应用表达载体介导siRNA抑制乳腺癌细胞MCF-7 血管内皮生长因子-C基因的表达

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌细胞系MCF-7血管内皮生长因子-C(VEGF-C)表达的抑制作用. 方法 设计合成一对编码后可形成小发夹结构针对VEGF-C基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建VEGF-CsiRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染MCF-7细胞,半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测转染前后MCF-7细胞VEGF-C基因表达的变化. 结果 PCR和DNA测序证实,携带VEGF-CsiRNA表达载体构建成功,VEGF-C基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P<0.05),在mRNA水平其表达抑制率为61.8%;在蛋白表达水平其表达抑制率为78.3%. 结论 本研究构建的VEGF-CsiRNA表达载体可有效抑制MCF-7细胞VEGF-C的mRNA和蛋白表达,为进一步以VEGF-C为靶点的乳腺癌治疗实验研究奠定了基础.     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的 克隆人生长抑制因子家族(inhibitor of growth famility member4,ING4)基因,构建其真核表达载体pEGFP-ING4.方法 提取人胎盘总RNA,经RT-PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP-C2载体,构建的真核表达载体pEGFP-ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的 蛋白融合表达.结论 从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究ING4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础.     

过表达人细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)促进MCF-7乳腺癌细胞生长及S期细胞增加

目的构建带FLAG标签的细胞S期激酶相关蛋白2(Skp2)基因真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2并检测其对MCF-7乳腺癌细胞生长及细胞周期的影响。方法采用反转录PCR从MDA-MB-231乳腺癌细胞中扩增Skp2基因,构建重组真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。酶切及测序鉴定重组质粒正确后,脂质体介导转染至MCF-7乳腺癌细胞中。采用Western blot法检测FLAG-Skp2的表达,Alamar blue比色法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,测序结果与Gen Bank结果一致。Western blot结果显示质粒转染48 h后,细胞成功表达融合蛋白FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7乳腺癌细胞较对照组生长速度明显加快,S期细胞显著增多。结论成功构建人Skp2真核表达载体pc DNA3-FLAG-Skp2。过表达Skp2的MCF-7细胞生长加快,S期细胞增多。     

GFP-hERα重组质粒的构建及蛋白表达和细胞内定位的研究

目的 构建hERα真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位.方法 以pcDNA3.1-flaghERα仅重组质粒(Dr.Muyan M馈赠)为模板,PCR扩增hER α全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体.将构建的重组质粒测序并转染到乳腺癌细胞MCF-7中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利...     

TrKA-siRNA抑制乳腺癌细胞系MCF-7 NF-κB的表达并促细胞凋亡

目的 探讨TrKA基因表达的变化对NF-κBp65核蛋白的表达和细胞凋亡的影响。方法 构建TrKA特异小干扰RNA（siRNA）表达载体,重组体经测序鉴定正确后转染乳腺癌MCF-7细胞。G418(geneticin)筛选稳定表达TrKA siRNA干扰细胞株,命名为TrKA-siRNA。荧光实时定量RT-PCR,Western blot和免疫组化法检测TrKA基因的表达,Western blot检测NF-κBp65核蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果 成功构建 TrKA-siRNA 表达载体,TrKA mRNA和蛋白水平分别下调74.7%和80.5%（P<0.05）。阳性对照 GAPDH 基因表达水平下降85.0%（p<0.05）;NGF作用2 h后,MCF-7组细胞NF-κBp65核蛋白表达明显增加,而TrKA-siRNA组细胞NF-κBp65核蛋白改变不显著。与MCF-7组相比,TrKA- siRNA组细胞凋亡明显增加（p<0.05）,NGF对其凋亡无促进作用。结论 有效阻断TrKA基因的表达能抑制NF-κB抗凋亡途径的活化,从而增加了乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。此作用可能不依赖于外源性的NGF。     

RNA干扰沉默缺氧诱导因子-1α逆转乳腺癌的耐药性

目的观察RNA干扰缺氧诱导因子（HIF）-1α逆转乳腺癌耐药性的作用.方法构建靶向缺氧诱导因子-1α的短发夹状小干扰RNA基因并转染到人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADR中.常规MTY法检测细胞存活率,外排实验检测细胞的P-糖蛋白转运功能,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因1（mdr-1）mRNA变化,Western印迹法观察干扰前后HIF-1α、P-糖蛋白的变化.结果测序证实成功构建HIF-1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer-HIF,转染空质粒ADR/neo不影响肿瘤细胞的耐药性.MTT法检测ADR/shRNA组细胞存活率由76%下降到43%,Rh123荧光强度由22.0%升为86.6%,ADR/shRNA组中HIF-1α、mdr-1mRNA、蛋白水平显著降低（P＜0.05）,且Spearman相关分析HIF-1α和mdr-1指数在三组中显示呈正相关（r=0.816,P＜0.01）.结论成功构建了HIF-1α的短发夹状siRNA真核表达载体pSilencer-HIF,可显著降低乳腺癌MCF-7/ADR细胞中HIF-1α表达从而起到逆转肿瘤耐药的作用.     

