/Dkk4基因的表达。方法对Wistar孕鼠进行乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)致畸,制作ARM动物模型;分别在孕15d(E15)、17d(E17)、19d(E19)和21d(E21),于ETU-无畸形对照组(NE组)、ETU-ARM畸形组(AE组)和生理盐水对照组(NS组)中各选取6只胎鼠末端直肠组织,采用蛋白印迹(Westernblot)和实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测Sfrp5/Dkk4的表达,并对其表达进行定量与比较分析。结果Western blot结果显示在E15、E17、E19和E21时,Sfrp5在NE组蛋白表达量分别为63.55±0.35、24.51±0.41、13.28±0.09和49.67±0.12;在AE组分别为21.43±0.18、59.57±0.44、61.23±0.47和32.73±0.51;在NS组分别为52.17±1.08、23.66±0.87、16.21±1.33和50.01±2.03。Dkk4在NE组蛋白表达量分别为20.07±0.09、47.15±0.15、39.88±0.37和13.75±0.47;在AE组分别为54.27±0.61、19.43±0.25、21.09±0.17和57.53±0.49;在NS组分别为23.11±0.15、45.89±0.67、41.44±0.37和17.57±1.99。提示NE组、NS组Sfrp5/Dkk4与AE组E17和E19蛋白表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而NE组与NS组在4个时间点比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。qRT-PCR结果显示在E17和E19时,Sfrp5在AE组中mRNA高表达,其表达量分别是NE组的1.63倍和1.77倍(P=0.049、0.022)、NS组的2.68倍和3.29倍(P=0.041、0.034);Dkk4在AE组中mRNA高表达,其表达量是NE组的1.75倍和1.87倍(P=0.045、0.024)、NS组的2.04倍和1.36倍(P=0.004、0.028)。结论Sfrp5/Dkk4蛋白与mRNA在胚胎发育过程E17和E19中出现异常表达,可能是导致ARM发病的因素。     

EphB2在先天性肛门直肠畸形直肠末端表达的研究

目的 研究酪氨酸蛋白激酶受体--EphB2在先天性肛门直肠畸形直肠末端组织中的mRNA表达和蛋白表达的水平,探讨EphB2与先天性肛门直肠畸形发生的关系.方法 RT-PCR方法和Western蛋白印迹方法,检测31例不同类型先天性肛门直肠畸形直肠后壁末端、5例后天瘘及8例正常直肠后壁末端EphB2在蛋白水平和mRNA水平的表达情况,应用单因素方差分析比较正常组和畸形组、不同类型的畸形组之间EphB2表达水平的差异.结果 ①先天性肛门直肠畸形末端肠壁EphB2基因mRNA相对表达量明显低于正常对照组(0.99±0.11,P=0.00).不同类型的畸形组之间,高位组(0.43±0.07)和中位组(0.47±0.10)之间差异无统计学意义(P=0.33),但二者明显低于低位组(0.64±0.06,P=0.00).后天瘘组(0.97±0.09)与正常对照组比较差异没有统计学意义(P=0.63);②Western蛋白印迹结果显示,先天性肛门直肠畸形高位组(0.21±0.05)、中位组(0.24±0.04)和低位组蛋白表达水平均明显低于后天瘘组(0.51±0.05)和正常对照组(0.52±0.03,P=0.00).不同类型的畸形之间,高位组和中位组之间无明显差异(P=0.11),但二者明显低于低位组(P＜0.01).后天瘘组与正常对照组比较差异没有统计学意义(P=0.67).结论 EphB2在先天性肛门直肠畸形直肠末端低表达.EphB2的表达和肛门直肠畸形的发生有关,EphB2在先天性肛门直肠畸形的发生中可能具有重要作用.     

