H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒株的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的探讨H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒的拯救并进行鉴定,为新型流感疫苗的研发奠定基础。方法采用脂质体转染的方法,首先依照A型流感病毒A/PR/8/34 HA嵌合片段的设计对H5 2.3.4.4谱系HA和H7亚型的HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合减毒株,对拯救成功的病毒株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定病毒滴度;从中选择H5亚型嵌合减毒株以10~4EID_(50)/50μl的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察、记录小鼠的体重变化及死亡情况,并测定攻毒后第3 d及第6 d小鼠肺脏病毒复制能力。结果成功拯救出2种A/B型嵌合减毒株,分别命名为rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110,测序显示两株嵌合减毒株的序列与预期一致,并在电镜下观察到了流感病毒样粒子。rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110株在MDCK细胞上的病毒滴度均为10^(4.50)TCID_(50)/ml;在鸡胚上的病毒滴度rA/B-H5-NS110为10^(5.25)EID_(50)/ml,rA/B-H7-NS110株为10^(5.44)EID_(50)/ml。小鼠致病性实验中H5亚型嵌合病毒感染组小鼠与对照组相比体重无明显下降,攻毒后小鼠存活率100%;攻毒后第3 d可在小鼠肺脏内检测到嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的轻微复制,第6 d时未检测到病毒复制。结论成功地拯救出2株包含有H5 2.3.4.4谱系HA基因以及H7N9流感病毒HA基因的嵌合减毒株,为B型流感病毒包装机制的研究以及新型流感疫苗的研发提供了新的思路。     

新型冠状病毒重组蛋白疫苗的构建、表达及鉴定

目的 利用毕赤酵母系统表达重组新型冠状病毒受体结构域蛋白RBD,以期作为新冠病毒重组蛋白候选疫苗。方法 选择新型冠状病毒的RBD(受体结合域)蛋白为靶点,通过基因工程技术将RBD基因序列克隆到毕赤氏酵母表达载体pPIC9K中。通过载体将外源基因整合到毕赤酵母染色体上,获得遗传性稳定重组子。毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列,加入甲醇进行诱导,通过前导信号肽引导外源蛋白的分泌表达。结果 成功将RBD基因序列克隆到表达载体中并整合到酵母染色体上,获得遗传性稳定重组子。能通过前导信号肽引导目的蛋白的分泌表达,表达产物免疫动物刺激产生高水平的血清IgG抗体,IgG抗体效价为1∶2.73×10⁶。结论 重组新型冠状病毒受体结构域蛋白RBD的设计具有可行性,为重组蛋白候选疫苗在预防新型冠状病毒感染中具有潜在的应用价值。     

新型冠状病毒M蛋白表达及多克隆抗体制备北大核心CSCD

目的利用原核表达系统表达新型冠状病毒M蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并与M真核质粒免疫效果相比较,为新型冠状病毒感染检测试剂盒的研制奠定基础。方法将酶切鉴定正确的原核重组表达载体PMAT-9s-M转化BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达M蛋白并进行鉴定。M蛋白经镍离子亲和层析柱纯化浓缩后免疫大白兔,制备多克隆抗体。将M真核重组质粒转化至DH5α,碱裂解法大量抽提质粒后免疫大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA检测2种抗血清的抗体效价,采用Western blot检测2种抗血清与M蛋白的反应性。结果PMAT-9s-M转化BL21后表达70 ku的His-MBP-M融合蛋白,且该蛋白主要存在于包涵体中。纯化后免疫大白兔,制备的多克隆抗体血清效价与真核重组质粒免疫制备的抗血清抗体效价均达1︰16000,且2种抗血清均与凝血酶切M蛋白有良好反应性。结论原核表达的M蛋白免疫制备的多克隆抗体特异性强,效价高,且重组M蛋白制备简便、经济高效,为新冠病毒感染诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

