BMP-7/GFP融合基因在人肾小管上皮细胞的表达与定位

目的 构建骨成形蛋白-7(BMP-7)／绿色荧光蛋白(GFP)融合基因，观察其在人肾小管上皮细胞的表达与定位。方法 将小鼠BMP-7全长eDNA与GFP融合，连接进入真核细胞表达质粒pEGFP-C1中，以脂质体介导的方法将重组表达质粒pEGFP-C1-BMP-7转染入人肾小管上皮细胞。采用Western blot方法检测BMP-7在肾小管上皮细胞的表达；激光共聚焦荧光显微镜观察BMP-7在人肾小管上皮细胞中的定位情况。结果 限制性酶切以及DNA测序结果均说明所构建的重组质粒为BMP-7／GFP融合基因表达质粒。瞬时转染入肾小管上皮细胞BMP-7蛋白表达量较空载体转染组明显增加；GFP转染的细胞荧光均匀分布在整个细胞中，而pEGFP-C1-BMP-7转染的细胞荧光主要集中在细胞浆和细胞膜表面。结论 重组BMP-7／GFP融合蛋白具有GTP自发荧光的特性，且不影响BMP-7在细胞内的正确表达。     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

人类pEGFP/H2B真核表达质粒的构建及表达

目的:构建人H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒,并在HEK293细胞中表达.方法:通过RT-PCR从HEK293细胞总RNA中扩增获得H2B基因的部分cDNA序列,与载体pEGFP-C1连接构建H2B基因与GFP融合表达的真核表达质粒pEGFP/H2B,经酶切和测序鉴定;应用脂质体转染技术将重组质粒转染HEK293细胞观察融合蛋白的表达.结果:成功构建H2B基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达载体,与对照组中转染空载体pEGFP-C1的HEK293细胞中的弥漫荧光相比,转染重组质粒的细胞中可观察到绿色荧光蛋白集中表达在细胞核内,分裂期细胞中可见与染色体形态一致的绿色荧光.结论:该载体的成功构建为研究染色体的分离机制建立了有效的观察体系.     

GFP/HBV X融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在真核细胞内的表达与定位

目的:研究HPV18 E2及其N端(TAD)、C端(DBD)与GFP融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)内的表达与定位。方法:将真核表达载体pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD及pEGFP-C1分别转染MΦ,48h后用倒置荧光显微镜观察荧光情况,以确定GFP及融合蛋白的表达;以抗GFP抗体为一抗作Western blot检测相应蛋白质的表达。结果:在荧光显微镜下,4种质粒转染的细胞,pEGFP-C1组细胞内均有荧光;pEGFP-C1/E2组荧光主要在细胞核,但细胞浆也有;pEGFP-C1/DBD仅在细胞核有荧光,pEGFP-C1/TAD仅在细胞浆有荧光。Western blot检测到GFP-HPV18 E2及其突变体融合蛋白在细胞内的表达。结论:GFP-E2及其突变体融合蛋白均能在巨噬细胞内表达,且GFP-E2主要定位于细胞核,GFP-DBD定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆。     

凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位

目的:观察s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达及定位。 方法：根据s-lap基因的编码区序列, 应用PCR技术突变其3′末端终止密码子, 并通过基因重组技术将其与GFP基因融合,构建s-lap/GFP重组质粒;采用脂质体转染法, 将s-lap/GFP融合基因转入Hela细胞中, 用荧光显微镜观察其表达。 结果:s-lap/GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示, 在转染GFP基因的Hela细胞中,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内,而细胞核内低表达;在转染s-lap/GFP融合基因的Hela细胞中,荧光均匀分布于整个细胞,尤其以细胞核内高表达。 结论：s-lap/GFP融合蛋白可在人Hela细胞中表达,并主要定位于细胞核。     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

人骨形成蛋白-7基因重组腺病毒的构建及其在兔骨髓间充质干细胞中的表达

目的:克隆人骨形成蛋白-7(BMP-7)基因并构建其重组腺病毒,观察其在兔BMSc中的表达. 方法:用RT-PCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP-7基因全长cDNA并测序;将BMP-7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrack-CMV-BMP-7,经PmeI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier-1 Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP-7并酶切鉴定,PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP-7,将AdBMP-7体外感染兔BMSc后,以RT-PCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP-7基因的表达. 结果:用RT-PCR方法从胎肾组织中克隆出1296 bp的cDNA,测序证实为人BMP-7基因;酶切鉴定表明BMP-7基因已插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP-7构建成功;经293细胞包装3 d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP),氯化铯梯度离心法最终获得约3×109 efu/L滴度的重组病毒;体外感染兔BMSc后RT-PCR方法及荧光显微镜证实BMP-7基因可在兔BMSc中表达. 结论:成功克隆人BMP-7基因并构建其重组腺病毒,证实了其在BMSc的表达,为骨再生的局部基因治疗打下基础.     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的制备及在骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建骨形态发生蛋白7(BMP-7)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺病毒载体,并检测其在骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达.方法:RT-PCR法获得BMP-7基因.将其克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,PCR扩增hBMP-7/GFP融合基因片段,与线性化pAxCAwt腺病毒载体连接,转染大肠杆菌LE392,筛选重组腺病毒黏粒,大量扩增后与DNA-TPC共转HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad.hBMP-7/GFP.用重组病毒液转染兔BMSCs细胞,免疫组化方法检测BMP-7的表达.结果:经过多聚酶链反应及酶切鉴定证明获得了BMP-7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,滴度为4.4×108pfu/ml.荧光显微镜和免疫组织化学证明BMP-7在重组腺病毒转染后的BMSC细胞中得到了表达.结论:成功制备BMP-7重组腺病毒,为骨缺损局部基因治疗研究奠定基础.