调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响。 方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定CIAPIN1基因高表达和低表达的细胞。实验分为CIAPIN1表达组、CIAPIN1 siRNA组、无关siRNA对照组和空白对照组。采用RT-PCR和蛋白质印迹法分析CIAPIN1基因和蛋白的表达,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化, Boyden小室检测细胞侵袭转移。 结果 与空白对照组、无关siRNA对照组和CIAPIN1 siRNA组比较,CIAPIN1高表达组细胞生长受到抑制(P<0.05);S和G₂/M期细胞比例减少,G₀/G₁期细胞比例增加(P<0.05);平均细胞凋亡率增加(P<0.05),穿透Matrigel的平均细胞数减少(P<0.05)。 结论 以慢病毒为载体介导的CIAPIN1基因高表达可有效抑制食管癌EC9706细胞增殖、促进细胞凋亡和降低细胞侵袭迁移能力。     

慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞.方法:构建CEA siRNA载体:依据siRNA靶序列设计原则,针对人CEA的cDNA序列,设计并合成编码siRNA的3对寡核苷酸序列,克隆入siRNA载体(pRNAT-U6.2/Lenti)中构建3个重组体pRNAT-U6.2-SCEA.构建CEA表达载体:以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.然后进行重组慢病毒分剐感染EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株.分别用荧光定量Real-time RT-PCR和Western blot检测EC9706细胞中CEA基因表达抑制或增强的效果.结果:EC9706病毒感染48 h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达.经过RTPCR和Western-blot验证:得到3株稳定CEA低表达的EC9706细胞株,其中一个CEA的表达几乎得到完全抑制,1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA).结论:建立了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞株,成功调控食管癌EC9706细胞中CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

慢病毒介导shRNA沉默HDAC1表达对EC109细胞生长特性的影响

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,有效沉默食管癌细胞株EC109的HDAC1表达并观察其对细胞生长的影响。方法以HDAC1为靶基因,合成寡核苷酸,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCSIL-PUR载体连接获得重组慢病毒载体;将其与病毒复制包装质粒共感染293T细胞,收集并浓缩上清液获得重组病毒,测定病毒滴度;病毒颗粒转染EC109细胞,通过荧光显微镜等观察转染效率并经有限稀释法获得单克隆来源的细胞系;定量PCR及Western blot检测HDAC1的表达;并观察EC109细胞的生长特性。结果成功构建干扰HDAC1表达的慢病毒载体pGCSIL-SiHDAC1,并在293T细胞中包装获得病毒。重组病毒感染EC109细胞后,HDAC1mRNA和蛋白水平检测显示干扰组细胞的HDAC1的表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。HDAC1下调的EC109细胞的增殖能力明显下降(P<0.05)。结论慢病毒介导的shRNA能有效的沉默食管癌细胞EC109中的HDAC1的表达,并且能抑制其细胞的增殖。     

CEA siRNA载体的构建和转染人食管癌EC9706细胞的沉默作用

目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

硒蛋氨酸对食管癌细胞株环氧合酶-2表达影响

目的:探讨硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。方法:采用MTT比色法、细胞生长曲线描绘观察硒蛋氨酸对食管癌细胞系EC9706增殖的影响,琼脂糖凝胶电泳法检测DNA ladder,细胞免疫化学方法检测EC9706COX-2的表达。结果:硒蛋氨酸呈时间、剂量依赖性方式抑制EC9706细胞增殖,抑制食管癌细胞系EC9706COX-2的表达,诱导细胞凋亡。结论:硒蛋氨酸可能通过抑制食管癌细胞系EC9706COX-2的表达从而抑制EC9706细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

RASSF1A基因对食管癌细胞EC9706凋亡影响的研究

目的 观察外源性RASSF1A基因诱导食管癌细胞EC9706凋亡作用并探讨机制.方法 将包含RASSF1A基因的质粒pcDNA3.1(+)转染人食管癌细胞EC9706,建立稳定表达细胞系,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、原位末端标记(TUNEL)、透射电子显微镜观察细胞形态研究RASSF1A对食管癌细胞生长的影响.结果 建立稳定高表达RASSF1A基因的EC9706细胞系,高表达RASSF1A的细胞较转染空载体和未经转染细胞RASSF1A蛋白表达增加;细胞生长速度明显减慢(P<0.001);TUNEL与透射电镜均观光到细胞生长有明显的凋亡特征性改变(P<0.001).结论 RASSF1A基因的外源性表达能显著抑制食管癌细胞在体内外的生长,其机制可能与该基因诱导凋亡、抑制增殖作用有关.     

