siRNA干扰MT1H基因对A549/DDP细胞耐药性的逆转

目的：探讨siRNA干扰金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因逆转A549/DDP细胞耐药的可行性。方法：采用RT-PCR方法检测MT1H基因在A549和其顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达;将针对MT1H的siRNA导入A549/DDP细胞;用RT-PCR和斑点印迹方法分析MT1H基因表达情况;MTT法观察细胞顺铂耐药性;TUNEL、流式细胞术检测顺铂诱导细胞凋亡率;免疫细胞化学分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达。结果：MT1H在A549/DDP细胞中高表达但不在A549细胞中表达;A549/DDP细胞转染48 h后,与对照组比较,MT1HsiRNA转染组MT1H mRNA和蛋白表达均明显下调,细胞对DDP的药物敏感性明显提高,DDP诱导凋亡率明显增加,Bcl-2表达明显下降,Bax表达无变化。结论：MT1H基因沉默能降低Bcl-2表达,增强顺铂对A549/DDP细胞凋亡诱导作用,有效逆转A549/DDP细胞耐药。     

RNA干扰GRP75表达改善人肺腺癌细胞对顺铂耐药性

背景与目的 GRP75(glucose regulated protein75)属于热休克蛋白(hot shock protein,HSP)家族,是一种主要位于线粒体的分子伴侣,在某些耐药的肿瘤细胞中高表达。本研究通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默GRP75基因的表达,观察下调GRP75的表达对肿瘤细胞耐药性的影响并探讨GRP75在肿瘤细胞耐药机制中的作用。方法以顺铂为诱导药物,人肺腺癌细胞系A549为诱导对象,采用逐步增加剂量与大剂量冲击相结合的方法,诱导建立耐顺铂细胞株A549/CDDP。分别将包裹GRP75-shRNA和不含干扰序列的慢病毒转染A549和A549/CDDP细胞,在荧光显微镜下观察各组细胞转染率,应用M比色法检测干扰前后各组细胞对顺铂的敏感性,应用Western blot检测干扰前后各组细胞GRP75、p53、bcl-2的表达。结果各组细胞感染效率均在90%以上,转染后A549/CDDP和A549细胞中GRP75的表达均明显下调(P<0.05)。转染前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药指数分别为21.52和4.14。转染后A549/CDDP细胞内p53的表达上调(P<0.05),bcl-2表达下调(P<0.05)。结论 GRP75是A549细胞对顺铂耐药机制的相关蛋白之一,其在耐药机制中的作用与其对p53和bcl-2的调控有关。     

微RNA-524-5p通过靶向抑制SOX9基因表达增加胃癌细胞的顺铂敏感性北大核心CSCD

目的:探讨微RNA-524-5p(microRNA-524-5p,miR-524-5p)介导顺铂治疗胃癌的作用机制。方法:采用实时荧光定量PCR法检测胃癌组织、癌旁组织以及顺铂耐药和亲本胃癌细胞系中miR-524-5p的表达水平。顺铂耐药性胃癌SGC-7901和MKN-45细胞经miR-524-5p模拟物或对照RNA转染后,采用CCK-8法检测细胞活力。采用荧光素酶报告基因实验和蛋白质印迹法鉴定miR-524-5p靶向蛋白SOX9(SRY-related high mobility group-box 9)的表达情况。采用'拯救'实验检测SOX9过表达后miR-524-5p诱导胃癌细胞对顺铂的耐药性变化。结果:与正常胃上皮黏膜细胞GES1相比,胃癌细胞SGC-7901和MKN-45中miR-524-5p水平明显下调(P值均<0.05);与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-524-5p水平明显下调(P <0.05)。与敏感性亲代细胞相比,顺铂处理后的胃癌耐药细胞SGC-7901和MKN-45中miR-524-5p表达水平均降低(P值均<0.05)。miR-524-5p模拟物转染后,顺铂耐药性胃癌细胞SGC-7901和MKN-45的化疗敏感性均明显增强(P值均<0.05)。SOX9是miR-524-5p的功能靶蛋白;SOX9过表达可以抵消miR-524-5p的化疗增敏作用,即与单独miR-524-5p模拟物转染组相比,SOX9过表达质粒+miR-524-5p模拟物转染后的胃癌细胞SGC-7901和MKN-45对顺铂的敏感性均明显降低(P值均<0.05)。结论:miR-524-5p影响人胃癌细胞对顺铂作用的敏感性,提示其可能成为治疗化疗耐药性胃癌患者的新靶点。     

