SARS患者组织中冠状病毒S蛋白的表达

目的探讨冠状病毒S蛋白单克隆抗体在5例严重急性呼吸综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS)患者多脏器穿刺和尸检病理组织中的表达以及与SARS病理学特点及病原学的关系。方法应用SARS冠状病毒(SARSCoV)S蛋白单克隆抗体,对病程为1周的早期SARS死亡尸检病例和4例病程为3～5周中晚期SARS死亡病例的多器官组织进行检测和观察。结果肺泡腔内脱落的上皮细胞、单核细胞和多核合体样细胞,以及支气管黏膜上皮细胞与黏膜腺体上皮细胞、多器官内血管内皮细胞和散在浸润的单核巨噬细胞SARSCoVS蛋白均呈阳性表达。2例SARS中晚期病例肝细胞和心肌细胞亦见SARSCoVS蛋白阳性反应。结论SARSCoV单克隆抗体在SARS患者肺、支气管、肝脏和心肌等器官组织均有表达,可作为SARS病原学和病理学的辅助诊断标志,对探讨SARS传播途径及发病机制有重要意义。     

Taqman荧光定量RT—PCR在呼吸道感染患者临床标本非SARS冠状病毒检测中的应用

目的建立检测四种常见人非SARS冠状病毒核酸特异的快速、敏感的TaqManqRT—PCR检测方法,应用于急性呼吸道感染患儿的感染分析。方法分别应用TaqManqRT—PCR与普通RT—PCR平行检测248份呼吸道标本,对方法的灵敏性、特异性和稳定性以及临床标本的适用性进行比较评价,阳性标本以体外转录RNA为标准品进行病毒载量定量。结果本方法可对HKU1、NL63、229E、OC43四种冠状病毒进行特异性诊断,与其他病毒无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝／μl,检测线性范围可达10^1～10^8拷贝／μl,248份标本中HKU1、NL63、229E、OC43阳性率依次为1．2％,0．8％,1．2％,1．6％,其中OC43荧光RT—PCR法检出率高于普通RT—PCR,其余三种病毒两种方法检测结果一致。非SARS冠状病毒阳性标本均检出于12月至次年5月。结论建立的TaqManRealtimeRT-PCR法具有特异性强、灵敏性高的特点,是开展非SARS冠状病毒的临床检测与疾病监测的有效技术手段。     

冠状病毒感染细胞抗原片法检测SARS患者血清中特异性抗体

目的：检测SAILS患者血清中特异性抗冠状病毒抗体及其滴度变化，协助临床确诊SAILS。方法：用本次爆发SAILS患者鼻腔抽吸液分离的冠状病毒感染新生恒河猴肾细胞，制备抗原片，用间接免疫荧光法检测患者体内急性期和恢复期血清中的抗冠状病毒抗体。结果：汕头地区7例SAILS患者血清内均有特异性抗冠状病毒抗体，且恢复期抗体滴度比急性期的滴度增高4倍以上。结论：用冠状病毒感染细胞抗原片对怀疑感染SAILS的患者血清进行特异性抗体检测，可协助临床确定SAPS的诊断。     

SARS冠状病毒研究进展

2003年初,不明原因的非典型肺炎从我国广东省迅速向周边地区蔓延。3月15日,世界卫生组织（WHO）将广泛流行的、发病急、传播快、严重威胁患者生命的“非典型肺炎”命名为严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）。SARS的潜伏期为2-12 d,主要临床表现有高热（〉38℃）、头疼和干咳,部分病人有气促等呼吸困难症状,少数进展为呼吸窘迫综合征（ARDS）,后者死亡率极高。同年4月16日,在日内瓦举行的9国科学家会议上,WHO正式确定非典型肺炎的病原体是冠状病毒的一个变种,并将其命名为“SARS冠状病毒（SARS-CoV）”。现就该病毒的研究进展作一综述。     

套式RT-PCR方法检测SARS冠状病毒

采用世界卫生组织推荐的套式RT PCR引物 ,建立了较稳定、重复性好的实验室检测方法。病理检测的肺组织 3份 ,取自广州非典死亡病例 ;咽拭子和漱口水 2 0份 ,取自广州非典临床确诊病例 ;SARS冠状病毒 ,本室保存。Vero E6、大肠杆菌DH5α为本实验室保存。提取质粒试剂盒用QIAGEN公司的QIAampViralRNAMiniKit,逆转录及第一次PCR用QIAGEN公司的QIAGENOneStepRT PCRKit。第二次PCR所用Taq酶和核酸凝胶回收试剂盒为TaKaRaTaqTM和PCRFragmentRecoveryKit,均购自宝生物工程有限公司 ,dNTP购自Pharmacia公司 ,克隆载体p…     

