Experimental studies on precartilaginous stem cells cultured withβ-tricalcium phosphate scaffold in vitro

目的 观察免疫磁珠分选的骨骺干细胞(PSCs)诱导后向软骨特性方向分化并与多孔β-磷酸三钙(β-TCP)材料复合体外培养,探讨其构建组织工程化骺板的可行性.方法 免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs体外培养并用免疫细胞化学方法对其进行鉴定,诱导其向软骨细胞特性方向分化,免疫荧光染色及甲苯胺兰染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨特征基质表达情况.诱导后的PSCs与多孔β-磷酸三钙支架复合培养后扫描电镜观察其粘附增殖及形态学改变.结果 免疫磁珠系统分选的PSCs体外培养增殖迅速,阳性细胞率超过90％,诱导后的PSCsⅡ型胶原免疫荧光染色及甲苯胺兰染色阳性.细胞接种支架后在多孔β-磷酸三钙支架表面生长增殖良好并分泌细胞外基质.结论 免疫磁珠分选系统分离的PSCs经诱导后向软骨细胞功能方向分化,与多孔β-磷酸三钙支架复合有望构建组织工程化骺板.     

六个转录因子将人脐带间充质干细胞高效重编程为诱导性多能干细胞的实验研究

目的 建立人脐带间充质干细胞(HuMSCs)来源的诱导性多能干细胞(iPSC)系.方法 以慢病毒载体将OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个转录因子转入HuMSCs使其重编程为iPSC.通过形态学观察、多能细胞特异性标志检测、碱性磷酸酶(AKP)染色、核型分析、拟胚体形成、体内成瘤实验鉴定获得的iPSC.结果 慢病毒感染后第4天,HuMSCs逐渐变成类圆形,第10天开始出现不规则细胞团,第14天出现较大的细胞团,约1.25％的细胞重编程为iPSC.建系后iPSC呈典型的克隆状生长,边缘清晰,内部细胞细小,排列紧密;AKP染色阳性;表达多能性相关基因及胚胎干细胞特异性蛋白;细胞核型正常(46,XY);体内外均能向3个胚层方向分化.结论 慢病毒携带OCT4、SOX2、KLF4、c-Myc、NANOG、LIN-28 6个因子能将HuMSCs高效诱导为完全重编程的iPSC.     

应用5-杂氮脱氧胞苷诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的体外研究

目的 探讨5-氮杂脱氧胞苷(5-AzaC)体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化的可行性.方法 B超引导下穿刺抽得孕中期羊水,体外分离、培养得到羊水来源间充质干细胞,传代后计数细胞并绘制生长曲线.体外成骨、成脂诱导观察人羊水来源间充质干细胞多向分化能力.采用5-AzaC对羊水来源间充质干细胞成肌诱导2周,观察细胞形态学变化,RT-PCR、免疫荧光染色方法鉴定成肌细胞特异mRNA及蛋白表达.结果 人羊水来源间充质干细胞体外培养后迅速进入对数生长期,培养7 d未达到平台期.茜素红和油红O染色证实人羊水来源间充质干细胞可诱导分化为成骨、成脂细胞样细胞.人羊水来源间充质干细胞经5-AzaC诱导2周逐渐变长梭形.而对照组细胞呈扁平多角形.免疫荧光染色及RT-PCR结果提示实验组细胞表达肌结蛋白(Desmin)、肌钙蛋白I(Tn I)、横纹肌辅肌动蛋白(α-Actinin)及mRNA;对照组呈阴性.结论 人羊水来源间充质干细胞体外增殖能力强,能分化为成骨、成脂细胞样细胞.5-AzaC能在体外诱导人羊水来源间充质干细胞向成肌细胞样细胞分化.     

婴幼儿血管瘤内皮细胞的体外培养及冻存

目的 研究婴幼儿血管瘤内皮细胞的体外分离培养及进行冷冻保存,探讨建立血管瘤内皮细胞库的可能性.方法 应用胶原酶消化结合免疫磁珠法分离获得血管瘤内皮细胞,以含20%胎牛血清的EGM-2培养液进行培养.vWF免疫荧光染色鉴定所培养内皮细胞及其纯度.按慢冻速融原则对血管瘤细胞进行液氮冻存、复苏,比较未冻存和复苏血管瘤内皮细胞的活力、形态、增殖能力、低密度脂蛋白摄取能力以及细胞凋亡率.结果 CD31免疫磁珠阳性分选获得高纯度的原代血管瘤内皮细胞,复苏后细胞存活率约为未冻存细胞的94.8%,二组细胞形态学无明显差异,生长曲线相似,增殖能力差异无统计学意义,冻存内皮细胞的凋亡率较未冻存细胞高,但无统计学意义.结论 胶原酶消化结合免疫磁珠法能获得高纯度的血管瘤内皮细胞,冻存的血管瘤内皮细胞复苏后仍保持较高的活力及体外增殖能力,为血管瘤的后续实验研究提供了稳定的细胞来源.     