上调p38表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性

目的研究p38在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法构建p38正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球体,RT-PCR及Western blot分析p38表达;CCK-8细胞毒性试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果（1）多细胞球体p38表达低于单层细胞。（2）FACS检测转染p38真核表达载体的多细胞球体经顺铂作用后,细胞凋亡率高于转染空载体和未转染的多细胞球体;（3）CCK-8细胞毒性试验示转染p38真核表达载体的多细胞球体相对于转染空载体和未转染的细胞球体对顺铂敏感性更高。结论p38介导顺铂对卵巢癌化疗耐药,上调p38表达,可提高卵巢癌多细胞球体对顺铂的敏感性。     

蛋白激酶B抑制线粒体Smac释放与卵巢癌顺铂耐药的关系

目的 探讨蛋白激酶B(Akt)和线粒体促凋亡蛋白(Smac)在顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡中的关系及Akt在卵巢癌顺铂耐药中的分子机制.方法 应用Western blot检测顺铂作用前后卵巢癌顺铂敏感细胞OV2008、A2780s和顺铂耐药细胞C13*、A2780cp中Smac含量.将Smac siRNA和Smac N7多肽分别导人0V2008和C13*细胞中,应用流式细胞仪测定细胞的凋亡率,观察稳定转染Akt2的A2780s(A2780s-AAkt2)细胞和转染Akt1/2siRNA的C13*细胞对顺铂耐药性的改变.结果顺铂能导致OV2008、A2780s细胞线粒体释放Smac,并引起细胞凋亡(P＜0.05);但在C13*和A2780cp细胞中无此反应(P＞0.05).转染Smac siRNA后的0V2008细胞,其Smac表达降低,对顺铂的耐药性增加;转染Smac N7多肽能增加C13*细胞对顺铂的敏感性;Akt2过度表达可抑制A2780s细胞Smac释放,并对顺铂产生了耐药性;应用Akt1/2 siRNA后可下调C13*细胞中Akt1/2的表达,使C13*细胞对顺铂的敏感性增加.结论 顺铂对卵巢癌细胞的杀伤在一定程度上是通过线粒体释放Smac所致;Akt抑制了线粒体Smac释放与卵巢癌化疗耐药部分相关.     

运用saRNA激活p21基因表达上调对肺癌细胞生长及化疗敏感性的影响

目的：探讨利用针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21WAF1/CIP1（p21）的基因启动子的saR-NA（dsp21-322）特异激活p21基因的表达对肺癌细胞生长及耐药的影响。方法：化学合成针对p21启动子区的saRNA,将其转染非小细胞型肺癌细胞系A549,利用RT-PCR技术及Western blotting技术检测细胞中p21表达情况,进而观察p21表达改变后细胞凋亡情况及对顺铂药物敏感性的影响。结果：在转染dsp21-322的A549肺癌细胞中,p21的mRNA和蛋白的表达均有所上调。p21表达的上调可引起A549细胞生长的的明显抑制并可增强其对顺铂的化疗敏感性。结论：p21基因在肺癌药物耐药性的过程中发挥了作用,为应用saRNA上调抑癌基因治疗肿瘤提供了新的思路。     

运用saRNA激活p21基因表达上调对肺癌细胞生长及化疗敏感性的影响

目的:探讨利用针对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21WAF1/CIP1(p21)的基因启动子的saRNA (dsp21-322) 特异激活p21基因的表达对肺癌细胞生长及耐药的影响.方法:化学合成针对p21启动子区的saRNA,将其转染非小细胞型肺癌细胞系A549,利用RT-PCR技术及Western blotting技术检测细胞中p21表达情况,进而观察p21表达改变后细胞凋亡情况及对顺铂药物敏感性的影响.结果:在转染dsp21-322的 A549肺癌细胞中,p21的mRNA和蛋白的表达均有所上调.p21表达的上调可引起A549细胞生长的的明显抑制并可增强其对顺铂的化疗敏感性.结论:p21基因在肺癌药物耐药性的过程中发挥了作用,为应用saRNA上调抑癌基因治疗肿瘤提供了新的思路.     