RNAi沉默polβ基因部分逆转食管鳞癌细胞顺铂耐药性

目的 通过RNA干扰（RNAi）技术沉默DNA聚合酶polβ的表达,观察其对食管癌细胞顺铂（cDDP）耐药性的影响。方法 构建靶向polβ基因的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2及阴性对照载体pRNAT-U6.2/Lenti-polβC,将其感染人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706/cDDP,通过RT-PCR、蛋白质印迹分析和免疫荧光实验观察细胞polβ的表达情况,采用MTT法观察不同浓度顺铂对细胞生长的抑制作用并计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度（IC₅₀）和耐药指数（RI）。结果 靶向polβ的siRNA重组慢病毒pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1和pRNAT-U6.2/Lenti-polβ2感染EC9706/cDDP后均可下调polβ的mRNA和蛋白表达水平,其中前者效果更为显著。顺铂以剂量依赖方式抑制EC9706/cDDP细胞增殖,感染pRNAT-U6.2/Lenti-polβ1、pRNAT-U6.2/Lenti-polβC的EC9706/cDDP细胞及未感染EC9706/cDDP细胞对顺铂的IC₅₀分别为55.71、62.41、63.11 μg/mL,耐药指数分别为13.9、15.5、15.7,其中前者与后二者相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论 polβ的表达与食管鳞癌细胞系EC9706/cDDP顺铂耐药性有关,沉默其表达可部分逆转EC9706/cDDP细胞对顺铂的耐药性。     

低剂量辐射联合pEgr-P16基因治疗诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的:研究大剂量(2Gy)和低剂量(0.075Gy)X射线诱导pEgr P16重组质粒稳定转染的食管癌细胞株EC9706凋亡的作用。方法:将脂质体包裹的pEgr P16重组质粒,转染食管癌细胞系EC9706中,经G418筛选,获得稳定表达的细胞;采用Westernblot方法检测不同剂量X射线诱导后P16的表达;观察不同剂量X射线照射后,EC9706细胞凋亡率的变化。结果:pEgr P16重组质粒转染EC9706细胞,并获得稳定转染的细胞;2Gy和0.075GyX射线照射均可诱导P16表达增强;稳定转染的细胞经2Gy和0.075GyX射线照射,细胞凋亡率明显高于假照射(0Gy)组(P<0.05～0.01)。结论:0.075GyX射线照射可诱导稳定转染的EC9706细胞中P16表达增强,使诱导细胞凋亡率提高。     

靶向GST-π、po1β基因的siRNA重组慢病毒对人食管鳞癌顺铂耐药逆转的体内实验研究

目的探讨靶向GST-π、polβ的siRNA重组慢病毒在裸鼠体内对人食管鳞癌顺铂耐药株耐药的逆转作用。方法采用皮下注射细胞法建立裸鼠人食管癌细胞细胞EC9706及其耐药细胞EC9706/cDDP移植瘤模型,观察其成瘤性和体内耐药性。利用靶向GST-π、polβ的siRNA重组慢病毒感染具有 MDR表型的裸鼠移植瘤,以期达到封闭GST-π、polβ的转录和表达,检测移植瘤细胞对药物的敏感性变化。结果 cDDP 联合靶向GST-π的siRNA慢病毒GSTsi2处理组中观察到移植瘤体积与cDDP组及PBS对照组比较,体积显著减小,表明经cDDP联合GSTsi2处理后,可明显恢复移植瘤细胞对 cDDP的敏感性。而在cDDP联合靶向polβ的siRNA慢病毒polsi1处理组中移植瘤体积与cDDP及PBS对照组比较无显著差异,移植瘤细胞对cDDP的敏感性无明显改变。结论靶向GST-π的重组慢病毒可有效逆转食管癌细胞的耐药性,靶向polβ的重组慢病毒逆转肿瘤细胞耐药的效果不明显。     

