两种不同来源的EBV LMP1基因在Balb/c 3T3细胞中的表达

【目的】研究来源于鼻咽癌细胞株SUNE1及EBV标准株B95 - 8细胞中两种EBVLMP1基因在真核细胞Balb/c3T3中的表达 ,为进一步研究EBVLMP1基因的核酸疫苗打基础。【方法】将两种不同来源EBVLMP1基因的真核表达质粒 ,经脂质体法转染Balb/c 3T3细胞后 ,用Westernblot、免疫组化及PCR的方法检测不同转染细胞中EBVLMP1蛋白的表达及核酸片段。【结果】PCR结果表明在两种不同来源LMP1转染细胞中均有EBVLMP1基因序列 ,并均能表达 6 3ku的蛋白质 ,经Westernblot和免疫组化结果证实均为EBVLMP1蛋白。【结论】来源于B95 8细胞及鼻咽癌细胞SUNE1的两种EBVLMP1基因均能在真核细胞Balb/c 3T3中表达。     

EG病毒膜抗原BLLF1基因在转基因小鼠中的表达

目的：分析ＥＢ病毒膜抗原（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ,ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达。方法：ＥＢ病毒抗原ＢＬＬＦ１基因转基因首建鼠４只,尾组织经ＰＣＲ检测携带有ＢＬＬＦ１基因,用流式细胞仪分析ＭＡ在外周血淋巴细胞中的并有激光共焦显微镜确定ＭＡ在细胞中的表达部位。结果：４只首建鼠中有２只ＫＭ－Ｔｇ－ＥＢＶ１和ＫＭ－Ｔｇ－ＥＢＶ５外周血淋巴细胞中有ＭＡ的表达,表达部位在细     

EB病毒LMP1基因和蛋白在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤中的表达及与预后的关系

目的从蛋白和DNA两个水平初步检测成都地区结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中LMP1的表达,并探讨与预后的关系。方法应用免疫组化和PCR技术检测67例结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤LMPl的表达,并应用Kaplan—Meier曲线分别比较LMP1蛋白和LMP1DNA阳性表达组与阴性表达组的生存率。结果LMP1蛋白阳性表达10例(14．93％),LMP1DNA阳性表达56例(83．58％),LMP1总检出率83．58％。LMP1蛋白(P=0．678)和LMP1DNA(P=0．943)表达均与预后无明显关系。结论LMP1与成都地区结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤关系密切;结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤中LMP1蛋白水平和DNA水平表达不一致;LMP1的表达与预后无明显关系。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

鼻咽癌细胞EB病毒编码BHRF1基因的研究

利用斑点杂交技术检测正常鼻咽青草 咽未分化癌、低分化及高分化鳞癌中ＥＢ病毒编码ＢＨＲＦ１基因的存在情况。结果表明，鼻咽未分化癌及低分化鳞癌中的ＢＨＲＦ１阳性率分别为９０％和８５．７％，而高分化鼻咽癌组织的阳性率为２５％。提示ＢＨＲＦ１基因可能与因癌细胞的分化有关。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

EBV LMP2A和BZLF1融合基因重组腺病毒表达载体的构建

目的 构建EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白2A（LMP2A）编码基因和即刻早期基因（BZLF1）融合基因的重组腺病毒表达载体。方法 逆转录-聚合酶链反应分别获得LMP2A和BZLF1编码序列的cDNA,采用剪接式重叠延伸（SOE）技术将两段基因通过多肽接头（Gly4Ser）3的DNA序列进行连接,构建融合基因Z2A。将融合基因Z2A定向亚克隆到pAdTrack-CMV质粒上,在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,构建融合基因Z2A真核表达载体pAd-Z2A。经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞,获得复制缺陷型重组腺病毒vAd-Z2A。结果 重组腺病毒载体经限制性核酸内切酶酶切,电泳后可观察到长31 kb和4.5 kb两条DNA条带,测序鉴定结果表明序列正确;从感染重组腺病毒vAd-Z2A的293细胞中检测到融合基因Z2A的表达。结论 本研究成功地构建了EBV LMP2A和BZLF1融合基因Z2A重组腺病毒表达载体,为进一步研究Z2A的功能提供了实验基础。     

c-fos mRNA在损伤Balb/c 3T3细胞中的表达

本文以划线损伤方法在Balb/c 3T3细胞造成了纤维母细胞损伤模型,以Northernblot检测了这种刺激对c-fos mRNA表达的影响。结果表明,损伤 30min后就可在 Balb/c 3T3细胞中检出 c-fos mRNA。     