封闭ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响

目的:探讨通过封闭ERCC1基因表达干扰DNA损伤修复路径及其对卵巢癌细胞对铂类药物耐药性的影响.方法:构建ERCC1基因反义表达载体,转染人卵巢癌细胞A2780及A2750/CP70,采用Northern杂交及Western Blot分析人卵巢癌细胞内ERCC1基因RNA及蛋白表达水平变化;利用荧光素酶报告基因系统观察宿主细胞对DNA损伤的修复作用;采用MTT实验研究细胞对铂类药物耐药性的影响.结果:卵巢癌细胞转染反义ERCC1基因后,ERCC1基因转录水平、蛋白表达水平明显下降.荧光素酶报告基因系统结果证明,宿主细胞的DNA修复活性下降.MTT实验表明,伴随ERCC1基因表达水平下降,细胞对顺铂的耐药性降低.结论:转染ERCC1反义基因显著影响宿主细胞的核苷酸切除修复,影响细胞对顺铂的耐药性.     

AKT2通过调控p27表达逆转卵巢癌顺铂耐药

目的：探讨上皮性卵巢癌中蛋白激酶B beta（v-akt murine thymoma viral oncogene homolog2，AKT2）与p27在卵巢癌多细胞球体顺铂耐药中的作用。方法：三维培养获得人卵巢癌多细胞球体（multi—cellular spheroids，MCS）；Western印迹法分析p27及AKT2表达；构建AKT2干扰载体，脂质体法转染A2780细胞后三维培养形成多细胞球体，不同浓度顺铂处理后通过FCM法检测细胞凋亡，MTT法比较细胞对顺铂的敏感性。结果：Western印迹法结果提示，MCS中AKT2及p27的表达高于单层细胞；转染AKT2干扰载体（shRNA—AKT2）的MCS中AKT2、p27表达量较未转染MCS及转染空载体的MCS明显降低。流式细胞仪分解结果表示，不同浓度顺铂作用后，MCS凋亡率明显低于单层细胞；转染shRNA—AKT2的细胞球凋亡率较未转染MCS及转染空载体的MCS升高。MTT法示瞬时转染shRNA—AKT2的细胞球顺铂对细胞抑制率较未转染MCS及转染空载体的MCS升高。结论：干扰AKT2可降低p27的表达，从而逆转卵巢癌对顺铂的化疗耐药。     

p73基因过量表达对人肺癌细胞A549凋亡及其化疗敏感性的作用

背景与目的：部分非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）表达野生型p53基因（wild-type p53,wt-p53）,因此在基因治疗中克服这些NSCLC对wt-p53的抵抗机制就非常重要。P53基因家族的新成员p73是p53的同源体,本研究旨在探讨对wt-p53基因治疗抵抗的人肺腺癌细胞A549在外源p73基因转染或联用化疗药后凋亡程度和对化疗药物敏感性的变化。方法：将真核表达重组质粒pcDNA3-HA-p53或pcDNA3-HA-p73α转染入A549细胞,G418筛选,Western blot检测P53或P73α的表达。MTT法分析转染细胞对顺铂和阿霉素的敏感性,用流式细胞术、TUNEL法和DNA片段法分析化疗药作用下转染细胞的凋亡变化,克隆形成实验观察细胞生物学性状的改变。结果：转染p53或p73α基因的A549细胞可以稳定高表达p53或p73α蛋白。转染p73α的A549细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度（6．25μmol／L的顺铂或0．25μmol／L的阿霉素）作用下生长明显受到抑制。顺铂的IC50值从22．65μmol／L降至3．75μmol／L,阿霉素的IC50值从4．20μmol／L降至0．06μmol／L。p73能使A549细胞受顺铂和阿霉素诱导的细胞凋亡增加。而p53没有明显作用。流式细胞术显示p73α基因转染后,顺铂诱导的细胞凋亡率从10．6％升高到36．8％（P〈0．01）,阿霉素诱导的细胞凋亡率从13．0％升高到41．1％（P〈0．01）。克隆形成实验显示．p73α基因转染能明显降低顺铂和阿霉素作用后A549细胞的克隆形成数（P〈0．01）。对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为2．0和2．4倍。结论：外源性p73基因的导入增加了wt-p53型A549细胞对顺铂和阿霉素等化疗药的敏感性。该作用可能与p73基因能不依赖于p53基因诱导细胞凋亡有关。p73基因可用于治疗wt-p53不能发挥作用的恶性肿瘤。     