羊水作为间充质干细胞来源的可行性研究

目的探讨孕中期羊水作为胎儿间充质干细胞(MSCs)来源的可行性。方法采用机械手段挑取孕中期羊水培养体系中类成纤维细胞的MSCs集落,体外培养扩增,观察细胞生长特性,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达及细胞周期,RT-PCR检测Oct-4、SCF、M-CSF、FL细胞因子的表达。结果用机械手段挑取出的细胞接种1~2d后贴壁,形态呈梭形,7~8d融合呈成纤维细胞状。体外扩增原代可获得(4~6)×106个细胞,10代可获得(1~5)×1012个细胞,10代后细胞增殖能力下降。流式细胞仪检测结果显示:CD44表达阳性,CD34、CD45、HLA-DR不表达。RT-PCR检测结果显示:胎儿MSCs表达Oct-4、SCF、M-CSF、FL细胞因子。结论采用机械手段可从孕中期羊水培养体系中挑取出胎儿MSCs,与其他来源的MSCs特点相符,孕中期羊水可以作为一种新的胎儿间充质干细胞(MSCs)来源。     

酶消化法分离脐带干细胞

目的 研究酶消化法从脐带组织中分离干细胞的可能性,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源.方法 采用胶原酶胰酶消化新鲜脐带组织,将获得的细胞传代培养,观察基本生物学特性,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,以不同方法将其向骨、脂肪和心肌细胞方向诱导,分别采用Von Kossa、油红O染色和免疫组织化学染色对分化的细胞进行鉴定.结果 新鲜分离的脐带细胞在培养72h后,开始贴壁,传代培养后,细胞逐渐纯化,流式细胞仪分析这些细胞表达CD13、CD29、CIN4、CD90、CD105、CD166和MHC-Ⅰ,而不表达CD31、CD34、CD45、CD106和MHC-Ⅱ.在成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性.在5-氮胞苷诱导4周后,免疫组织化学染色心肌特异性抗体肌动蛋白a-actin和肌钙蛋白T阳性.结论 脐带组织中含有丰富的干细胞,酶消化法能够成功分离出脐带干细胞.     

新生大鼠肺泡Ⅰ型细胞的原代培养及鉴定

目的探讨新生大鼠肺泡Ⅰ型上皮细胞(AECⅠ)的分离、纯化及原代培养方法,为主要以AECⅠ损伤为特征的肺部疾病研究提供模型。方法采用弹性蛋白酶联合胶原酶Ⅰ的消化方法,分离肺组织细胞,然后用肺Ⅰ型上皮细胞顶膜蛋白α(T1-α)单克隆抗体及免疫磁珠进行阳性选择的方法纯化AECⅠ,最后进行原代培养;通过锥虫蓝染色检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞生长及形态特征,细胞免疫荧光法检测细胞表面特异性抗原的表达。结果每只鼠可获得AECⅠ(1.4±0.4)×106个,纯度90.5%±3.4%,活力93.4%±3.0%。接种于玻璃培养皿48h后倒置显微镜下观察细胞开始粘附伸展,呈克隆样生长,在4～6天时汇合成薄的单层状。免疫荧光显微镜观察新鲜分离的AECⅠ特异标志物水通道蛋白-5(AQP5)阳性,呈现绿色荧光;AECⅡ标志物前表面活性蛋白C(proSP-C)阴性;培养后的AECⅠ免疫荧光染色呈AQP5阳性。结论利用弹性蛋白酶联合胶原酶Ⅰ消化,免疫磁珠进行阳性选择的方法可成功分离出高产量、高纯度的鼠AECⅠ,能满足体外进一步对AECⅠ生理功能的研究,也可为研究AECⅠ损伤修复机制提供细胞培养的模型。     

