柯萨奇-腺病毒受体基因的原核表达和多克隆抗体制备

目的利用原核基因工程克隆表达柯萨奇-腺病毒受体(CAR)胞外段,并制备多克隆抗体。方法从HeLa细胞中抽提总RNA,通过RT-PCR获得编码CAR胞外段的cDNA,与pQE31质粒连接,构建表达型重组质粒,测序证实后诱导表达,经Ni-NTA柱亲和纯化后,免疫新西兰兔,ELISA检测抗血清滴度。结果重组质粒转化的大肠杆菌M15经IPTG诱导表达及亲和纯化后得到滴度较高的融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot显示其分子量约为26 kd,具有特异的抗原性,主要以包涵体形式存在于菌体中。纯化的融合蛋白免疫新西兰兔后产生的抗体,经ELISA检测抗体滴度>1:32 000。结论CAR胞外段基因的克隆表达和多克隆抗体的制备,为进一步研究该受体在以腺病毒载体为基础的基因治疗中的作用及柯萨奇病毒的致病机制奠定了基础。     

人源性exCAR蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

目的 在大肠杆菌中表达人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区蛋白(exCAR),纯化表达蛋白并进行Western-blotting鉴定.方法 从Hela细胞株中扩增exCAR基因片段,连接至表达质粒pET-28a(+)构建为重组质粒pET-28a-exCAR,转化至大肠杆菌BL21株中,筛选高表达株,诱导表达,利用Ni+株亲和纯化表达蛋白,SDS-PAGE后,转印PVDF膜后,进行Western-blotting鉴定.结果 获得纯化的大肠杆菌表达蛋白exCAR,表达形式为包涵体,经Western-blotting鉴定为人源性exCAR蛋白.结论 本研究获得了纯化的exCAR表达蛋白,为下一步的蛋白复性和腺病毒感染的阻断实验提供了基础.     

Tum5蛋白多克隆抗体的制备及纯化

目的制备Tum5蛋白多克隆抗体并纯化。方法利用pQE30-Tum5重组质粒在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗Tum5多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度,亲和层析法纯化兔抗Tum5多克隆抗体。结果利用pQE30-Tum5重组质粒,经原核表达和亲和层析获得Tum5蛋白;利用Tum5蛋白制备多克隆抗体,纯度大于95%。结论利用原核表达的Tum5蛋白成功地制备了兔抗Tum5多克隆抗体。     

柯萨奇病毒A16型VP1~VP4基因克隆及其表达产物的抗原相关性分析

目的克隆并表达柯萨奇病毒A16型VP1~VP4蛋白基因,初步分析其抗原相关性。方法抽提病毒RNA,经RT-PCR方法
分别扩增出VP1~VP4蛋白基因片段,经克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物经8mol/L尿素洗涤及镍柱亲和层析纯化后,
用柯萨奇病毒A16型病毒免疫兔血清及肠道病毒71型病毒免疫兔血清对重组蛋白进行Western blotting及ELISA分析其抗原
相关性及交叉反应性。结果成功构建的重组质粒pQE30a/VP1~VP4并经IPTG诱导,重组蛋白VP1~VP4高效表达并纯化成
功,经Western blotting及ELISA证实重组蛋白VP1~VP4可以被CVA16免疫兔血清特异识别,部分与肠道病毒71型免疫血清存
在交叉反应。结论在大肠杆菌M15中高效表达出柯萨奇病毒A16型VP1~VP4蛋白,经纯化产物具有较强的抗原反应性。
     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