肛门直肠畸形胎鼠直肠末端Gli2、BMP4基因的表达

目的探讨乙烯硫脲（ETU）致畸胎鼠直肠末端Gli2、BMP4基因在胎鼠直肠肛门及其畸形发生过程中的表达和作用。方法取妊娠SD大鼠30只,按受孕时间配对分成2组,实验组（n=15）于孕10d灌胃注入10g／LETU （125mg／kg）,对照组n=15）予等量蒸馏水。两组分别于孕13d、14d、15d、16d和17d剖宫取胎鼠直肠末端1cm提取RNA,采用RT—PCR和RealtimePCR法检测Gli2、BMP4基因在直肠肛门发育不同时期的表达情况。结果采用RT-PCR法检测Gli2、BMP4基冈在直肠肛门发育不同时期的表达情况．发现在胎鼠第13～17天,实验组直肠末端Gli2、BMP4mRNA的表达水平均明显低于正常胎鼠直肠末端（P〈0．05）。而Realtime PCR检测Gli2、BMP4mRNA表达时,发现实验组Gli2的表达在胚胎第13天、第14天、第15天分别为（0．73＋0．07、0．60＋0．09、0．81＋0．06）,勺对照组相比显著降低（P〈0．05）,而在孕第16天、第17天实验组Gli2表达比对照组虽有下降,但无统计学意义;实验组BMP4的表达在孕第3～17天均较对照组下降,差异有统计学意义。结论直肠肛门的正常发育需要Shh信号通路的正常表达,Shh信号通路中转录因子Gli2和靶基囚BMP4的异常表达在肛门直肠畸形发生过程中起重要作用,ETU可能影响Shh信号转导通路和肛门直肠畸形发生。     

邻苯二甲酸二丁酯影响类固醇激素合成急性调节蛋白致雄性胎鼠尿道下裂的机制研究CSCD

目的 研究类固醇激素合成急性调节蛋白（StAR）的表达和活性及睾酮在尿道下裂胎鼠体内发生的改变,探讨邻苯二甲酸二丁酯（DBP）诱导雄性胎鼠发生尿道下裂的机制。方法 将40只孕SD大鼠,用随机数表法分为DBP组和对照组（各20只）。于孕13～19 d上午9点给药,DBP组按照800 mg/kg体重DBP混合玉米油（DBP和玉米油总量为3 ml/kg体重）灌胃,对照组按3 ml/kg体重玉米油灌胃。第19天中午12时麻醉孕鼠后取出胎鼠,观察内外生殖器鉴别出DBP组发生尿道下裂的雄性胎鼠及对照组中的雄性胎鼠。从DBP组中发生尿道下裂的雄性胎鼠中选取40只做为尿道下裂组,再从对照组的雄性胎鼠中选取40只做为正常对照组,拍摄尿道下裂图片,测量肛门生殖结节距离,统计尿道下裂发生率,取各组胎鼠生殖结节进行HE染色。各组胎鼠断头取血用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测睾酮水平并取出各组睾丸采用定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot、免疫荧光、ELISA检测StAR mRNA及StAR的表达,对StAR相对表达量和睾酮含量进行Pearson相关性分析。Western blot检测磷酸化ERK1/2蛋白（P-ERK1/2）,总ERK1/2蛋白（T-ERK1/2）的表达,并通过两者间的比值分析睾丸中ERK1/2蛋白的磷酸化水平以明确StAR蛋白的活性高低。结果 尿道下裂组胎鼠的尿道开口于生殖结节腹侧,对照组的开口于生殖结节顶端。尿道下裂组肛门生殖结节距离（1.77±0.12） mm明显小于对照组（2.25±0.15） mm,组间比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。DBP组胎鼠尿道下裂发生率为43.3%（46/106）。尿道下裂组睾酮含量（1.45±0.62） ng/ml低于对照组（4.48±0.93） ng/ml,组间比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。尿道下裂组的StAR mRNA、StAR相对表达量及P-ERK1/T-ERK1、P-ERK2/T-ERK2分别为0.23±0.08、0.33±0.07、0.17±0.03和0.19±0.07,对照组的分别为1.00±0.00、1.44±0.19、0.31±0.08和0.43±0.14,组间差异有统计学意义（P〈0.05）。免疫荧光显示睾丸间质细胞中尿道下裂组StAR蛋白的表达少于对照组。尿道下裂组和对照组的Pearson相关系数分别为0.642和0.851（P均〈0.05）。结论 DBP不仅在转录和翻译层面降低StAR的表达,可能还通过降低ERK1/2蛋白的磷酸化水平减弱StAR蛋白的活性使睾丸中睾酮合成障碍,进而影响了雄性胎鼠生殖器的发育。     

