Genistein抑制肝细胞肝癌侵袭性生长的体外研究

目的 研究genistein对肝癌细胞侵袭性生长的抑制作用及其作用机制。方法 以体外培养的Bel 7402肝癌细胞株为研究对象,分别给予5μg/mL和10μg/mL genistein干预,绘制细胞生长曲线,测定细胞活力和不同时间点细胞体外黏附能力变化,以Transwell小室测定细胞的体外侵袭能力,同时行局部黏着斑激酶(FAK)表达、细胞DNA含量的双参数流式细胞仪检测和细胞凋亡的流式细胞仪检测。结果genistein显著抑制Bel 7402肝癌细胞株的生长,其细胞活力显著下降,肿瘤细胞抑制率在G5组平均为26.71％,在G10组平均为42.64％;细胞体外黏附能力受到显著抑制,在genistein作用的前40 min内最为明显,40 min时的黏附抑制率在G5组为43.52％,G10组为84.18％;细胞体外侵袭能力显著下降,G10组的侵袭抑制率可达28％;细胞凋亡显著增加;细胞周期分析显示S期细胞比率显著降低,细胞生长主要阻滞在G2/M期;信号转导分子FAK表达在G10组(12.89±0.36)％显著低于对照组(19.75±1.12)％(P<0.05)。结论 genistein可以显著抑制Bel 7402肝癌细胞株的体外侵袭性生长,FAK表达改变与genistein抑制作用的发挥相关。     

威灵仙对人肝癌细胞株Bel7402增殖及Bcl-2和Bcl-xl蛋白表达的影响

目的观察威灵仙对人肝癌Bel7402增殖及Bcl-xl、Bcl-2蛋白表达的影响。方法将人肝癌Bel7402分为空白对照组、阳性对照组和威灵仙组,分别用普通培养液、氟尿嘧啶培养液、威灵仙培养液进行培养。采用四甲基偶氮唑盐比色法测定威灵仙对人肝癌细胞Bel7402的体外生长抑制率,并用免疫组化法检测三组细胞的Bcl-xl、Bcl-2蛋白表达量。结果威灵仙对人肝癌Bel7402细胞有显著增殖抑制作用,威灵仙组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01);威灵仙可抑制Bcl-xl、Bcl-2蛋白的表达,威灵仙组与空白对照组比较有统计学意义(P<0.01)。结论威灵仙可抑制Bel7402的生长,其机制可能与抑制Bcl-xl和Bcl-2蛋白的表达有关。     

RNA干扰技术对SKOV3细胞EGFR表达的抑制作用

目的 探讨RNA干扰(RNAi)技术对卵巢腺癌细胞株SKOV3表皮生长因子受体(EGFR)表达的抑制作用.方法 体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用lipofectamin 2000转染SKOV3细胞,采用RT-PCR和Western blotting技术检测EGFR mRNA和蛋白水平的变化,通过水溶性四唑盐(WST-1)比色法检测细胞增殖力,采用细胞黏附和移动实验检测细胞体外黏附和移动能力,通过细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭能力.结果 序列特异性dsRNA-EGFR对SKOV3细胞EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为73.65%和58.94%.dsRNA-EGFR组在转染后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为22.54%、35.76%、31.07%;dsRNA-EGFR组在30 min和90 min黏附实验中的黏附率分别下降12.11%和18.66%;转染dsRNA-EGFR后细胞体外移动和侵袭能力的抑制率分别为25.47%和22.08%.结论 化学合成的dsRNA可抑制卵巢癌SKOV3细胞EGFR表达,抑制细胞增殖、移动、黏附和侵袭力.     