ADAM10真核表达载体的构建及其对MCF-7增殖迁移的影响

目的构建ADAM10真核表达载体,观察稳定转染乳腺癌细胞MCF-7后对其增殖和迁移的影响。方法利用PCR技术扩增人ADAM10的基因片段,克隆入pcDNA3.1真核表达载体,阳性克隆通过PCR、酶切和测序鉴定。脂质体法将重组质粒转染MCF-7细胞,通过G418筛选出稳定转染ADAM10的细胞株,通过Western blot检测细胞ADAM10的表达,通过MTT法和Transwell法分别检测细胞的增殖和迁移变化。结果经PCR、酶切和测序鉴定证明ADAM10真核表达载体构建成功,Western blot结果显示稳定转染细胞的ADAM10蛋白高表达,MTT实验显示转染细胞增殖速度稍快于对照(P<0.05),Transwell结果显示转染细胞迁移能力比对照强(P<0.01)。结论成功构建ADAM10真核表达载体,稳定转染MCF-7细胞后可增强细胞的增殖和迁移,为进一步研究ADAM10生物学作用奠定基础。     

hLMO4基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建hLMO4真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法提取人乳腺癌MCF-7细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hLMO4全长编码基因,亚克隆至pCDNA3.1-myc-hisA表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞BGC823中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位。结果hLMO4全长基因序列克隆到了真核表达载体pCDNA3.1-myc-hisA中,酶切鉴定片段为500bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为23KD。pEGFP-LMO4在乳腺癌MCF-7细胞内定位以细胞核为主,在细胞浆内少量表达。结论成功的构建了hLMO4全长基因真核表达载体,pEGFP-LMO4蛋白定位于乳腺癌细胞质和核内。     

pcDNA3-HIF-1α真核表达质粒的构建及其在MCF-7细胞中的表达

目的构建低氧诱导因子1α(H IF-1α)真核表达质粒,并在MCF-7细胞中进行功能验证。方法利用RT-PCR扩增带有XbaⅠ和H indⅢ酶切位点的H IF-1α编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pcDNA3真核表达载体,然后将其转染MCF-7细胞。W estern b lot和双荧光素酶报告基因法分别检测H IF-1α表达及其DNA结合活性;实时定量PCR检测H IF-1α对低氧诱导基因C-METmRNA表达的影响;Caspase3/7活性检测来初步判断H IF-1α对低氧MCF-7细胞凋亡的影响。结果酶切及测序结果证明pcDNA3-H IF-1α表达质粒的DNA序列完全正确。将此质粒转染MCF-7细胞后,H IF-1α蛋白表达明显增加,它不仅增强了pGL3-EPO-HRE报告基因活性而且促进了C-METmRNA的表达,同时还降低了低氧MCF-7细胞中Caspase3/7的水平。结论pcDNA3-H IF-1α真核表达质粒构建成功,它不但具有很强的DNA结合和诱导活性,而且在细胞低氧过程中具有一定的抗凋亡作用。     

HDAC1调控Wnt/β-catenin信号通路对乳腺癌细胞凋亡的影响

目的:研究组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)对乳腺癌细胞凋亡的影响及机制。方法:RT-qPCR和Western blot法分别测定正常乳腺上皮细胞系MCF-10A和乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平。在MDA-MB-231细胞中转染HDAC1 si RNA,RT-qPCR和Western blot测定HDAC1的表达水平,MTT法测定细胞活力,流式细胞术测定凋亡,Western blot测定细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、c-Myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和cleaved caspase-3的蛋白水平。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理下调HDAC1表达后的乳腺癌细胞,测定细胞活力和凋亡。结果:乳腺癌细胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的m RNA和蛋白水平均明显高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(P 0. 01),并且MDA-MB-231细胞中的HDAC1水平最高。HDAC1 si RNA可以降低乳腺癌细胞中HDAC1的m RNA和蛋白水平。敲减HDAC1表达后的MDA-MB-231细胞活力降低,细胞凋亡率升高,细胞中cleaved caspase-3水平升高,β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平降低(P 0. 05)。Wnt/β-catenin信号通路激活剂可以逆转HDAC1下调诱导的MDA-MB-231细胞凋亡和细胞活力降低,减少cleaved caspase-3的水平(P 0. 05)。结论:敲减HDAC1的表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活诱导乳腺癌细胞凋亡。     