EBER1／2及LMP—1在不同类型非霍奇金淋巴瘤中的表达

目的 探讨ＥＢＥＲ１／２及ＬＭＰ－１在不同类型ＮＨＬ中的表达及意义。方法 用ＬＭＰ－１免疫组化与ＥＢＥＲ１／２原位杂交检测５４例ＴＣＬ,６３例ＢＣＬ及２６例ＮＫ／Ｔ淋巴瘤。结果 ＥＢＥＲ１／２阳性率在ＢＣＬ、ＴＣＬ、ＮＫ／Ｔ淋巴瘤中分别是９．５％、３７．０％、４６．２％,ＢＣＬ组和ＮＫ／Ｔ组比较,均有显著差异（Ｐ〈０．０１）,其中阳性病例大多数位于上呼吸道。ＬＭＰ－１阳性率在ＥＢＥＲ１／２阳性的Ｂ     

MTA1基因在鼻咽癌中表达与肿瘤转移和EB病毒感染的关系

[目的]探讨EB病毒感染对MTA1在鼻咽癌中表达的影响以及MTA1表达对鼻咽癌转移的可能作用.[方法]检测60例不同临床分期鼻咽癌患者血VcA-IgA和DNA酶以及鼻咽癌标本MTA1表达水平.[结果]鼻咽癌患者血中VcA-IgA、DNA酶的水平高低与MTA1基因表达无相关,其相关系数分别为0.105和0.096.不同性别和T2～T4各级中,MTA1基因表达无明显差异(P>0.05).而在不同N分级中,MTA1基因在第Ⅰ期和第Ⅱ期与第Ⅲ和第Ⅳ期之间有明显差异(P<0.05).[结论]EB病毒在鼻咽癌中的感染不会诱发或导致MTA1基因表达.MTA1基因表达在鼻咽癌的侵袭中未起作用,其也不是诱发鼻咽癌转移的原因,但可能在鼻咽癌转移的后期起了一定的协同作用.     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

Epstein-Barr病毒RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达及其细胞内定位

目的:了解RPMS1基因在鼻咽癌组织中的表达特点,并明确该基因在上皮细胞中表达的亚细胞区域,为进一步研究其生物学功能提供依据. 方法:提取鼻咽癌组织及各细胞系的DNA和总RNA,以巢式PCR扩增W片段来检测Epstein-Barr病毒(EB病毒)的感染情况,RT-PCR检测RPMS1基因在鼻咽癌组织、细胞株中的表达,并克隆入pEGFP-C2真核表达载体,通过脂质体转染技术将其介导入人胚肾上皮(HEK293)细胞,以激光共聚焦显微镜观察其蛋白表达的亚细胞区域. 结果:除BJAB细胞株外,所有标本中均检测到EB病毒W片段;RPMS1 mRNA在鼻咽癌组织中的表达率为83.3%(45/54),在鼻咽非癌组织中则仅为4%(1/25),二者有显著性差异(P<0.001),鼻咽癌外周血淋巴细胞中未检测到RPMS1表达,RPMS1在SUNE1细胞中的表达高于Raji细胞,但不表达于B95.8细胞;RPMS1可稳定表达于HEK293细胞,其编码蛋白的表达以胞核为主. 结论:EB病毒RPMS1基因在高发区鼻咽癌组织中存在高水平转录,在体外可稳定表达于上皮细胞的胞核,提示RPMS1编码蛋白可能作为核转录因子通过调控细胞增殖相关的信息传递而参与上皮癌变过程.     