中频交变微电流影响人乳腺癌细胞耐药性的初步研究

目的:探究中频交变微电流是否可以改变人乳腺癌细胞株耐药性;针对实验结果,分析其可能机制。方法:对人乳腺癌细胞MCF-7施加不同参数中频交变微电流,选出较优参数。测定人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药株MCF-7/Adr的IC50值。将处于对数生长期的人乳腺癌耐药细胞MCF-7/Adr接板,分为化疗药物组和联合处理组,施加不同的处理方法。CCK-8法检测以上各组细胞存活率,分析中频交变微电流对乳腺癌细胞株耐药性的影响。将处于对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7分为对照组和电刺激组,用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）定性观察荧光标记的耐药蛋白P-gp,Western blot法半定量P-gp,流式细胞仪FITC标记定量测定荧光标记的P-gp。结果:中频交变微电流能降低耐药株MCF-7/Adr的IC50和耐药指数（≥80μg/ml,协同作用）。定性、半定量和定量三种方法均显示中频交变微电流刺激后,细胞P-gp蛋白表达量均有下降趋势。结论:中频交变微电流能够增强人乳腺癌耐药细胞药物敏感性,有可能成为辅助化疗的治疗手段,其机制尚不明确,有可能是通过降低细胞P-gp的表达,抑制细胞内药物外排发挥作用的。     

乳腺癌耐药细胞ER表达状态影响细胞对屈洛昔芬和阿霉素的敏感性

背景与目的：雌激素受体（estrogen receptor,ER)阳性乳腺癌细胞株来源的耐药细胞株中,ER表达缺失或下降,且细胞生长速度减慢,本文的目的是研究MCF－7／Adr乳腺癌耐药细胞株中ER表达状态与细胞对出洛昔芬（droloxifene,Dro)和阿霉素（Adriamycin,Adr)敏感性之间的关系。方法：Western blot法检测MCF－7／Adr及其亲本MCF－7细胞中ER蛋白的表达,构建ER的真核细胞表达质粒（pCER),利用LipofectAMINE^TM将ER基因导入MCF－7／Adr细胞,经G418抗性筛选获得阳性克隆（MTER／Adr),PCR,Western blot法鉴定并检测ER基因的整合和蛋白表达,流式细胞仪检测细胞周期变化,MTT法检测Dro及Adr对细胞增殖的影响。结果：在MCF－7细胞中可检测到ER蛋白 的表达,而MCF－7／Adr细胞中使用Westernblot检测不到ER蛋白的表达,成功构建真核细胞表达质粒pCER并转染MCF－7／Adr细胞,阳性克隆MTER／Adr整合了ER基因并获得表达。经MTT分析,10μmol/LDro对MCF－7细胞的生长有明显的抑制作用。而到20μmol/L时对MCF－7／Adr细胞的生长有抑制作用。ER转染MCF－7／Adr细胞后,15μmol/L的Dro对其生长出现抑制作用,使细胞多分布于G0／G1期。同时细胞对Adro的敏感性下降,结论：MCF－7／MCF－7／Adr细胞部分恢复对Dro和Adr的敏感性。     

