BigET-1类似物的内皮素转换酶活性的影响

目的探讨不同BigET-1类似物对内皮素转换酶(ECE)活性的影响、ECE对底物的作用机制,以寻找ECE 的抑制物.方法克隆人ECE的cDNA,将其亚克隆至表达载体,然后把该表达载体导入CHO-K1细胞内使其表达.将该ECE分别加入不同浓度的多种BigET-1类似物中,无BigET-1类似物的作为对照.ECE的活性则通过放免法直接测定ET-1的生成量而反映的.结果在多种BigET-1类似物中[Phe21]BigET-1(18-34)和[Ala31]BigET-1(18-34)以不同的形式抑制了ECE的活性,前者为竞争性抑制,其抑制常数Ki为(20.6±3.8)μmol/L;后者为非竞争性抑制,其抑制常数Ki为(35.6±8.1)μmol/L.结论 ECE能够识别其底物BigET-1的活性部位和C末端的2个区域,此2个区域也以不同的形式被该酶所识别.     

测定谷胱甘肽-S-转硫酶动力学参数的变化表征其抑制剂

目的:测定谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferases,GST)动力学参数变化,建立表征其抑制剂的方法.方法:从猪肝经阴离子交换层析和亲和层析制备GST酸性同工酶,用还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和1-氯-2,4-二硝基苯(1,-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)合成S-(2,4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(GS-DNB)为候选抑制剂,以GSH与CDNB为底物测定GST在GS-DNB作用下的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm),从而确定GS-DNB对GST的抑制常数(Ki).结果:此GST被纯化146倍以上,活性总收率近30％.该GST对GSH和CDNB的Km分别为42 μmol/L和0.86 mmol/L,属于随机双底物动力学模型.GS-DNB对CDNB竞争性Ki为(21±1)μmol/L (n=2);对GSH竞争性Ki为(17±1)μmol/L (n=2).结论:产物GS-DNB是GST的高亲和力竞争性抑制剂;测定GST动力学参数随抑制剂浓度的变化可筛选其抑制剂.     

羟基多氯联苯与人和大鼠羟基固醇类硫酸基转移酶的相互作用

目的:多氯联苯(Polychlorinated biphenyls,PCBs)是一类持久性环境污染物,对人类健康有潜在危害。羟基多氯联苯(Hydroxylated PCBs,OH-PCBs)是PCBs在体内的生物活性形式;已有报道OH-PCBs是多种亚型的酚类硫酸基转移酶(Sulfo-transferases,SULTs)抑制剂和底物,本研究拟观察OH-PCBs与人和大鼠羟基固醇类SULT有无相互作用。方法:采用重组表达人羟基固醇类SULT(SULT2A1)和其大鼠同源酶SULT2A3的大肠杆菌菌株,分离纯化所表达的酶蛋白;分析3种OH-PCBs的酶促硫酸基结合或抑制生理性底物结合反应的活性;以辅酶转化产物3’,5’-二磷酸腺苷(Adenosine 3’,5’-diphosphate,PAP)形成反映酶促硫酸基结合的水平。结果:4-OH PCB 34和4’-OH PCB 68一定浓度(1～200μmol/L)对人SULT2A1具有底物活性;二者都存在底物抑制(在50μmol/L以上抑制明显)。4’-OH PCB 9对此酶不具底物活性,但对去氢表雄酮(Dehydroepiandros-terone,DHEA)和...     