表达IL-33蛋白重组狂犬病病毒的构建及鉴定北大核心CSCD

目的以狂犬病病毒(RABV)弱毒株SAD为载体,构建表达IL-33蛋白的重组狂犬病病毒株SAD-IL33。方法利用反向遗传学技术,通过Pfl23Ⅱ和NheⅠ位点经酶切连接,将鼠源IL-33基因ORF区插入狂犬病病毒SAD株的伪基因区,获得全长感染性克隆,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒SAD-IL33,采用RT-PCR、免疫荧光及Western blot鉴定SAD-IL33的生物学特性,并用其感染小鼠,每天观察小鼠体重及精神状态的变化,初步评价其安全性。结果PCR和测序证实,含IL-33基因的感染性克隆SAD-IL33构建成功;经RT-PCR、免疫荧光及Western blot鉴定,重组病毒SAD-IL33可扩增出1065 bp的预期条带,同时有RABV G蛋白和IL-33蛋白的特异性荧光,且分子质量单位为70 ku和30 ku,与预期大小一致;SAD-IL33的细胞适应性良好,在BHK-21细胞和Neuro-2a细胞上均能生长,滴度峰值分别为108.345FFU/ml和109FFU/ml,均高于亲本SAD株。将其在BHK-21细胞上连续传代10次,第3~10代的病毒滴度介于106~108 FFU/ml之间。小鼠感染SAD-IL33后,21 d内体重及精神状态无异常变化。结论成功构建表达IL-33蛋白的重组狂犬病毒SAD-IL33,细胞适应性良好且滴度高,传代稳定,对小鼠无明显影响,为进一步研制安全、高效、廉价的狂犬病预防疫苗奠定了基础。     

新型冠状病毒PLpro的克隆、表达及其对抗病毒天然免疫反应的调节作用北大核心CSCD

目的探讨新型冠状病毒(SARS-CoV-2)木瓜样蛋白酶(PLpro)对Ⅰ型干扰素免疫应答的调节作用。方法基于新型冠状病毒PLpro利用MEGA7.0构建SARS-CoV-2 PLpro进化树,并进行同源性分析;PCR扩增PLpro基因,并克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒pcDNA3.1-PLpro。转染293细胞,采用Western blot和间接免疫荧光试验验证pcDNA3.1-PLpro的表达。通过qRT-PCR分析PLpro对Poly (I:C)刺激下炎性细胞因子mRNA表达的影响;双荧光素酶报告基因试验检测PLpro对IFN-β通路的影响。结果 SARS-CoV-2 PLpro蛋白序列与SARS PLpro相似性为82.7%,与蝙蝠冠状病毒PLpro相似性为96.8%。PCR扩增出PLpro目的基因片段长度为957 bp,与预期相符合,并在293细胞中表达。PLpro抑制IFN-β荧光素酶活性,同时抑制Poly (I:C)刺激引起的IFN-α、IFN-β、IL-6 mRNA表达升高。结论 SARS-CoV-2的PLpro抑制宿主细胞Ⅰ型干扰素免疫应答,为病毒逃逸宿主天然免疫反应提供有利条件。     

新型冠状病毒Nsp16蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备北大核心CSCD

目的原核表达新型冠状病毒Nsp16重组蛋白并制备兔抗Nsp16多克隆抗体。方法通过琼脂糖凝胶电泳对含有Nsp16基因的重组质粒进行双酶切鉴定,并将鉴定后的重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞;通过IPTG诱导重组蛋白的表达,利用镍柱亲和层析法纯化该重组蛋白并进行Western blot鉴定;将鉴定后的目的蛋白与弗氏佐剂以1:1的体积比混匀,乳化后免疫新西兰大白兔,利用ELISA和Western blot分别进行多克隆抗体效价的测定及其特异性鉴定。结果Nsp16基因重组质粒经双酶切后得到912bp的目的片段,重组质粒转化大肠埃希菌表达出分子质量单位为33.3ku的重组蛋白,且主要存在于上清中。用纯化的重组蛋白免疫大白兔,获得兔抗Nsp16特异性多克隆抗体,且其效价达1:409600以上。结论重组Nsp16蛋白可以在大肠埃希菌中正确表达,免疫大白兔后获得高效价抗Nsp16多克隆抗体,即具有免疫反应性。为SARS-CoV-2Nsp16蛋白在新型冠状病毒肺炎中的进一步研究奠定了基础。     

冠状病毒及新型冠状病毒肺炎防控策略

随着科学技术的发展和医学研究不断取得新进步,人们认识到病毒引发的传染性疾病仍然对人类健康构成巨大威胁,据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)宣布,地球上对人类危害最大的有九大病毒:(1)克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus,CCHFV);(2)埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV);(3)马尔堡病毒(Marburg virus,MBV);(4)艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus,HIV);(5)寨卡病毒(Zika virus,ZKV);(6)狂犬病毒(rabies virus,RBV);(7)流感病毒(influenza virus,FLV);(8)尼帕病毒和裂谷热病毒(Nipah virus and riftvelley fever virus,NV-RFV);(9)冠状病毒(coronavirus,CoV),其中包括中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome,MERS)和重症急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)等。特别是EBOV和CoV传播较快,病死率高,造成了严重公共健康危机[1-3]。     