RNA干扰技术对SKOV3细胞EGFR表达的抑制作用

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术对卵巢腺癌细胞株SKOV3表皮生长因子受体(EGFR)表达的抑制作用。方法体外化学合成EGFR序列特异性双链RNA(dsRNA),用lipofectamin 2000转染SKOV3细胞,采用RT-PCR和Western blotting技术检测EGFR mRNA和蛋白水平的变化,通过水溶性四唑盐(WST-1)比色法检测细胞增殖力,采用细胞黏附和移动实验检测细胞体外黏附和移动能力,通过细胞侵袭重建基底膜实验检测细胞体外侵袭能力。结果序列特异性dsRNA-EGFR对SKOV3细胞EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为73.65%和58.94%。dsRNA-EGFR组在转染后24、48、72 h细胞增殖抑制率分别为22.54%、35.76%、31.07%;dsRNA-EGFR组在30 min和90 min黏附实验中的黏附率分别下降12.11%和18.66%;转染dsRNA-EGFR后细胞体外移动和侵袭能力的抑制率分别为25.47%和22.08%。结论化学合成的dsRNA可抑制卵巢癌SKOV3细胞EGFR表达,抑制细胞增殖、移动、黏附和侵袭力。     

bcl—xl和p53在人肝癌Bel7402细胞中的表达及中药的干预作用

目的：从基因水平探讨白花蛇舌草多糖对体外培养的人肝癌Bel7402细胞凋亡诱导的作用及机制。方法：水提醇沉法提取白花蛇舌草多糖，人肝癌Bel7402细胞常规体外细胞培养，设定空白对照组、5-氟尿嘧啶阳性对照组、白花蛇舌草多糖组。HE染色法光镜下观察细胞形态改变，计算凋亡指数，采用MTT法检测白花蛇舌草多糖对癌细胞的生长抑制作用，RT—PCR法检测原癌基因bcl—xl、抑癌基因p53基因mRNA表达的变化。结果：白花蛇舌草多糖体外抑制人肝癌Bel7402细胞生长、促进细胞凋亡，凋亡指数达16．97％，以MTT显色法检测细胞抑制率达到61．5％，以RT—PCR半定量法检测，上调p53基因mRNA表达，降低bcl—xl基因mRNA表达，以上各指标与空白对照组相比均有显著差异。结论：白花蛇舌草多糖抑制人肝癌Bel7402细胞增长，诱导细胞凋亡，其分子机制可能与激活抑癌基因p53基因、抑制原癌基因bcl—xl基因表达有关。     

乙肝病毒X基因阻断降低肝癌细胞HepG2.215与纤维连接蛋白的黏附

目的探讨乙肝病毒X基因（HBX）在肝细胞癌（HCC）侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hH1neo质粒,构建针对HBX的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3,转染肝癌细胞株HepG2.215,用荧光定量PCR仪检测siRNA对HBX mRNA表达的抑制作用,用Western blot法检测siRNA对HBX蛋白表达的抑制作用。以Transwell小室测定HepG2.215细胞与纤维连接蛋白（Fn）的体外黏附能力。结果成功构建shRNA表达载体,shRNA表达载体均可不同程度地抑制HBX的表达,其中psiRNA1对HBX的抑制作用最强,对HBX mRNA抑制率达80.27%,对HBX蛋白的抑制率为65.59%;细胞体外黏附能力受到明显抑制,在培养至48、72h后,对照组和转染组跨膜细胞数分别为442.6±57.1vs376.4±55.2和588.2±70.1vs513.6±68.5,两时相点均有明显差异（P〈0.05）。结论阻断HBX的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2.215的体外侵袭性生长。     

FAK阻断对鼻咽癌细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究RNA干扰（RNAi）抑制黏附斑激酶（FAK）基因表达后对鼻咽癌HNE-1细胞株增殖和凋亡的影响.方法：利用免疫组化法检测鼻咽癌HNE-1细胞株中FAK基因的表达.根据基因库上的FAKmRNA序列,设计合成针对FAK的小干扰RNA（siRNA）并转染HNE-1细胞,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR,WesternBlot等方法检测细胞中FAK基因表达的变化;利用MTT法检测细胞的生长增殖;流式细胞术观察其对细胞周期及凋亡的影响.结果：鼻咽癌HNE-1细胞株中FAK基因呈阳性表达.针对FAK的siRNA使鼻咽癌HNE-1细胞株FAKmRNA和蛋白表达水平分别下调71.4%,59.8%;MTT法检测显示,细胞的生长增殖受到明显抑制,抑制率可达36.8%;转染后48h,鼻咽癌HNE-1细胞G0/G1期细胞量增加,而S期及G2-M期的细胞减少,同时凋亡率增加.结论：干扰鼻咽癌HNE-1细胞内FAK基因的表达,可抑制肿瘤细胞的生长增殖,使细胞周期重新分布并促进凋亡.     