人线粒体亮氨酰tRNA合成酶的表达、纯化及其动力学研究

目的:构建含人线粒体亮氨酰tRNA合成酶(mtLeuRS)基因的重组表达载体,表达纯化mtLeuRS并检测其酶促动力学参数.方法:克隆mtLeuRS基因,构建入pET-24a(+)表达载体,转化大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,经诱导产生带6-His标签的mtLeuRS融合蛋白,再经Ni2+亲和层析柱一步法纯化后用酶促反应检测其氨酰化活力.作为mtLeuRS酶促反应底物,人tRNALeu(UUR)由T7 RNA聚合酶体外转录生成.结果:经IPTG诱导,人mtLeuRS蛋白表达量约占细菌总蛋白量的1％～2％,1 L培养液的菌体内可收获约2 mg的纯化酶蛋白.通过体外转录生成的酶底物tRNALeu(UUR)可达转录模板的100倍.经酶促反应,人mtLeuRS可氨酰化人线粒体内tRNALeu(UUR).反应的亲和常数(Km)为16.67 μmol/L,催化常数(Kcat)为0.17 s-1.结论:本实验成功克隆并表达了人mtLeuRS,并成功用于催化tRNALeu(UUR)的氨酰化.     

用线性动力学方法考察黄嘌呤对尿酸酶的抑制作用

目的:以米氏常数相差较大的两种尿酸酶为模型,考察用两个底物浓度下标定比活性确定酶动力学参数和筛选抑制剂的可靠性.方法:用293 nm吸收监测尿酸酶反应.通过两个底物浓度下标定比活性确定表观米氏常数(apparent michaelis-menten constant,Kmapp)和表观最大反应速度(apparent maximal reaction rate,Vmapp).据表观动力学参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant,Ki).结果:只要所用尿酸浓度中较小者(the lower concentration of uric acid,SL)大于待测Km的0.8倍且较大者(the higher concentration of uric acid,SH)在SL的1.4倍以上,此线性动力学法能可靠测定Bacillusfastidiosus和Candida species尿酸酶的米氏常数,且与双倒数法结果一致.如SL大于Km的3.8倍而SH为SL的3倍,此线性动力学法所得Candida species尿酸酶Kmapp与抑制剂浓度成正比,Ki为(4.8±0.5)μmol/L,与双倒数法结果一致.Bacillus fastidiosus尿酸酶Km太高,底物浓度有限时不能用此方法筛选其抑制剂.结论:此线性动力学方法仅用高于Km的底物浓度也能可靠确定酶动力学参数,有利于用常规定量方法筛选对底物具有高亲合力特殊靶酶的抑制剂.     

1,4-二羟蒽醌是一种有效的重组人蛋白激酶CK2的抑制剂

目的观察1,4-二羟蒽醌对重组人蛋白激酶CK2全酶的作用。方法在体外等物质的量混合CK2α与＇α亚基构成重组CK2全酶。以重组人CK2全酶为分子靶点,通过测定转移到CK2底物ATP的32P放射活度,来检测不同浓度5-氯苯并三唑对CK2活性的影响,并进行动力学分析。结果 1,4-二羟蒽醌对重组人CK2全酶具有抑制作用,且该作用随浓度的增加而增强,其IC50为63.15μmol/L;它与ATP呈竞争性抑制CK2的活性,抑制常数Ki为40.49μmol/L;与酪蛋白呈非竞争性抑制CK2的活性,抑制常数Ki为44.72μmol/L。结论 1,4-二羟蒽醌是重组人蛋白激酶CK2的有效抑制剂。     

极端嗜热菌Thermus thermophilus HB27 中腺苷酸激酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质研究

目的克隆Thermus thermophilus HB27隆腺苷酸激酶基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达并获得了比较高的表达量并对其酶学性质进行分析。方法利用PCR技术从Thermus thermophilus HB27基因组中扩增得到腺苷酸激酶的基因片段,将其克隆到pET-28a表达载体上,以PCR\酶切和测序进行鉴定。利用光谱分析测定该重组酶的相关酶学性质。结果成功克隆和高效表达了腺苷酸激酶;重组酶的最适pH是8.5,最适温度是90℃。重组酶对底物ADP的米氏常数Km是68.6μmol/L,VmaxADP为0.294mmol/(L-1·min-1)。将该重组酶在70、80、90、100℃下分别作用7h后,发现仍具有酶活性,显示出高的温度耐受性。腺苷酸激酶的特异性抑制剂AP5A浓度为2.0mmol/L能够抑制重组腺苷酸激酶70%的酶活性,AP5A对重组腺苷酸激酶的抑制类型为竞争性抑制,其抑制常数为46.39μmol/L。结论成功克隆、表达重组腺苷酸激酶,为腺苷酸激酶的进一步应用奠定了基础。     