新型冠状病毒RDRP的原核表达、多克隆抗体制备及生物信息学分析北大核心CSCD

目的应用原核表达系统制备重组新型冠状病毒依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRP),纯化后免疫新西兰大白兔获得高效价多克隆抗体,并对RDRP进行生物信息学分析。方法鉴定正确的pET-22b RDRP质粒转化表达载体,诱导表达RDRP蛋白,纯化后免疫大白兔,间接ELISA法检测其多克隆抗体效价。运用Expasy PortParam、SWISS MODEL等生物信息学软件对RDRP蛋白的等电点、分子质量、亲疏水性等理化性质、蛋白的空间结构、跨膜结构域、磷酸化位点、蛋白信号肽进行预测;构建系统进化树,进行亲缘性分析。结果pET-22b RDRP重组质粒酶切鉴定正确,经诱导重组蛋白以包涵体的形式表达,8 mol/L尿素梯度复性后得到纯度高的RDRP蛋白。用纯化蛋白免疫大白兔,间接ELISA检测血清抗体效价>1∶256000,Western blot检测抗体具有良好特异性。经生物信息学分析RDRP蛋白为亲水性,非跨膜蛋白,且无信号肽。11种病毒系统进化树显示,SARS-CoV-2 RDRP蛋白与SARS-CoV RDRP亲缘关系较近。结论成功获得重组SARS-CoV-2 RDRP蛋白,用该蛋白免疫大白兔能刺激产生高效价的多克隆抗体。预测与SARS-CoV RDRP亲缘关系较近,为亲水性非跨膜蛋白,为研究SARS-CoV-2 RDRP蛋白的生物学功能及其疫苗的制备奠定了基础。     

43例新型冠状病毒肺炎患者血清抗体动态检测结果分析北大核心CSCD

目的观察新型冠状病毒肺炎患者血清中特异性抗体在COVID-19病程发展中的动态变化,比较SARS-CoV-2 IgM等5种抗体的阳性率,分析主要抗体水平在病程不同阶段的消长规律。方法采用磁微粒化学发光免疫分析法对COVID-19患者血清中SARS-CoV-2 IgM、SARS-CoV-2 IgG、SARS-CoV-2 IgA和SARS-CoV-2-RBD Ab以及SARS-CoV-2 NAb中和抗体水平进行动态检测和分析。结果在急性期新冠病人筛查中,SARS-CoV-2 IgG、IgM和IgA抗体检测阴性符合率均达100%,阳性率SARS-CoV-2 IgA为32.56%,与SARS-CoV-2 IgG阳性率13.95%比较差异有统计学意义(P<0.05)。COVID-19重症患者的特异性IgG水平在整个病程中均高于普通型和轻型,SARS-CoV-2 NAb中和抗体水平在发病后1个月和3个月时重症患者均高于轻症和普通型患者(均P<0.05);NAb水平轻症与普通型比较差异无统计学意义(P>0.05);RBD抗体水平在不同患者差异无统计学意义(P>0.05)。SARS-CoV-2 NAb在病程不同阶段均与SARS-CoV-2 IgG和SARS-CoV-2 RBD Ab水平呈正相关。结论新冠患者血清5种抗体的消长规律不同,抗体水平与患者病情严重程度有关。采用磁微粒化学发光法检测SARS-CoV-2抗体可作为人群筛查和辅助诊断指标。     

