登革2型病毒E基因克隆及B细胞抗原表位分析

目的扩增登革病毒2型新几内亚株(NGC)E基因,并进行B细胞抗原表位分析。方法根据登革2型病毒NGC株E基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增NGC株E基因并克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α后测序。按Kyte-Doolit-tle方案、Jameson-Wolf方案和Emini方案预测B细胞抗原表位。结果通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,并对登革2型病毒NGC株E基因进行B细胞抗原表位预测。结论通过RT-PCR方法,获得了登革2型病毒NGC株E基因,为制备登革2型病毒E基因单克隆抗体和疫苗打下基础。     

登革Ⅱ型病毒Tr1751株E蛋白基因的克隆与表达载体的构建

目的从登革Ⅱ病毒Tr1751株中克隆表达E蛋白的基因,构建了真核表达质粒,为其后继的关于结构和功能的研究提供了条件。方法合成DEN2(Tr1751株)的E蛋白基因引物,通过RT-PCR的方法扩增含有信号肽E蛋白的基因片段,并与真核载体p IRES-hr GFP-1α连接,得到重组的质粒p IRES-hr GFP-1α-E,再用PCR、双酶切和测序的方法进行鉴定。结果 RT-PCR得到的为1 527bp的E蛋白基因片段,酶切鉴定和测序显示重组的质粒含有DEN2病毒中的E蛋白的基因。用重组质粒测序后与Gen Bank中的已知Tr1751株进行相似性比对,核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性均为99%。结论成功的构建出含有全长DEN2的E蛋白基因的真核质粒,为登革病毒核酸疫苗的研究奠定了基础。     

4株蚊媒病毒多重RT-PCR快速检测方法的建立

目的建立登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒的多重RT-PCR快速检测方法。方法参照病毒核酸序列设计多重RT-PCR引物,并检索GenBank国际基因序列数据库初步验证其特异性,随后对Mg2+、dNTP及引物浓度,RT-PCR反应条件进行优化,建立稳定、特异的多重RT-PCR快速检测4株病毒方法 ,并以同属于黄病毒科的登革3型病毒、登革4型病毒及甲病毒属基孔肯亚病毒、辛德毕斯病毒为对照,验证其特异性。结果应用多重RT-PCR反应体系,对引物的相关性实验结果表明引物之间不会因相互干扰而出现假阳性结果 ;采用多重RT-PCR引物对登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒进行扩增,分别获得574、251、879、422 bp片段,与设计相符,而对照病毒组均无非特异性扩增条带。结论实验证明,所建立的多重RT-PCR方法能够快速地检测登革1、2型病毒、黄热病毒及流行性乙型脑炎病毒,为其检测提供了一种方便易行的方法 。     

白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化

目的：通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析，了解登革病毒在流行过程中的变异性。方法：用登革2型病毒(DEN-2)NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株，提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸，对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较。结果：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后，子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较，出现3个位点的突变，分别位于第174，215，336位点；亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同。结论：DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

登革2型病毒E抗原基因的RT—PCR扩增及表达载体的构建

扩增并克隆登革２型病毒Ｅ抗原基因，构建Ｅ抗原基因表达载体。方法应用ＲＴ－ＯＰＣＲ法，基因克隆和限制性内切除酶酶切分析。结果增殖病毒标准株并提取病毒总ＲＮＡ。在登革２型病毒Ｅ抗原基因两侧疏水区设计一对ＰＣＲ引物。     

登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建登革2型病毒NS1-NS2a基因真核表达质粒.方法 RT-PCR扩增NSI-NS2a基因片段后,将其克隆人真核表达载体pReceiver-M01a;过PCR、酶切、测序和间接免疫荧光染色鉴定重组质粒.结果 经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pRe-NS1-NS2a;重组质粒转染Vero细胞后,间接免疫荧光染色显示细胞质中有登革2型病毒特异性蛋白的表达.结论 成功构建了真核表达质粒pRe·NS1-NS2a.     

登革2型病毒NGC株感染白纹伊蚊C6/36细胞中浓核病毒DNA的扩增和序列测定

目的:探索白纹伊蚊C6/36细胞对登革2型病毒(Dengue Type 2 virus,DEN2)不敏感的原因.方法:根据Genbank提供的DEN2新几内亚株(NGC株)NS1基因序列设计引物,设立病毒对照组、病毒DNA酶(DNase)处理组和细胞对照组,通过提取核酸、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、限制性内切酶(Hind Ⅲ)酶切、1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR及其酶切产物,并对其扩增产物进行序列测定,用软件比对与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒(Densonucleosis virus,DNV)基因的同源性.结果:经RT-PCR,细胞和病毒组均出现约1 300 bp的条带,不能被Hind Ⅲ酶切,而病毒DNase处理组未能扩增出此条带;经GenBank比对,该片段序列与白纹伊蚊C6/36细胞DNV部分序列的同源性达95%以上.结论:C6/36细胞对DEN2不敏感的原因是由于伊蚊C6/36 DNV的污染.     

登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响

目的：研究登革2型病毒（DENV-2）、登革2型病毒国际参考株（NGC）E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株（M）E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）通透性的影响.方法：将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果：DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响最为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论：DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.     