柯萨奇病毒B组3型VP1基因真核表达重组质粒的构建及免疫效果

目的构建柯萨奇病毒B组 3型 (CoxsackievirusesgroupB3,CVB3)VP1基因的真核表达重组质粒pcDNA3/VP1,并观察它对小鼠的免疫保护作用。方法从CVB3感染细胞中扩增出VP1片段 ,构建真核表达重组质粒 pcDNA3/VP1,经大量扩增纯化后 ,肌内注射免疫BALB/c小鼠 ,每次免疫后的第 6天 ,断尾取血检测CVB3中和抗体 ;3次免疫后用致死量 (10 0 0TCID50 )的CVB3感染小鼠 ,观察 pcDNA/VP1对小鼠的免疫保护作用。 结果pcDNA3/VP1重组质粒免疫小鼠后 ,能诱导机体产生中和抗体 ,各次免疫后抗体滴度分别为 <1∶5 ,1∶5 .7和1∶34.8;用致死量CVB3感染小鼠 ,pcDNA3/VP1重组质粒免疫组、pcDNA3质粒对照组及生理盐水对照组生存率分别为 30 %、2 0 %及 15 % ,3组小鼠生存率无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 pcDNA3/VP1重组质粒在小鼠体内能够表达并能诱导机体产生中和抗体 ,抗体滴度随免疫次数增加 ,但免疫小鼠对致死量的CVB3感染无明显保护作用     

柯萨奇-腺病毒受体在扩张型心肌病患者外周血白细胞表面的表达及意义

目的观察柯萨奇-腺病毒受体（CAR）在扩张型心肌病（DCM）患者外周血白细胞表面的表达及意义。方法选择DCM患者50例作为观察组,同期选择30例正常体检者作为对照组。入选后分别采用流式细胞术（FCM）检测外周血白细胞表面CAR表达水平;RT- PCR技术测定柯萨奇B组病毒-核糖核酸（CVB- RNA）表达;ELISA法检测CVB抗体效价。在客观比较病毒检测方法的同时,分析CAR在DCM患者中的表达及意义并探讨FCM在临床病原学检测中的价值。结果（1）经FCM技术检测,观察组外周血白细胞表面CAR表达水平较对照组升高（P＜0.01）,观察组CVB- RNA阳性22例（44.0%）,对照组阳性6例（20.0%）,差异有统计学意义（P＜0.05）;观察组CVB抗体阳性32例（64.0%）,对照组阳性10例（33.3%）,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）CVB- RNA阳性者中外周血白细胞表面CAR表达水平较阴性者明显升高（P＜0.01）;22例CVB- RNA阳性者中CVB抗体全部阳性,而28例CVB- RNA阴性患者中CVB抗体阳性者亦有16例。结论外周血白细胞表面CAR高表达的DCM患者可能存在病毒持续感染;FCM技术检测白细胞表面CAR表达水平可以作为DCM患者病毒感染的定量指标。     

柯萨奇-腺病毒受体不同胞内功能域缺失突变载体的构建与表达

背景与目的：柯萨奇-腺病毒受体（Coxsackie and adenovirus receptor,CAR）是具有复杂生物学功能的黏附分子,已被证实与多种肿瘤的发生和转移有关,但具体作用机制还不清楚。本研究以CAR蛋白结构的功能解析作为切入点,构建不同CAR胞内域缺失突变的表达载体。方法：利用定点缺失突变策略构建了CAR胞内PKC、CK2、TYR磷酸化位点的缺失突变体及胞内域完全缺失的突变体pTOPOTailless。利用三步PCR法扩增获得CAR胞内段不同突变体的基因片段后,将其克隆入真核表达载体 pcDNA3.1/V5/His,通过双酶切及测序进行鉴定后,采用脂质体法分别转染至低表达CAR的人卵巢癌细胞系SKOV3细胞中,并用Werstern blot检测细胞转染后CAR的表达水平。结果: CAR胞内段不同突变载体成功构建。各突变体转染SKOV3细胞后,其蛋白表达水平均显著增加。结论: 成功构建不同CAR胞内功能域缺失突变表达载体,并在卵巢癌细胞SKOV3获得了满意的表达,为后续研究CAR及其胞内不同功能域在卵巢癌中的作用机制提供了研究基础。     