IGFBP7对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其机制

目的: 探究胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及其分子生物学机制。方法: 将质粒pCMV6-IGFBP7转染MCF-7细胞,构建稳定表达IGFBP7的MCF-7细胞系;采用Western blotting检测IGFBP7在MCF-7细胞稳定转染子的表达;采用软琼脂培养克隆形成实验检测IGFBP7对MCF-7细胞克隆形成能力的影响;采用流式细胞术检测IGFBP7对MCF-7细胞周期的影响;采用Western blotting检测IGFBP7对MCF-7细胞细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、p-ERK1/2、细胞周期素D1(cyclin D1)、细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)、cyclin E、CDK2、p21^CIP1/WAF1、p27^KIP1、p53、视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)和p-Rb蛋白含量的影响。结果: (1)只有稳定转染质粒pCMV6-IGFBP7的MCF-7细胞表达IGFBP7。(2)IGFBP7能够显著降低MCF-7细胞的克隆形成率(P<0.01),阻止细胞从G₁期进入S 期,使其停滞于G₁期(P<0.01)。(3)IGFBP7能够显著抑制ERK1/2的磷酸化(P<0.01)。(4)IGFBP7能够下调cyclin D1和cyclin E蛋白表达(P<0.01),上调p27^KIP1、p21^CIP1/WAF1和p53蛋白表达(P<0.01),抑制Rb的磷酸化(P<0.01)。(5)MEK1/2阻断剂PD98059可部分模拟IGFBP7的肿瘤抑制效应。结论: (1) IGFBP7可通过下调cyclin D1和cyclin E蛋白表达,上调p27^KIP1、p21^CIP1/WAF1和p53蛋白表达,以及抑制Rb磷酸化发挥抗肿瘤作用;(2) IGFBP7对cyclin D1和p27^KIP1的调节可能与其抑制ERK1/2信号通路有关。     

BCSG1-siRNA在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达

目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)对人乳腺癌移植瘤组织中乳腺癌特异性基因BCSG1表达的抑制作用.方法 根据BCSG1的已知cDNA序列,设计并体外转录合成4条特异性siRNA,分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染人乳腺癌细胞系MCF7细胞中,以无关序列转染和未转染的MCF7细胞为对照.将用上述4条特异性siRNA和无关序列转染后的细胞连同未转染的MCF7细胞(共6组细胞)注入裸鼠皮下,构建裸鼠乳腺癌移植瘤模型,分析肿瘤生长抑制情况.采用半定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学SP法分别检测6组裸鼠移植瘤中BCSG1 mRNA和BCSG1蛋白的表达情况.3组人肿瘤组织(浸润性导管癌、癌旁乳腺导管增生组织和乳腺纤维腺瘤)同时用作对照.结果 BCSG1-siRNA转染的4组的抑瘤率均明显大于无关序列转染组及未转染对照组(P＜0.01);与无关序列转染组及未转染对照组相比,BCSG1-siRNA转染的4组肿瘤组织中BCSG1蛋白的表达明显减弱;未转染细胞对照组和无关序列转染组、人乳腺浸润性导管癌组均有大量BCSG1 mRNA阳性条带,而在BCSG1-siRNA转染的4组中,仅有少量BCSG1较弱的mRNA阳性条带,与未转染细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 BCSG1-siRNA能有效抑制肿瘤的生长,下调裸鼠乳腺癌组织中BCSG1蛋白及mRNA的表达.     

下调VEGF基因表达对乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用

目的利用RNA干扰技术特异性抑制乳腺癌细胞MCF-7的VEGF基因表达,研究乳腺癌的治疗新方法.方法体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段,转录针对VEGF mRNA的siRNA,使用脂质体转染的方法导入细胞,观察转染后乳腺癌细胞MCF-7的增殖变化,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA检测蛋白表达的下降效果.结果所设计的两个靶位点siRNA能有效抑制乳腺癌细胞生长;VEGF mRNA的表达也受到有效抑制,明显减少;同时,对应的VEGF蛋白水平也显著降低.阴性对照的错义序列组siRNA则没有这种效果.结论应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤细胞的增殖.     