孕中期羊水来源胎儿间充质干细胞体外诱导为平滑肌细胞的研究

目的探讨孕中期羊水来源的胎儿间充质干细胞（MSC）体外诱导为平滑肌细胞的可能性。方法通过超声引导下羊膜腔穿刺获取人孕18～22周羊水，分离细胞，体外培养传代，机械方法挑取MSC克隆，体外扩增，流式细胞仪检测MSC表面抗原表达，以0．01ng／ml、0．1ng／ml、1ng／ml和10ng／ml浓度的转录生长因子B（TGF-β）分别诱导第3代Msc28d，免疫组化染色检测各浓度TGF-β诱导后a—Actin在细胞内表达情况，透射电镜观察1ng／mlTGF-β诱导28d后细胞内肌丝含量，激光共聚焦显微镜测定该浓度组细胞在乙酰胆碱刺激下细胞内液钙离子浓度的变化。结果羊水来源的胎儿MSC在体外培养体系中增殖迅速，流式细胞仪检测结果显示CD44表达阳性，CD34、CD45和HLA—DR阴性。经1ng／mlTGF-β诱导28d后，细胞形态呈长梭形平滑肌样，融合后细胞分布形成特征性的“峰”和“谷”状，同时表达平滑肌细胞特异性蛋白标志α—Actin，细胞内出现黑色棒状肌丝，激光共聚焦显微镜显示该浓度TGF-β诱导后细胞内液钙离子基础值明显高于未诱导的细胞，在乙酰胆碱刺激下，细胞内液钙离子呈波峰样释放。结论羊水来源的胎儿MSC在体外可以定向分化为平滑肌细胞。     

神经母细胞瘤循环肿瘤细胞分离与鉴定方法的建立及临床应用

目的建立一种神经母细胞瘤(NB)循环肿瘤细胞(CTCs)的分离和鉴定方法,初步探讨其测定NB患者CTCs的临床价值。方法应用CD56免疫磁珠阳性分选结合免疫荧光染色方法,对IMR32细胞和20例非血液肿瘤疾病患儿的外周血样本进行处理,通过统计捕获到的DAPI~+/GD2~+/CD45~-细胞数目,计算该方法分离和鉴定NB细胞的敏感性和特异性;检测12例初发晚期NB患儿治疗前及2疗程化疗后外周血中的CTCs数量。结果 10个以内IMR32细胞组,CTCs捕获的敏感性为(80±6.73)%;10～100个IMR32细胞组,CTCs捕获的敏感性为(79.14±3.97)%。20例非血液肿瘤疾病患儿的外周血中均未检测到DAPI~+/GD2~+/CD45~-细胞的存在,提示该方法捕获CTCs的特异性为100%。12例Ⅲ期或Ⅳ期NB患儿,治疗前有9例检测出CTCs,阳性率为75%;化疗2个疗程后,9例患儿CTCs数目均有不同程度减少,该动态变化趋势与患儿血清NSE水平、24h尿VMA水平及骨髓MRD变化相吻合,而影像学评估显示3例为部分反应(PR),6例为混合反应(MR),3例无反应(NR)。结论免疫磁珠阳性分选结合免疫荧光染色的方法对于NB患儿CTCs的捕获具有良好的敏感性和特异性,CTCs数目动态变化比影像学检测可更灵敏地反映疗效,该方法为进一步探讨CTCs在NB儿童疗效评估及复发风险预测中的价值提供了技术手段。     

神经细胞粘附分子及OCT-4蛋白在隐睾中的病理表达及意义

目的 探讨神经细胞粘附分子(NCAM)及转录因子OCT-4在人隐睾中的病理表达及意义.方法 48例隐睾患儿,年龄6个月～13.1岁,平均3岁,单侧43例,双侧5例,共50个隐睾组织活检样本.免疫组化法检测生精小管和间质内NCAM、OCT-4的表达情况.结果 50个样本中,NCAM生精小管内阴性、睾丸间质细胞(Lc)阳性、OCT-4阴性的牛理规律表达率为38%(19/50).NCAM牛精小管、Lc中病理表达率为58%(29/50).NCAM生精小管内阳性病理表达率为30%(15/50),与年龄、睾丸位置无相关性(P>0.05).NCAM于Lc内阴性病理表达率为32%(16/50),与睾丸位置无相关性(P>0.05),但随年龄增加,阳性表达率增加(P<0.05).OCT-4阳性病理表达率为12%(6/50),与睾丸位置无相关性(P>0.05).结论 NCAM和OCT-4在隐睾中的病理性表达反映了生殖母细胞的迁移分化障碍或延迟,可以被作为预测隐睾生殖潜能和癌变趋势的可靠分子标志物.