肿瘤坏死因子、白细胞介素-2、α-干扰素及合用异博定对人乳腺癌细胞多药耐药性的逆转作用研究

目的检测肿瘤坏死因子、白细胞介素-2、α-干扰素及合用异博定对人乳腺癌耐药细胞系的耐药性的调节作用。方法MTT法检测药物对MCF-7/Adr细胞的抑制率变化,流式细胞术检测肿瘤坏死因子、白细胞介素-2、α-干扰素及合用异博定后,细胞内罗丹明-123的药物浓度变化。结果α-干扰素可增加耐药细胞内的药物浓度,α-干扰素与异博定合用比单用异博定也可增加细胞内的药物浓度。各用药组均可不同程度提高阿霉素对耐药细胞的抑制率。结论乳腺癌化疗中,合用α-干扰素及异博定,可在减少副作用的基础上逆转肿瘤的耐药性。     

反义HSC70与mtP53和肿瘤耐药关系的探讨

目的 观察反义HSC70RNA对MCF7／Adr人乳腺癌细胞耐药性影响,探讨其与突变型p53稳定性和肿瘤耐药间的关系。方法 利用DNA重组技术将人HSC70DNAt片段反向克隆至真核载体pLXSN中,构建反义人HSC70真核表达质粒pX-AHSC70。用脂质体方法将重组质粒转染至MCF7／Adr人乳腺癌细胞内,以PCR确定转染细胞中外源DNA存在后,Western blot检测HSC70蛋白的抑制程度。MTT法检测细胞耐药性的影响。p53稳定性实验分析反义HSC70RNA对突变型p53半衰的改变。结果 经G418筛选获得稳定表达反义HSC70RNA细胞株MAc70,与空载体MAX细胞相比,HSC70蛋白表达下降42％,细胞耐药性显著下降。p53稳定性实验表明,其胞内突变型p53含量下降,半衰期缩短,稳定性明显下降。结论 反义HSC70RNA能够明显降低HSC70蛋白表达,导致乳腺癌细胞的耐药性下降,提示HSC70可能通过增强突变型p53稳定性的途径而参与MCF7／Adr乳腺癌细胞的耐药。     

Transfer of p14ARF gene in drug-resistant human breast cancer MCF-7/Adr cells inhibits proliferation and reduces doxorubicin resistance

The INK4a/ARF locus on human chromosome 9p21 encodes two tumor suppressors, p16INK4a and p14ARF, that restrain cell growth by affecting the functions of the retinoblastoma protein and p53, respectively. Overexpression of ARF results in cell cycle arrest in both G1 and G2. To elucidate the effect of p14ARF gene on multidrug-resistant tumor cells, we transferred a p14ARF cDNA into p53-mutated MCF-7/Adr human breast cancer cells. In this report we demonstrated for the first time that p14ARF expression was able to greatly inhibit the MCF-7/Adr cell proliferation. Furthermore, p14ARF expression resulted in decrease of MDR-1 mRNA and P-glycoprotein production, which linked to the reducing resistance of MCF-7/Adr cells to doxorubicin. These results imply that drug resistance might be effectively reversed by the wild-type p14ARF expression in human breast cancer cells.     

Leuprorelin acetate affects adhesion molecule expression in human prostate cancer cells

Multidrug resistance is the most predominant phenomenon leading to chemotherapy treatment failure in breast cancer patients. Despite many studies having suggested that overexpression of epidermal growth factor receptor (EGFR) is a potent predictor of malignancy in cancers, systematic research of EGFR in multidrug resistant (MDR) breast cancer cells is lacking. In order to clarify the role of EGFR in MDR breast cancer cells, MCF7/Adr expressing relatively higher EGFR, and its parental cell line MCF7 expressing relatively lower EGFR, were chosen for this study. Knockdown of EGFR by siRNA in MCF7/Adr cells showed that EGFR siRNA inhibits cell migration, invasion and proliferation in vitro; converse effects were observed in MCF7 cells transfected with pcDNA3.0-EGFR plasmid. Moreover, we found that EGFR upregulated migration and invasion via EMMPRIN, MMP2 and MMP9 in addition to promoting cell cycle passage via elevation of cyclin D1 and CDK4 in MDR breast cancer cells. Interestingly, MCF7/Adr cells not expressing EGFR showed significant decrease of P-glycoprotein (P-gp) and ABCG2 expression levels, and became more sensitive to treatment of adriamycin (ADR) and paclitaxel (Taxol); the above results indicated that MDR of cancer cells is related to S-phase arrest. In conclusion, EGFR is an important factor enhancing the malignancy of MDR breast cancer cells, partially, inducing MDR. Anti-EGFR therapy may improve outcome in chemorefractory breast cancer patients.     