Effects of targeted nano-delivery systems combined with hTERT-siRNA and Bmi-1-siRNA on MCF-7 cells

The aim of this study was to evaluate the efficiency of a targeted siRNA nano-delivery system to silence the expression of Bmi-1 and hTERT, and to verify the toxicity of this delivery system in MCF-7 breast cancer cells. The most effective Bmi-1 siRNA and hTERT siRNA sequences were selected using RT-PCR and Western blotting. The polyethyleneimine (PEI)/siRNA nano-condensate was synthesized using PEI and modified using an NGR peptide fragment for targeting to tumor cells. The vector morphology, particle size and zeta potential were observed using an atomic force microscope and a laser particle size analyzer. The MCF-7 breast cancer cell line was transfected with the vector, and cytotoxicity was tested by MTT assays. The transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR and Western blotting. Changes in gene expression and apoptosis rate were measured by flow cytometry. The size of LPN carrier and the condensate particle was between 100 and 200 nm and the potentials were close to neutral. There was maximum transfection efficiency and no significant increase in toxicity at 15 pmol/L. Bmi-1 and hTERT expression decreased, but the inhibition rate increased in the hTERT siRNA group, the hTERT+Bmi-1 siRNA group and the hTERT+Bmi-1 siRNA group compared with the scrambled siRNA group and the control group. Moreover, the hTERT+Bmi-1 siRNA group had the highest level of gene silencing. The complex, composed of Lipo, PEI and siRNA, is low toxicity and efficient transfection vectors. The expression level of Bmi-1 and hTERT was decreased by the gene silencing of either Bmi-1 or hTERT, but the effects were more significant when both were silenced simultaneously.     

Bcl-2 siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的: 构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体，并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法： 根据GenBank 提供的bcl-2 cDNA序列，设计双链小干扰RNA（siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA 序列，并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接，构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞，采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果: 构建了bcl-2 siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555，并经限制性内切酶酶切和DNA 测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72 h后，RT-PCR显示bcl〖STBX〗-2〖STBZ〗基因表达下调接近80％；MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论: bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建，有效沉默 bcl-2在膀胱癌细胞中的表达，抑制了癌细胞的生长。     

Characterization of anti-cyclin E single-chain Fv antibodies and intrabodies in breast cancer cells: enhanced intracellular stability of novel sFv-F(c) intrabodies

Cyclin E is a critical cell cycle protein in the regulated progression of normal cells to replicate their DNA. Ectopic overexpression of cyclin E results in accelerated G(1) progression, chromosome instability, and a reduced requirement for growth factors. Dysregulated cyclin E expression is found in nearly all breast cancers examined. Toward the goal of developing a system to block cyclin E function in normal and breast cancer cells, we have developed anti-cyclin E single-chain antibodies (sFvs) for use as intrabodies. We have cloned the variable region genes from two hybridoma cell lines that produce anti-human cyclin E antibodies, linked them into sFvs, and showed their ability to bind cyclin E when expressed as sFv-F(c) fusion proteins. Engineering of the sFvs as sFv-F(c) intrabodies resulted in a dramatic increase in the sFv half-life as analyzed by pulse-chase and immunofluorescence, and these fusion intrabodies can be expressed in the cytosol or retargeted to the nucleus of breast cancer cell lines. Stable expression of a nuclear-targeted anti-cyclin E intrabody appears to inhibit the growth of the breast cancer cell line SKBR3. This work sets the stage for the development of intrabody-based inducible or tissue-specific cyclin E knockouts and for identifying cyclin E and its vital cell cycle functions as a potential gene therapy target in breast and other cancers.     

RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

姜黄素对裸鼠乳腺移植瘤p21及CD44V6表达的影响

目的: 研究姜黄素对裸鼠乳腺移植瘤p21及CD44V ₆表达的影响。方法: 选用人乳腺癌细胞株MCF-7对裸鼠进行异种移植,成瘤后随机分为2组：（1）阴性对照组；（2）姜黄素组。观测移植瘤的出瘤时间、成瘤率，测量瘤体大小并计算瘤表面积。同时应用RT-PCR，检测2组肿瘤组织中cyclin D1、p21及CD44V₆的表达。结果: 姜黄素组瘤表面积明显低于阴性对照组；姜黄素组p21表达量高于阴性对照组，CD44V₆表达量明显降低，2组的cyclin D1表达差异无显著。结论: 姜黄素抑制裸鼠MCF-7乳腺移植瘤CD44V₆的表达，增加p21的表达。