PKC-c-fos途径在罗格列酮抑制内皮素诱发心肌肥大中的作用

目的 研究罗格列酮(RSG)抑制内皮素(ET-1)引起心肌肥大的机制与蛋白激酶C(PKC)和c-fos的关系.方法 在培养新生大鼠心肌细胞中,采用RSG(PPAR-γ激动剂)、PKC的激动剂(佛波醇酯,PMA)、PKC的阻断剂白屈菜季氨碱(che)观察罗格列酮在ET-1和PMA诱导心肌肥大中对PKC活性和C-fos蛋白表达的影响.结果 培养2 d后,对照组(DMEM)蛋白质含量为(290±13)μg/ml,ET-1组和PMA组分别为(339±15)μg/ml和(329±14)μg/ml,较对照组升高15%和13%(P<0.01);ET-1 10-8 mol/L RSG组、ET-1 10-7mol/LRSG组、ET-1 che组、分别为(303±14)、(292±11)、(291±12)μg/ml;与ET-1组比较分别降低10%、12%、13%(P<0.05,P<0.05,P<0.01);PMA 10-7mol/LRSG组的蛋白含量较PMA组降低10%(P<0.01).PMA和ET-1促进心肌细胞蛋白质的合成,RSG和che分别抑制蛋白质合成.测定心肌细胞的3H-亮氨酸掺人,RSG同样可以抑制ET-1和PMA诱导的心肌细胞肥大,同时PMA和ET-1使PKC从胞浆移位到细胞膜.RSG和che均有抑制蛋白质合成和3H-亮氨酸掺人的作用,还有抑制PMA和ET-1引起心肌细胞PKC活性和c-fos蛋白表达增强的作用.结论 RSG抑制ET-1和PMA引起的心肌肥大,其制作用可能与抑PKC-c-fos途径有关.     

用积分法考察黄嘌呤对Candida species尿酸酶的抑制作用

目的: 以Candida species尿酸酶为模型,考察用积分法筛选抑制剂的条件. 方法: 用293 nm吸收记录尿酸酶反应. 用反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线确定表观米氏常数(apparent Michaelis-Menten constant, Kmapp)和表观最大反应速度(apparent maximal reaction rate, Vmapp). 据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和抑制常数(inhibition constant, Ki). 结果: 被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性. 通常终点底物<1/6 Kmapp而起始底物足够高,此积分法测定Kmapp的偏差和变异低于20%而Vmapp精度更高. 用积分法所得Kmapp与双倒数法一致,且和黄嘌呤浓度成正比,对应Ki为(5.4±0.8) μmol/L (n=3),也与双倒数法一致. 结论: 被分析数据精度足够高,用无抑制剂时米氏常数(Michaelis-Menten constant, Km)4倍以上的起始底物浓度并固定终点底物浓度<1/6 Km,此积分法能用于筛选特殊类型的抑制剂.     

正常人及大鼠心脏内皮素转换酶的分布

目的:了解正常人和大鼠心脏各部分内皮素转换酶(Endothelin-conveerting en-zyme,ECE)的分布。方法:采用半定量RT-PCR法检测ECE mRNA表达,同时根据外源性的巨内皮素-1转变为内皮素-1的量判定ECE活性。结果:正常人心脏各部位心肌均存在ECE,ECEmRNA表达和活性的分布特点一致:心房显著高于心室,左、右心房间及左、右心室和室间隔间无显著性差异。大鼠的ECE mRNA表达和活性分布规律与人相似。结论:正常人和大鼠心脏各组分均存在ECE,且两者的分布规律相似。     