肛门直肠畸形直肠末端FGF10和FGFr2b基因表达的研究

目的研究肛门直肠畸形（ARM）患儿直肠末端FGF10和FGFr2b基因的表达水平，以便从分子水平探讨FGF10和FGFr2b基因与ARM发生的关系。方法通过RT-PCR方法研究10例高位、10例中位和8例低位ARM畸形直肠末端FGF10mRNA和FGFr2bmRNA的表达水平，并与正常对照组进行比较。结果与正常对照组相比较，FGF10mRNA和FGFr2bmRNA的表达在高位ARM、中位ARM和低位ARM组有意义（P〈0．05）。结论直肠末端FGF10和FGFr2b基因表达的减弱可能与ARM的发生有关。     

HoxA13基因在尿道下裂胎鼠阴茎中的表达及意义

目的研究尿道下裂胎鼠阴茎中HoxA13核酸及其蛋白的表达,探讨其与尿道下裂发生的相关性。方法选用清洁级C57BL／6小鼠,用邻苯二甲酸二（2-乙基）己脂（DEHP）诱导并建立先天性尿道下裂模型;交配怀孕后,孕鼠随机分为玉米油对照组、实验组（DEHP500mg·kg^-1·d^-1）;各组持续灌胃;于怀孕第19天取出仔鼠,测量各组雄鼠体重、AGD;统计各组胎鼠尿道下裂的发生率,并观测阴茎的组织病理学变化;应用常规RT-PCR及免疫组织化学方法检测诱导出的尿道下裂胎鼠及正常对照胎鼠阴茎组织中HoxA13的mRNA及蛋白表达水平。结果对照组、实验组的AGD值分别为（0．208±0．01）cm、（0．181±0．12）cm,P〈0．01;尿道下裂发生率分别为0％、75．7％,P〈0．01。实验组胎鼠尿道板及包皮于阴茎腹侧隆起融合落后,该组尿道与腹侧皮肤间的皮下组织明显减少。DEHP500mg·kg^-1·d^-1诱导的尿道下裂胎鼠阴茎组织中HoxA13mRNA及蛋白表达较对照组明显降低。结论DEHP能影响胎鼠的生长发育及体重,并导致雄鼠外生殖器发育异常;HoxA13mRNA及蛋白的表达在DEHP诱导的尿道下裂胎鼠阴茎中均较正常对照组降低,提示HoxAl3基因异常表达可能是尿道下裂的发生机制之一。     