柯萨奇-腺病毒受体在外周血不同类型白细胞的表达

目的 探讨柯萨奇-腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)在外周血不同类型白细胞的表达情况及性别对CAR表达的影响。方法 用流式细胞仪检测外周血淋巴细胞、粒细胞及单核细胞CAR的平均荧光强度。结果 流式细胞分析表明，男性白细胞CAR的平均荧光强度明显高于女性，差异具有高度统计学意义；淋巴细胞、粒细胞及单核细胞CAR的平均荧光强度变化无统计学意义。结论 外周血白细胞CAR表达具有性别差异，但无类别差异，流式细胞术是检测白细胞CAR表达的一种有效的方法。     

人源性exCAR原核表达蛋白体外阻断腺病毒感染实验研究

目的 在培养乳鼠心肌细胞上检测人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区(exCAR)大肠杆菌原核表达蛋白阻断腺病毒感染的活性.方法 纯化人源性exCAR表达蛋白并通过透析复性,进一步体外实验,在腺病毒感染乳鼠心肌细胞模型上检测表达蛋白阻断腺病毒感染效率.结果 获得纯化表达蛋白exCAR,经复性后,在体外实验中检测到其阻断腺病毒感染心肌细胞效应,其终浓度为500ng/mL时,获得最高阻断效率约75%.结论 本研究获得了具有生物活性的exCAR表达蛋白,为腺病毒感染防治提供了新的思路和基础.     

经络腧穴理论的形成与发展

从<脉书·十一脉><黄帝内经>等文献人手,梳理了血气、经络、腧穴理论的形成与发展,简要介绍了四肢部的基本腧穴、躯体部要穴,以及腧穴配伍的基本要义.     

教考合一与教考分离的统一——医学基础课综合性考试模式初探

考试是检验教学效果的有效方法,是教学过程中不可缺少的环节。多年来,人们对考试改革不断进行探索,总结出不同的考试模式,例如教考合一与教考分离就是2种完全不同的考试模式。通过对比2种考试模式的优势与劣势,提出适合医学基础课的综合性考试模式。     

“医信融创”教育模式的构建与实践探索

从必要性、要求及实质3个角度梳理了“医信融创”教育的内涵,并在此基础上探索“医信融创”教育的模式。“医信融创”需要遵循由“融”到“创”的逻辑主线,通过“融行-融智-融心”的过程最后走向“创新”的目的。最后以山西医科大学的实践案例证明了“医信融创”教育的必然性和可行性。     

神经病学与神经解剖学优化整合的评价与分析

目的评价神经病学与神经解剖学优化整合教学法的教学效果,寻找存在的问题及解决对策,为今后的神经病学教学改革提供参考。方法采用问卷调查、访谈的方式,分析神经病学教改后的教学效果、对学生学习态度的影响、教学中存在的不足。结果教改班的教学效果、对学生学习态度的改善优于非教改班(P<0.01)。结论神经病学与神经解剖学优化整合的教学改革效果显著,达到了预期的目的。     

载脂蛋白的结构和功能与病毒病的预防和治疗

载脂蛋白（apo）是脂蛋白的重要组成成分,其主要功能是调节酶活性,介导细胞受体与脂蛋白结合,保持脂蛋白结构的稳定性。目前已发现数十种载脂蛋白,其结构的显著特点是分子中具有多个双性alpha螺旋及Beta-折叠结构。载脂蛋白的这种双性alpha螺旋结构是其结合及转运脂质的结构基础。在HIV外壳结构中的一种糖蛋白（gP）也具有这种alpha螺旋结构。近年研究表明,载脂蛋白和由载脂蛋白组成的脂质体还具有抗肝炎病毒、抗HIV病毒、抗单纯疱疹和中和细菌内毒素的功能。以脂蛋白和载脂蛋白为主要成分构成的脂质体已成为运载抗病毒和抗肿瘤药物受体的靶向性载体。     