RhoC-siRNA表达载体对肝癌细胞生长速度及侵袭力的影响

目的 构建RhoC-siRNA表达载体,研究其对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 构建RhoC-siRNA表达载体,以脂质体转染法将之稳定转染入SK-Hep1肝癌细胞株,Western blot法鉴定转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况,观察转染前后肝癌细胞形态、生长曲线、黏附、运动及体外侵袭能力的改变.结果 酶切及测序证实RhoC-siRNA真核表达载体构建成功,将之转染入肝癌细胞后,细胞中RhoC蛋白表达水平降低达60%,细胞形态及生长速度无明显改变,但细胞黏附、运动能力及体外侵袭能力均降低.结论 RhoC-siRNA表达载体对肝癌细胞的形态及生长曲线无显著影响,但可抑制其体外侵袭转移能力,可为肝癌的生物学治疗提供新的方法.     

RhoC-siRNA联合Rapamycin抑制人肝癌细胞Bel7402 VEGF表达

目的 检测RhoC-siRNA联合Rapamycin(Rapa)抑制人肝癌细胞Bel7402 VEGF表达.方法 实验以人肝癌细胞Bel7402为研究对象,分别设空白对照组、溶媒组、Rapa组、阴性对照组、阴性对照联合Rapa组、RhoC-siRNA组、RhoC-siRNA联合Rapa组,按不同实验组分别应用RhoC-siRNA、Rapa或RhoC-siRNA联合Rapa,采用RT-PCR和Western blot方法检测各实验组细胞VEGF的表达.结果 转染RhoC-siRNA 组细胞VEGF mRNA表达的抑制率为55.7%,应用Rapa组细胞VEGF mRNA表达的抑制率为17.3%,二者联合应用对VEGF mRNA表达的抑制率比单纯转染RhoC-siRNA和单纯应用Rapamycin抑制率分别提高20.3%和58.2%;转染RhoC-siRNA组细胞VEGF 蛋白表达的抑制率为53.5%(P＜0.01),应用Rapa组细胞VEGF 蛋白表达的抑制率为15.7%(P＜0.05),二者联合应用对VEGF蛋白表达的抑制率比单纯转染RhoC-siRNA和单纯应用Rapa抑制率分别提高18.4%和55.4%(P＜0.01).结论 沉默RhoC基因联合抑制mTOR蛋白,可增强对肝癌细胞Bel7402 VEGF表达的抑制,为肝癌的生物学治疗提供重要的实验依据.     

靶向FAK的siRNA对喉癌细胞增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断喉癌Hep-2细胞株中FAK基因的表达,探讨FAK基因沉默后对Hep-2细胞株产生的影响.方法 针对FAK基因,构建2条干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1和FAK-pGen-esil-CH2,1条阴性对照重组质粒FAK-pGenesil-HK;在脂质体的介导下转染喉癌Hep-2细胞株,用RT-PCR和Westem blot分析FAK mRNA及蛋白的表达;MTT法、流式细胞技术及体外侵袭实验测定十扰重组质粒对Hep-2细胞株的增殖、侵袭能力的影响.结果 重组质粒能有效地阻断Hep-2细胞株中FAK基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.05);重组质粒转染Hep-2细胞后,细胞增殖抑制率分别为58.34%、52.78%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);干扰组G0~G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少(P<0.05);FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用Hep-2细胞株48 h后,Hep-2细胞穿过Matrigel膜的个数分别为(56.0±6.7)、(51.0±5,1),与阴性对照组(152.0 ±9.4)、正常对照组(139.0 ±8.1)比较有统计学差异(P<0.05).结论 干扰重组质粒能有效地抑制转染Hep-2细胞株的FAK mRNA及蛋白的表达,并能抑制Hep-2细胞株的增殖及侵袭能力.