登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别.     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

佛山市登革2型病毒流行株结构基因序列测定及分析

目的对我国登革2型病毒1993年广东省佛山市流行株GD06/93结构蛋白基因进行序列测定及分析,追踪其地域来源、基因组结构与致病性的关系,为研究开发登革病毒新型疫苗奠定基础。方法根据登革2型国际标准株NGC序列,设计2对重叠引物,RT-PCR扩增,分别克隆到pMD18-T载体,转化受体菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR、酶切鉴定及序列测定。结果GD06/93株结构基因序列长度为2325bp,编码775个氨基酸。与其它登革2型病毒株TSV01、Taiwan-1008DHF、NGC、44、ThD2_0038_74、ThNH81/93、gd08/98、04、Cuba165/97及S1进行比较,其核酸序列同源性分别为97%、96%、95%、95%、95%、94%、94%、92%、92%、91%。结论GD06/93病毒株的结构基因序列与已发表的其它登革2型病毒株同源性很高。在比较的6株登革2型病毒株中,GD06/93株与同期在澳大利亚流行的TSV01株同源性最高。     

抗2型登革病毒特异性免疫球蛋白重链可变区基因的扩增与纯化

提取抗２型登革病毒单克隆抗体杂交瘤细胞ｍＲＮＡ和ＤＮＡ反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＰＣＲ扩增并纯化特异性免疫球蛋白重链可变区（ＶＨ）基因。琼脂糖凝胶和聚丙烯胺凝胶电泳观察结果;该ＶＨ基因约４５０ｂｐ。实验证明,上述两种方法均是分离和扩增ＶＨ基因的有效方法,但提取ＤＮＡ后进行ＰＣＲ较提取ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ经济,简单。     

广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株E基因序列分析

目的测定广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株的E基因序列并进行分析。方法收集广州市2006年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离登革病毒,RT-PCR法扩增全长E基因,测定序列并绘制系统发生树,进行生物信息学分析。结果59份标本中38份病毒分离培养阳性,获得广州市2006年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2006/1707的E基因序列,其同源性与东南亚缅甸、泰国、柬埔寨等地的流行株接近,但与广州市2002年Ⅰ型登革病毒流行株GZ2002/281较远。结论广州市2006年流行的登革病毒属输入性,但与2002年流行的登革病毒有不同的输入源。     

Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的 研制Ⅲ型登革病毒(DV3)非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体,鉴定其血清型特异性.方法 以具有良好抗原性的重组DV3-NS1蛋白与DV3交替免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定.结果 经交替免疫法免疫Balb/c小鼠,共获得14株抗DV3-NS1单抗,其亚类测定1株为IgG2a,余为lgG1.其中3株特异性结合DV3及DV3-NS1蛋白,4株能同时结合4型登革病毒NS1蛋白,其余7株与其他3型登革病毒NS1蛋白存在交叉反应.结论 成功获得了针对DV3-NS1的特异性单抗及交叉性单抗,将为进一步研究登革病毒NS1蛋白的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定基础.     

广东和广西部分地区蝙蝠携带登革病毒及流行性乙型脑炎病毒的调查研究

目的了解广东及广西蝙蝠携带登革病毒和流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的情况。方法2004年9月至2005年11月期间11次收集广东及广西部分地区的蝙蝠。收集的蝙蝠取脑组织标本和血清标本,采用两对登革病毒和乙脑病毒通用引物,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞培养分离方法检测所采集蝙蝠标本中的登革病毒(denguevirus,DV)和乙脑病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)。结果收集了4个科9个种共905只蝙蝠,其中棕果蝠154只、犬蝠395只、普通长翼蝠5只、小黄蝠52只、中菊头蝠228只、中华菊头蝠15只、小菊头蝠41只、双色蹄蝠8只、普氏蹄蝠7只。蝙蝠来源于粤中、粤西和桂东的7个县市。905只蝙蝠标本中未检测、分离到登革病毒和乙型脑炎病毒。结论未发现所调查的蝙蝠携带登革病毒和乙型脑炎病毒。     

河南省1例柬埔寨输入登革热病例的病原分子分型与全基因序列分析

目的鉴定河南省1例来自柬埔寨的登革热输入性病例的登革病毒(dengue virus,DENV)血清型和基因型及其序列特征和传播来源。方法患者血液标本来源于2019年国家疾病监测系统网络直报的登革热疑似病例。样品经快速检测DENV NS1抗原和IgM/IgG抗体,再提取血清中核酸,应用荧光RT-PCR法进行DENV血清型鉴定,同时用Vero和BHK-21细胞对血清标本进行病毒分离培养,阳性培养物扩增全基因组序列,进行序列系统进化分析。结果该病例实验室确诊为DENV 1型感染,并从血清标本中分离到病毒株,测序后拼接成全长10670 nt的全基因组序列,经系统进化分析,该病毒株属于DENV 1型基因Ⅰ型,与东南亚流行株具有较高同源性和较近亲缘关系。结论2019年河南省来自柬埔寨的输入性病例的病原体为DENV 1型基因I型,此为近年来东南亚输入我国的常见血清型和基因型。     

广州登革病毒1型NS2a-NS2b基因序列分析

目的对2004年广州军区总医院收治的1例疑似登革病毒感染者进行确诊,通过对病毒的基因序列分析。寻找该例感染病毒的可能来源。方法首先从疑似病人的血清提取血液RNA,用RT—PCR法对比较保守的病毒非结构蛋白NS2a-NS2b上的部分序列进行扩增,并进行基因克隆、测序及同源性分析。结果经RT-PCR和基因测序检测证实为DEN1感染;基因序列分析结果表明．该病毒与我室保存的1995年、1997年、1999年和2003年的DEN1流行株非结构蛋白NS2a-NS2b的部分序列同源性分别为90．8％、97．6％、100％和99．6％。结论该例疑似登革病毒感染患者被确诊为DEN1型病毒感染。与1999年广东省中山市的登革1型病毒流行株在部分非结构蛋白NS2a-NS2b上完全相同．并与1997年广东省潮州市和2003年广州市的流行株为同一基因型。由此初步推断,在我国可能已存在登革1型病毒的疫源地。