孕期维生素A缺乏导致胎鼠肛门直肠发育畸形的实验研究

目的 观察维生素A缺乏(vitamin A,VA)对胎鼠肛门直肠畸形(anorectal malforma-tions,ARM)的发生和末端直肠肠壁内神经系统(enteric nervous system,ENS)发育的影响.方法 SD成年雌性大鼠60只,随机分为三组(于孕前2周开始每组喂以不同剂量的VA饮食至孕期结束):①VAD组(n:20只):喂以VA缺乏饲料;②正常对照组(作为阴性对照组,n=20只):喂以普通饲料;③ETU组(即乙烯硫脲组,作为阳性对照组,n=20只):喂以普通饲料.于妊娠第10天,ETU组经胃管注入1%的乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU)(125 mg/kg);于妊娠第20天,所有孕鼠行剖宫术取胎鼠.观察活胎鼠ARM发生率以及用免疫组织化学方法检测胎鼠末端直肠PGP 9.5和S-100蛋白的表达水平.结果 (1)血清VA水平:经VA缺乏饲料喂养2周后VAD组的血清VA浓度明显低于正常对照组(P=0.0310)和ETU组(P=0.0401);(2)ARM发生率:VAD组和ETU组的胎鼠ARM发生率分别为64.5%(20/31)、45.9%(61/133),两组之间差异无统计学意义(P>0.05);正常对照组未发现ARM;(3)免疫组织化学结果:①在有肛门胎鼠末端直肠中,PGP 9.5和S-100在VAD组中的表达明显低于ETU组(PGP 9.5的P值=0.0156、S-100的P值=0.0105)和正常对照组(PGP9.5的P值=0.0091、S-100的P值=0.0024), 而ETU组和正常对照组两组之间表达差异无统计学意义(P>0.05);②在无肛畸形胎鼠末端直肠中,PGP9.5和S-100在VAD组中的表达明显低于ETU组(P<0.0001);VAD组和ETU组的无肛胎鼠末端直肠中的表达均显著低于各自的有肛门胎鼠组(VAD组:PGP9.5和S-100的P值均<0.0001;ETU组:PGP 9.5的P值=0.0203、S-100的P值=0.0122).结论 孕期VA缺乏会导致胎鼠ARM的形成,胎鼠末端直肠ENS发育程度与其ARM有关.     

肛门直肠畸形大鼠胚胎后期肠管Cajal间质细胞的研究

目的 研究肛门直肠畸形(ARM)胎鼠胚胎后期16 d(E16)、21d(E21)小肠、结肠和直肠Cajal间质细胞(ICC)的发育情况.方法 体重250～300 g的wistar大鼠,雌雄鼠夜间合笼交配.早晨雌鼠阴道涂片,发现精子被认为是E0.孕鼠随机分成4组,E16对照组孕鼠2只、实验组孕鼠8只,E21对照组孕鼠2只、实验组孕鼠6只.胚胎第10天实验组孕鼠经胃管注入125 mg/kg的ETU,对照组孕鼠经胃管注入等量生理盐水.E16、E21孕鼠腹腔注射10%水合氯醛6 ml/kg,剖宫取出所有胎鼠,辨认胎鼠是否存在畸形及畸形类型.选取对照组胎鼠、实验组无畸形胎鼠和ARM胎鼠,在大体显微镜下解剖整个肠管.选取距盲肠8cm处小肠,距盲肠2咖处结肠,距肛门0.5 cm处直肠各一段.使用c-kit抗体通过SABC免疫组织化学方法研究E16和E2t对照组、实验组乙烯硫脲(ETU)诱导无畸形胎鼠、实验组ETU诱导ARM胎鼠小肠、结肠和直肠c-kit抗体表达情况.结果 E16对照组小肠、结肠、直肠肌间神经从周围可见中等量c-kit抗体染色阳性细胞,肌层部分细胞c-kit抗体染色阳性.E21对照组肌间神经丛周围c-kit抗体染色阳性细胞增多,可见阳性细胞网络形成.E16、E21实验组无畸形胎鼠小肠、结肠、直肠和实验组ARM胎鼠小肠与对照组相比,阳性细胞面积百分比、平均光密度值、积分光密度值和对照组相比,P>0.05,差异无统计学意义.而实验组ARM胎鼠结肠,直肠阳性细胞面积百分比、平均光密度值和积分光密度值明显减小P<0.05,差异有统计学意义.结论 ARM胎鼠胚胎后期小肠ICC发育正常而结肠、直肠ICC发育异常,这可能影响生后肠管ICC网络的形成和功能的发挥,可能是ARM术后便秘的病因之一.