表达SARS-CoV-2的RBD基因及多表位基因重组DNA候选疫苗的构建及小鼠免疫效果评价北大核心CSCD

目的构建针对新型冠状病毒的重组核酸苗,评价其与佐剂联合免疫BALB/c小鼠的效果。方法选择新型冠状病毒S蛋白的受体结合域蛋白基因(RBD)和新冠病毒S、M、N、E 4个结构蛋白的抗原表位基因(EPI)为主要抗原基因,以pVAX1为载体,分别构建pVAX-RBD-EPI质粒和pVAX-RBD质粒。用2种重组质粒和pVAX空载体质粒分别与PIKCA佐剂联合免疫或无佐剂免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,间隔21天免疫,每7 d对小鼠特异性抗体进行检测;对三免后21 d小鼠脾淋巴细胞进行T淋巴细胞亚类检测。结果成功构建了重组质粒pVAX-RBD-EPI和pVAX-RBD。用重组质粒转染BHK细胞,Western blot显示重组核酸质粒稳定表达目的蛋白。BALB/c小鼠免疫结果表明,三免后14d时pVAX-RBD-EPI+PIKCA组IgG抗体水平为无佐剂组的3.65倍(P<0.01)。三免后21 d,pVAX-RBD-EPI+PIKCA组CD3^(+)/CD4;T达到55.71%,是阴性对照组的1.52倍(P<0.01);三免后21 d,CD3^(+)/CD8^(+)T数量pVAX-RBD-EPI+PIKCA组为7.07%,是阴性对照组的1.83倍,是pVAX-RBD-EPI组(5.86%)的1.2倍(P<0.05)。结论成功构建重组DNA候选疫苗pVAX-RBD-EPI和pVAX-RBD-EPI。两种疫苗均具有良好的免疫原性,其中PIKCA免疫佐剂的加入可增强小鼠细胞免疫和体液免疫水平。     

重组H5N1亚型流感病毒铁蛋白纳米粒mRNA疫苗的构建、表达及鉴定北大核心CSCD

目的设计抗H5N1亚型流感病毒的通用型mRNA疫苗,并完成候选疫苗的构建、表达及鉴定。方法设计3组候选疫苗抗原基因,分别命名为Flu、Flu-ferritin和CD5-Flu-ferritin(Flu含H1/H3/H5/B型流感病毒血凝素颈部区保守表位,并串联甲型流感病毒M2e基因中保守序列;Flu-Ferrin在Flu后串联铁蛋白,用以形成多聚体;CD5为分泌型信号肽,将多聚体外泌)。3组基因依次克隆至设计的mRNA疫苗骨架载体上,通过质粒鉴定、线性化处理、体外转录、纯化、及Cap 1加帽处理,分别制备mRNA并转染A549细胞,通过Western blot和IFA方法鉴定目的蛋白的表达。结果成功构建3组mRNA候选疫苗,并在A549细胞上表达抗原蛋白。结论证明了抗原设计的可行性,为开展动物试验奠定了基础。     

新型冠状病毒肺炎药物治疗的研究进展

2019年12月,中国以湖北省武汉市为中心暴发了一场新型冠状病毒导致的肺炎疫情,称为新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)疫情。截至2020年3月1日24时,据我国31个省(自治区、直辖市)和新疆生产建设兵团报告,累计确诊病例80 026例,中国港澳台地区确诊148例。目前,COVID-19无特效抗病毒药物或疫苗,治疗药物的选择主要是基于既往严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征及其他一些流感病毒的治疗经验。瑞德西韦、氯喹、法匹拉韦、恢复期血浆在临床上初见疗效,但其安全性和疗效,还须要大样本量进一步验证。利巴韦林、洛匹那韦/利托那韦、干扰素-α、阿比多尔联合应用,应注意其不良反应,慎重选择。达鲁那韦目前还停留在体外实验阶段,中医辩证治疗还须进一步验证。本文围绕目前临床上治疗COVID-19药物的研究进展进行综述,为COVID-19治疗提供参考。     

新型冠状病毒相关自发性脾破裂的诊治

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的主要经呼吸道传播的急性病毒性疾病,其不仅侵袭人体呼吸系统,还损伤人体多个器官系统。现已有证据显示SARS-CoV-2与自发性脾破裂之间可能存在因果联系,本文认识到SARS-CoV-2相关性自发性脾破裂发生的可能性,并探讨其发生机制和诊治方案,避免临床上对其漏诊误诊。     