1＋1〈2

两个水性不佳的年轻人在河边练习游泳，突然，他们同时听到河中心有孩子落水呼救。其中一个毫不犹豫地朝河心游去，另一个大喊“我帮你”!紧随其后奋臂追赶。     

PAI-1和ET-1在维持性血液透析患者动脉硬化中的作用

目的：探讨纤溶成分中I型纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、组织型纤溶酶原激活因子(tissue-type plasminogen activator,t-PA)与内皮素-1(endothelin-1,ET-1)在慢性肾衰竭维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者动脉硬化病变过程中所起的作用。方法：采用免疫组织化学与图像分析方法检测19例慢性肾衰竭MHD患者与11例对照组髂内动脉的血管壁病理改变与钙化程度,检测PAI-1,t-PA和ET-1在血管壁的表达情况;其中病例组按年龄分为40岁以上组(11人)和40岁以下组(8人),对照组均为40岁以下。收集所有研究对象的临床资料,包括年龄、性别、血液透析时间、血压、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血肌酐(serum creatinine,SCr)等。结果：MHD患者与正常对照组比较,髂内动脉血管壁中膜厚度增加,中膜厚度/内径、中膜面积/内腔面积值均增大(P<0.05),钙化程度增加(P<0.05);在MHD患者不同年龄组间比较,40岁以上组比40岁以下组动脉血管壁中膜厚度增加,中膜厚度/内径值、中膜面积/内腔面积值均增大(P<0.05));血管壁中膜厚度与年龄、血压呈正相关(P<0.01);PAI-1,t-PA,ET-1在MHD患者髂内动脉管壁中较正常对照组的表达上调(P<0.05);PAI-1和ET-1在40岁以上组较40岁以下组的表达上调(P<0.05),t-PA在两组中的表达差异无统计学意义;PAI-1或ET-1的表达与年龄或血压呈正相关;t-PA的表达与年龄、血压无相关性(P>0.05)。PAI-1或ET-1的表达与中膜厚度或钙化程度呈正相关(P<0.05或P<0.01)。血液透析时间与血管壁中膜厚度、中膜厚度/内径、中膜面积/内腔面积值、钙化程度、PAI-1、t-PA以及ET-1的表达无相关性。结论：1)MHD患者存在动脉硬化;40岁以上的MHD患者动脉硬化程度较40岁以下者更为严重;且随着血压的增高,动脉硬化程度加重。2)PAI-1和ET-1的异常表达在MHD患者动脉硬化进程中起重要作用, t-PA在MHD患者动脉硬化进程中作用不明显。3)PAI-1或ET-1的表达与中膜厚度或钙化程度呈正相关,提示二者可能有助于临床上对MHD患者动脉硬化程度的判断。4)血液透析治疗时间可能不是加速动脉硬化的潜在因素。     

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该文试图阐述衔接手段在阅读教学中的重要性,并分析在阅读教学中怎样利用衔接手段帮助学生进行有效的阅读。该文分三部分来进行讨论,首先讨论阅读是一个相互作用的过程,然后提出衔接手段在阅读教学中的重要性,最后提出了如何利用衔接手段来指导学生进行外语阅读。     

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目的 研究鼻咽癌中浸润的淋巴类细胞与癌细胞凋亡间的相关性。方法 收集中山医科大学病理学教研室     

锰超氧化物歧化酶基因TaqI多态性与精神分裂症有关联吗？

目的 探讨印度人群锰超氧化物歧化酶（ＭｎＳＯＤ／ＳＯＤ２）基因ＴａｑＩ多态性与精神分裂症的相互关系。方法 应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）。方法 在６８例精神分裂症患者和６２例健康人群中观察了ＳＯＤ２基因多态性的分布。     

临床输液反应诸因素分析及对策

输液反应是临床护士在治疗操作中常遇到的问题,我院内科病区在１９９８年共发生输液反应１７例。现将引起输液反应的一些因素分析如下。１临床资料我院内科病区１９９８年共发生输液反应１７例,其中男性９例,女性８例。给药途径：１２例经手背、足背静脉用一次性头皮针...