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶在真核细胞中的表达

目的:分别构建杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶(DsGPI)绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。方法:PCR扩增得到上、下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的DsGPI基因,双酶切后与绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1连接,得到重组载体pEGFP-C1-DsGPI,转染狗肾细胞MDCK,观察绿色荧光蛋白在细胞中的定位;同理将上、下游分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DsGPI基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,得到pcDNA3.1-DsGPI,转染食管癌EC9706细胞,分别应用RT-PCR法和Westernblot法检测DsGPI mRNA和蛋白的表达。结果:DsGPI在MDCK细胞中定位于细胞核,在EC9706细胞中被有效表达。结论:成功构建了DsGPI的绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。     

姜黄素抑制耐紫杉醇食管癌细胞的上皮间质转化作用及机制探讨

目的 建立耐紫杉醇食管癌(EC)细胞系EC9706/PTX,观察姜黄素对EC9706/PTX细胞上皮间质转化(EMT)的抑制作用并探讨其机制,为耐药EC的治疗提供理论依据.方法 用中等浓度间歇作用法建立耐紫杉醇EC细胞EC9706/PTX,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞耐药指数及交叉耐药性,检测不同浓度姜黄素对EC9706/PTX细胞增殖的抑制.使用细胞骨架染色、划痕实验、Transwell侵袭实验检测姜黄素对EC9706/PTX细胞形态变化、迁移和侵袭能力的影响.荧光定量PCR及蛋白免疫印迹(Western blot)检测姜黄素对EC9706/PTX细胞中EMT相关分子标志物E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白在mRNA和蛋白水平的表达影响.Western blot检测姜黄素对EC9706/PTX细胞中转录因子NF-κB p65及Snail在蛋白水平的表达影响.结果 EC9706/PTX对紫杉醇的耐药指数为28.4,对顺铂、阿霉素产生交叉耐药性,姜黄素能够抑制EC9706/PTX细胞的增殖.在20 μmol/L浓度的姜黄素作用下,EC9706/PTX细胞的迁移和侵袭能力明显降低.荧光定量PCR及West-ern blot检测显示,细胞耐药后E-钙黏蛋白的表达明显下调,而N-钙黏蛋白表达则明显上调,姜黄素逆转了这一现象.Westernblot检测提示,EC细胞发生耐药及EMT后,NF-κB p65及Snail蛋白的表达增强,姜黄素阻断了这一作用.结论 姜黄素能够抑制紫杉醇耐药EC细胞的增殖并且能够逆转紫杉醇耐药EC细胞的EMT现象,其机制可能是通过抑制NF-κB-Snail信号通路实现的.     

银杏叶提取物通过JAK2/STAT3信号通路调控食管癌细胞EC9706增殖、凋亡、侵袭、迁移的研究

目的 探讨银杏叶提取物对食管癌细胞EC9706增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响及机制。方法 食管癌细胞EC9706分为对照组（不做任何处理）、不同浓度银杏叶提取物组（100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L银杏叶提取物）、银杏叶提取物+白细胞介素-6(IL-6)组（20 ng/ml IL-6和400 mg/L银杏叶提取物）。采用CCK-8法检测各组细胞的光密度（OD）值;采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;Transwell实验检测各组细胞的迁移和侵袭;Western blotting检测细胞增殖核抗原Ki-67、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase-3)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导和转录激活因子3(p-STAT3)蛋白相对表达量。结果 对照组,100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L银杏叶提取物组,银杏叶提取物+IL-6组细胞OD值比较,差异有统计学意义（P <0.05）;与对照组相比,不同浓度银杏叶提取物组EC9706细胞OD值均降低（P ...     

RNAi干扰食管癌EC9706细胞MTA1基因表达对侵袭和迁移的影响

目的 采用RNAi抑制食管癌EC9706细胞株MTA1基因的表达,观察对食管癌细胞侵袭和迁移的影响.方法 用脂质体包裹转染沉默MTA1表达的siRNA表达载体人食管癌细胞EC9706.定量RT-PCR和免疫印迹分别检测MTAl mRNA和蛋白表达情况;划痕损伤实验和细胞体外侵袭实验分别测定迁移和侵袭的影响.结果 定量RT-PCR检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低;转染沉默MTA1的siRNA表达载体组的食管癌细胞划痕未愈合,穿透Matrigel的细胞数量明显减少,与未转染组、转染空载体组和转染无关序列siRNA载体组比较差异有显著性(P<0.05).结论 RNA干扰介导的MTA1基因表达沉寂可有效降低食管癌细胞侵袭和迁移;MTA1基因可能成为肿瘤治疗上有前途的分子靶点.     