外源性TNF-α基因克服多药耐药性的初步研究

目的：探索外源性细胞因子TNF－α基因克服多药耐药（multidrug resistnce,MDR)的新途径。方法：以重组逆转录病毒为载体,将TNF－α基因导入具MDR表型的人乳腺癌细胞系MCF－7／Adr ,经G418抗性筛选获阳性克隆MCF－7／Adr－TNF1与MCF－7／Adr－TNF2。以PCR和ELISA法检测目的基因的整合与表达。细胞计数法观察细胞生长速度的改变。MTT法检测外源性TNF－α基因的逆转MDR作用,流式细胞仪分析细胞内ADR积累的变化。结果：MCF－7／Adr－TNF1GN MCF－7／Adr－TNF2细胞中有TNF－α基因的整合和表达,病毒上清中TNF－α含量分别为1737pg/ml(10^6cells/48h)、2875pg/ml。与阴性对照细胞相比,MCF－7／Adr－TNF1GN MCF－7／Adr－TNF2细胞的生长速度明显减慢,生长抑制率分别为32．4％、54．8％,对ADR的耐药性明显降低,耐药逆转倍数分别为5．2倍、19．3倍,细胞内ADR的积累明显增加。结论：外源性TNF－α基因的导入能有效克服耐药性,增加细胞内药物的积累为其逆转耐药性的主要机制。     

In vitro and in vivo evaluation of WK-X-34, a novel inhibitor of P-glycoprotein and BCRP, using radio imaging techniques

Overexpression of the multidrug resistance proteins P-glycoprotein (Pgp) and breast cancer resistance protein (BCRP) results in treatment failure of many malignancies including ovarian cancer. Dual inhibition of Pgp and BCRP may restore the sensitivity of resistant cells to anticancer drugs. We report the synthesis and characterization of a novel anthranilic-acid based Pgp and BCRP modulator, WK-X-34. In vitro inhibition of Pgp activity was evaluated using 99mTc-Sestamibi and daunorubicin accumulation in Pgp overexpressing human ovarian cancer cells (A2780/Adr) and its sensitive counterpart (A2780/wt). Interaction with BCRP was examined with a mitoxantrone-efflux assay in BCRP-overexpressing MCF7/mx cells, with flow cytometry. Interactions with the multidrug resistance associated proteins (MRP) were evaluated in transfected MRP1, MRP2 and MRP3 cell lines, using a 5-CFDA efflux assay. In vivo 99mTc-Sestamibi imaging of human ovarian cancer xenografts was used to evaluate the in vivo efficacy of WK-X-34 in mice. Daunorubicin accumulation in A2780/Adr cells was inhibited by WK-X-34 at nanomolar concentrations (IC50: 82.1 +/- 6 nM). WK-X-34 inhibited mitoxantrone accumulation in BCRP-overexpressing cells at micromolar concentrations (IC50 = 26.5 +/- 4.6 microM), whereas WK-X-34 did not significantly alter 5-CFDA accumulation in MRP transfected cells. In vivo, uptake of 99mTc-Sestamibi was significantly increased in A2780/Adr xenograft tumors, brain and intestine (AUCs(0-4h) 136%, 147% and 138%; p < 0.05) in mice dosed with WK-X-34 (20 mg/kg i.p.). WK-X-34 selectively modulates Pgp and BCRP in vitro and in vivo in multidrug resistant ovarian cancer cells, and thus may have potential utility in the treatment of multidrug resistant tumors.