析议痰瘀同源、互结、同治

目的:探讨痰瘀相关,意在梳理痰瘀知识、并强调痰瘀相关的重要性。方法:通过多角度地分析、刍议"痰瘀同源"、"痰瘀互结"、"痰瘀同治"等痰瘀经典理论的方式论述痰瘀相关。结果:痰与瘀是中医界里重要的元素,痰与瘀互结是许多疾患共同的病机,痰瘀同治是常用治法。结论:痰瘀同源、互结、同治,不但在临床上有着实用的指导意义,又能与时俱进、在探究中创新。     

躯体形式障碍患者医疗费用及相关因素

目的 了解消化科门诊躯体形式障碍诊疗费及相关因素.方法 对87例消化科门诊躯体形式障碍患者采用既往检查调查表(自编)、症状自评量表(SCL-90)进行评估.结果 患者既往检查总费用212-28652元(中位数为3792元),检查频率为5-82次,检查项目为3-11项,重复检查频率为3-72次,检查项目为血常规、彩超、X线、内窥镜、MRI、粪常规,重复度高的项目为彩超、内窥镜、X线、MRI.检查频度与病程、性别、年龄、文化程度有相关性,检查费用与检查频度呈正关(P<0.01).结论 消化科门诊躯体化障碍患者检查项目多,频度高,医疗花费多.     

解剖学与中医理论的隔阂与融合(上)

分析了解剖学与中医理论发展的历史关系。指出古代的解剖在构建了中医基础理论之后逐步走向式微,中医理论与解剖学之间的隔阂在近代达到顶峰。这种隔阂是一种历史性的结果,随着历史条件的改变,中医理论可以实现与解剖学的融合,从解剖脏器非对称特征中蕴含的阴阳规律具体论证了这一问题。在现代条件下,对解剖的反思和排斥已不具有积极意义,建立中医理论的形态学基础是中医理论发展的必然。     

解剖学与中医理论的隔阂与融合(下)

4 解剖脏器非对称特征中的阴阳规律显示出中医理论在新的历史条件下可以实现与解剖的融合 中医学认识解剖结构问题，当然要从自己的基本理论出发，最重要的首先是阴阳，同时要以确切的现代解剖内容为客观研究对象。就阴阳和解剖的关系这一具体问题而言，内脏基本结构的非对称性符合阴阳规律，中医理论在新的历史条件下可以实现与解剖的融合，从而为未来进一步的发展奠定新的基础。     

卵巢子宫内膜样癌的CT、MRI诊断与病理分析

目的：探讨卵巢子宫内膜样癌（OEC）的CT、MRI表现及病理基础。方法：回顾性分析经手术病理证实的8例OEC的CT、MRI表现,并与手术和组织病理学结果进行对照分析。结果：8例OEC位于左侧5例,右侧3例。肿瘤最大径4．5～17．5cm,平均9．2cm。全部肿瘤均呈囊实性,6例形态不规则呈分叶状,2例呈圆形或卵圆形。肿瘤边界部分模糊7例,清楚1例。CT平扫：肿瘤实性成分cT值37～46Hu,平均4lHu,囊性成分cT值14～40Hu,平均25Hu;增强后肿瘤实性成分呈中等程度强化,动脉期cT值6l～77HIJ,平均66Hu,实质期cT值65～78HU,平均71HU。MR平扫：T2wI实性成分呈等信号,囊性成分呈低信号,T2wI实性成分呈稍高信号,囊性成分呈高信号,增强后肿瘤实性成分中等程度强化。8例OEC中合并子宫体内膜癌2例,其中l例经MRI检查,表现为子宫体部内膜不规则增厚,T2wI呈等信号,TnwI呈稍高信号,增强后呈中等程度强化,1例合并同侧卵巢巧克力囊肿。结论：CT、MRI能较好地反映OEC的病理特征,清晰显示肿瘤的形态、内部结构及邻近结构侵犯等情况,具有重要的定性价值,并为临床选择合理治疗方案提供依据。