PTPN14对食管癌的抑制作用及其机制研究

目的探讨蛋白酪氨酸磷酸酶14（PTPN14）对食管癌的抑癌作用及其机制。方法通过转染PTPN14质粒过表达食管癌细胞EC9706 中PTPN14 的表达,实时荧光定量聚合酶链反应及Western blot检测其过表达效果;四甲基偶氮唑盐比色法检测过表达PTPN14对EC9706细胞增殖的影响;流式细胞术检测过表达PTPN14对EC9706 细胞周期的影响;Western blot检测过表达PTPN14 对YAP 蛋白表达的影响。结果转染PTPN14质粒可上调食管癌细胞系EC9706 中PTPN14 的表达;过表达EC9706 细胞中PTPN14 可以抑制食管癌细胞的增殖,使细胞周期阻滞在G1期;过表达EC9706 中PTPN14 可以下调细胞中YAP的表达水平。结论PTPN14可通过下调YAP,阻滞食管癌细胞周期,抑制细胞增殖。     

叶黄素对人食管鳞癌细胞诱导分化效应与机制探讨

目的 探讨叶黄素对食管癌EC9706 细胞诱导分化的影响及其机制.方法 食管癌EC9706细胞采用开放式单层贴壁培养.实验设溶剂对照及叶黄素3个剂量组,采用MTT法及流式细胞术,对EC9706 细胞的增殖和细胞周期进行分析,HE染色对细胞的形态学进行观察,酸解DNA甲绿-派洛宁技术了解增殖与分化型细胞比例,免疫组化检测cyclin D1的表达.结果 与溶剂对照组比较,叶黄素(100 μg/mL和150 μg/mL)可明显抑制EC9706 细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期, 降低细胞增殖指数,细胞形态趋向良性分化,cyclin D1 表达水平降低.结论 叶黄素可通过抑制cyclin D1 表达而介导食管癌EC9706细胞增殖抑制和诱导成熟分化.     

上调stathmin基因表达对食管鳞癌EC9706细胞的作用

目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25～28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点.     

佛波酯对食管癌EC9706细胞NDRG_1表达及细胞增殖影响的研究

目的:探讨12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)作用于食管癌细胞EC9706后,对NDRG1mRNA表达、细胞增殖、细胞周期的影响。方法:采用50nmol/L的TPA作用于EC9706细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期的变化,原位杂交法检测NDRG1mRNA水平。结果:TPA能上调NDRG1mRNA水平,抑制EC9706细胞增殖,细胞周期发生G1→S期阻滞。结论:TPA可能通过上调NDRG1mRNA的表达而抑制EC9706增殖,促进其分化。     

吡咯烷二硫代氨基甲酸对食管癌细胞系EC1增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的:观察吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)对食管癌细胞系EC1增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法:用不同剂量PDTC(1、5、10、50、100 μmol/L)处理EC1细胞24、48和72 h后,MTT法观察细胞增殖情况,计算细胞增殖抑制率.用不同剂量PDTC(0、5、10、50、100 μmol/L)处理EC1细胞48 h后,测定细胞凋亡率和细胞周期.结果:PDTC可剂量依赖性和时间依赖性地抑制EC1细胞的增殖(F剂量=8.950,P=0.005;F时间=30.718,P<0.001;F交互=60.504,P<0.001).不同剂量PDTC作用48 h后,随着PDTC剂量的增加,EC1细胞凋亡率增加(F=7.020,P=0.001),G0/G1期细胞比例降低(F=771.064,P<0.001),G2/M和S期细胞比例增加(F=963.002、309.332,P均<0.001).结论:PDTC可以抑制食管癌细胞系EC1的增殖,诱导其发生凋亡,并将其阻滞在S期.     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。