新型冠状病毒肺炎35例流行病学及临床特征分析

目的探讨聊城市2019年冠状病毒(SARS-COV-2)感染肺炎患者的流行病学特点、临床表现、实验室检查、影像学表现。方法收集2020年1月28日到2020年2月24日在山东省聊城市传染病医院收治的经SARS-CoV-2核酸检测确诊的35例2019年新型冠状病毒感染肺炎(COVID-19)患者,收集患者流行病学情况、年龄、发病时间、首发症状、血常规、淋巴细胞计数、降钙素原(PCT)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、C反应蛋白(CRP)及胸部CT表现等信息并进行分析。结果 35例患者中11%与武汉市或湖北其他地区具有明确接触史,77%无明确暴露史;83%为聚集性发病,17%为输入性病例;中位就诊时间为5(0.00～8.00)天,43%患者具有基础疾病;71%患者初始症状为发热,60%初始症状为咳嗽,14.3%初始可无任何症状;实验室检查中94.3%的患者白细胞正常及下降,45.7%患者淋巴细胞计数可下降,74.3%和45.7%患者SAA和CRP可升高,14.3%患者PCT正常;91.4%患者初次核酸检测为阳性,91.4%患者胸部CT表现为单肺或双肺多发磨玻璃样病灶;入组患者91.4%为普通型,治疗上均给予给予α-干扰素雾化吸入联合洛匹那韦及利托那韦治疗,71.4%给予了抗菌药物治疗,14.3%使用激素进行治疗;所有患者病情好转,22例患者治愈出院。结论 SARS-COV-2具有传染性强,家庭聚集性感染可能是本市的主要播散方式,普通型多见,实验室检查无特异性改变,治疗后均病情稳定。     

新型冠状病毒肺炎合并心血管疾病的临床问题探讨

2019年底新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎)在湖北省武汉市暴发流行,波及全国。截至2月22日全国累计确诊76392例新冠肺炎,死亡2348例。新冠肺炎成为了严重威胁公众健康的传染性疾病。研究报道新型冠状病毒对心脏损伤有潜在影响,来自武汉临床资料分析发现,138例新冠肺炎患者中7.2%发生急性心脏损伤,16.7%发生心律失常;此外还发现心肌损伤标志物超敏肌钙蛋白I的水平重症监护病房(intensive care anit,ICU)患者高于非ICU患者[1]。另外,新近的两项研究也发现新冠肺炎患者均有不同比例的心脏损伤,表现为心肌损伤标志物的升高或心电图和超声心动图出现新的异常。而对于已有心血管疾病的患者并发症和死亡风险都明显增加。7万余新冠肺炎患者的流行病学研究显示[2],合并心血管疾病患者死亡率高达10.5%,糖尿病为7.3%,慢性阻塞性肺病为6.3%,癌症为5.6%。因此,新型冠状病毒导致的心脏损伤以及对合并心血管疾病患者的预后值得关注。     

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)变异的研究进展

2019年12月底,湖北省武汉市暴发了由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎疫情.迄今为止,该病毒引起的疫情仍在全球流行,累计感染人数超1.8亿.随着SARS-CoV-2在人群间的不断传播,其基因组不断发生变异,从SARS-CoV-2首次出现S蛋白D614G突变到被世界卫生组织列为关切的Alpha、Beta、...     

新型冠状病毒基因组分析及相关临床应用进展

2019年12月以来,新型冠状病毒(2019-nCoV)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)传染性极强,对全球公众健康构成了巨大威胁,引起世界各国极大关注。面对这场突如其来的重大公共卫生事件,中国医学界反应迅速,率先发现其基因序列,并提供给国际化数据共享,为诊断治疗奠定了基础。目前,全球的科研人员已获得多个2019-nCoV基因组序列,并进行了多项相关研究。本文简要综述2019-nCoV的特征、系统进化及致病机制,介绍其实验室诊断技术、疫苗及药物的相关最新研究进展,以期为战胜新型冠状病毒肺炎疫情奠定基础。     

新型冠状病毒感染者血清中和抗体检测及临床意义

目的 观察新型冠状病毒感染(COVID-19)患者血清抗SARS-CoV-2中和抗体水平的变化规律,为临床判断COVID-19患者的疾病进展及预后提供依据。方法 选取2020年2月至2021年3月在石家庄市第五医院进行隔离治疗的COVID-19患者172例,分别收集患者感染早期(第1～7天)、中期(第8～14天)、后期(第15～21天)、恢复期(第22～41天)的血清样本,采用磁微粒化学发光免疫分析法检测抗SARS-CoV-2中和抗体。结果 随着COVID-19患者病程进展中和抗体的阳性率逐渐升高,在感染后期达到峰值(90%以上感染者产生了中和抗体);中和抗体水平与感染天数之间有显著性相关(R=0.35,P <0.001);在感染早期,COVID-19无症状感染者血清中和抗体的阳性率及抗体水平均高于轻型、中型、重型患者,差异有统计学意义(P <0.05);感染后期和恢复期的患者,其中和抗体的阳性率及抗体水平随着病情的严重程度逐渐增加,差异有统计学意义(P <0.001)。在感染早期,<60岁组患者的血清中和抗体的阳性率及抗体水平均显著高于≥60岁组(P <...