EB病毒LMP与EGF自分泌在鼻咽癌细胞生长中的作用及其相互关系

以ＬＭＰ基因转染ＣＮＥ１细胞为对象，用放射免疫分析（ＲＩＡ）和细胞增殖实验（ＭＴＴ）等方法，研究ＥＢ病毒ＬＭＰ和ＥＧＦ自分泌在高分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１生长增殖中的作用和关系。结果示：从细胞培养液中检获ＥＧＦ；细胞可在无血清培养液中生长。说明ＣＮＥ１细胞具有ＥＧＦ自分泌促生长功能。转染ＰＣＭＶα－ＬＭＰＤＮＡ的ＣＮＥ１细胞ＬＭＰ的ＰＣＲ和ＬＭＰ单抗免疫组化检测均为阳性，证明ＬＭＰ基因转染成功。ＥＧＦ自分泌量和无血清培养下ＥＧＦ的促生长反应，ＬＭＰ转染细胞均高于未转染细胞，表明ＥＢ病毒ＬＭＰ可通过促进ＥＧＦ自分泌而促进鼻咽癌细胞生长增殖。     

EBER1／2、LMP—1在鼻腔非霍奇金淋巴瘤中的表达及意义

目的 探讨EBER1／2、LMP—1在鼻腔非霍奇金淋巴瘤(NHL)中的表达及意义。方法采用免疫组织化学链霉素抗生物素-过氧化酶连接法(SP法)检测CD45RO、CD3e、CD20、TIA—1、粒酶B确定肿瘤细胞免疫表型，原住杂交(In situ hybridization,ISH)方法检测EB病毒（EBV)编码的RNA（EBER1／2)、免疫组织化学方法检测EBV潜伏膜蛋白(LMP—1)。结果29例鼻腔NHL中，CD45RO阳性29例(100.00％)，CD3e、TIA—1、粒酶B阳性19例(65.56%）CD20全部阴性；EBER1／2阳性率为79．62％(23/29)，LMP—1阳性率为48.28％(14/29)。结论EBV与鼻腔NHL密切相关，EB病毒在鼻腔非霍奇金淋巴瘤的发生发展中可能起重要作用，EBER1／2原住杂交检测及LMP-1免疫组化检测可作为鼻腔非霍奇金淋巴瘤组织学诊断的辅助依据。     

腺病毒携带EB病毒LMP1反义基因抑制人鼻咽癌细胞的生长

[[摘要] 目的 研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法 用反义LMP1DNA的腺病毒载体AdEasy -GFP-ALMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2,Western2blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达;用MTT法和细胞生长曲线实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果 建立反义CNE2细胞;转染后LMP1蛋白表达降低;转染后细胞活力和生长速度均有下降。结论 将反义LMP1腺病毒载体导入细胞能成功抑制CNE2细胞的生长,逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。 [关键词] EB病毒 反义LMP1基因 鼻咽肿瘤 基因治疗     

人胰岛素基因在NIH3T3细胞中的基因转染和表达

目的　研究人胰岛素基因在体外培养的小鼠成纤维细胞系的基因转染和表达。方法　采用壳聚糖转染法将重组的人胰岛素基因表达质粒转染鼠成纤维细胞 (NIH3T3) ,转染后 72h ,经G4 18抗性筛选出阳性克隆并培养到第 2 4d ,用免疫组织化学方法检测胰岛素的表达 ,同时用ELASA法监测转染后 2 4d的细胞培养液的胰岛素水平。结果　转染PCMV .INS的NIH3T3细胞培养液的胰岛素水平明显高于未转染组 (P <0 .0 1)及PCMV转染组 (P <0 .0 1) ,未转染组与PCMV转染组细胞培养液的胰岛素水平无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论人胰岛素基因在NIH3T3细胞系的转染成功和表达说明基因治疗有望成为 1型糖尿病的重要治疗手段 ,壳聚糖是一种很有前途的胰岛素基因载体。