广东地区严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清的IFA检测

目的：证实新分离出的冠状病毒与SARS患者的关糸。方法：应用IFA诊断试剂做免疫荧光染色，检测2003-02-04-04-13期间，广东地区3所医院临床诊断为SARS的72例患者血清特异性抗体，以及直接参加救治SARS患者但末发生感染的109名医护人员的血清标本，并以疾病流行期间70例健康体检者作为正常对照组。结果：72例SARS患者中，62例血清特异性：IgG呈阳性；而109例密切接触但末发生感染的医护人员及70例SARS流行期间健康体检者，血清特异性IgG和IgM均呈阴性。结论：SARS冠状病毒是引发广东地区SARS的病原体。     

传播链和非传播链SARS患者中SARS冠状病毒抗体的分布及变化规律

目的　探讨人体对SARS CoV血清抗体反应及分布规律。方法　对 30 1例临床诊断病例的血清标本 (其中传播链上的病例 15 8例 ,非传播链病例 14 3例 ) ;采用北京华大GBI生物技术有限公司生产的间接ELISA试剂 ,进行SARS CoVIgG抗体的检测 ,部分病例还进行了SARS CoVIgM的检测。结果　传播链涉及 15条 ,最多涉及 4代 ,各条链的SARSIgG抗体阳性率为 85 70 %～ 10 0 .0 0 % ,总阳性率为 94 30 % (14 9 15 8)。SARS病例数随代数增加而减少。但各代间IgG阳性率的差异无显著意义 ;χ2 =5 11,P >0 0 5。非传播链病例的血清抗体阳性率为 12 5 9% (18 14 3)。与传播链的阳性率比较 ,两者间的差异有显著意义 ;χ2 =199 6 4 ,P <0 0 0 1。在发病后的 0～ 7d、8～ 14d、15～ 2 1d、2 2～ 30d内 ,SARS CoVIgG的累计阳性率分别为 16 6 7%、4 0 0 0 %、70 0 0 %、93 10 % ;然后进入平台期 ,并可以维持 6个月以上。在发病 7d内 ,SARS CoVIgM的累计阳性率为 16 6 7% ,8～ 14d时 ,已有 5 5 17%的标本IgM抗体阳转 ,在 2 1～ 30d时 ,抗体阳性率达高峰 (86 96 % ) ,以后迅速下降。结论　SARS感染后 ,94 %的感染者可产生IgG抗体。检测该抗体可以作为临床核实诊断的依据。SARS CoVIgG抗体在 7d时可能检出 ,一般在 4周达     

SARS冠状病毒编码蛋白质及其基因分析的研究进展

20 0 3年初 ,一种严重的急性呼吸综合征 (severeacuterespiratorysyndrome,SARS)从我国广东省迅速向周边地区蔓延。直到 6月 4日 ,世界卫生组织 (WHO)共接到来自全球 2 9个国家和地区累计 84 0 2起病例报告 ,其中国内就有 5 32 9人感染。在WHO的协调下 ,全球 10个国家的 11个实     

新冠状病毒与SARS

冠状病毒可引起人和动物的多种疾病，人类冠状病毒HCoV-OC43和HCoV-229E主要引起人类的普通感冒。但是最近新分离出的冠状病毒可引起严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，本文将就冠状病毒的生物学特性与致病性．新冠状病毒与SARS的关系，SARS冠状病毒的研究进展作一综述。     

SARS冠状病毒的病原生物学分析及其启示

Severe acute respiratory syndrome (SARS) is the first new epidemic of the twenty - first century. A novel coronavirus (SARS - CoV) has been identified as the causative agent of SAP, S. The genome of SARS - CoV has 29,727 nucleatides in length. The genome organization, with 11 open reading flames, is similar to that of conronaviruses.Phylogenetic analyses and sequence comparisons showed that SARS- CoV is not closely related to any of the known coronaviruses, indicating neither a mutant nor recombinant of well -characterized coronaviruses. It is a complete new coronavirus from nonhuman hostPathological studies show that severe immune response, associated to cytokine dysregulation, may be related to the lung damage of fatal SRAS. Recombination of genomes of wild - type strains with vaccine coronavirus is a potential risk associated with the application of living attenuated coronavirus vaccines. The proteinases, controlling the activities of the SARS- CoV replication, and spike protein, involved in viral entry and pathogenesis, represent attractive targets of anti- SARS drug development. Comparative full-length genome sequence analysis of 14 SARS coronavirus isolates suggests a remarkable genetic conservation of the virus. Anti - SARS vaccine and drug development will benefit from this genetic conservation. SARS-CoV is not likely to change rapidly and thus may not readily mutate to a benign infection. The progress in anti - SARS research has been impressive. However, one of the most effective tools in the control of the SARS is quickly tracing and isolating the contacts of stricken patients before they spread the virus further.     

重组SARS冠状病毒棘突蛋白S1区基因片段的克隆、表达及免疫原性研究

目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)棘突(spike)蛋白(S蛋白)S1区基因(40～2001bp)分段表达载体,并研究其免疫原性。方法利用PCR技术扩增S1区基因,将其定向插入pQE30质粒,在pQE30质粒上将S1切成3段(40～751、746～1344、746～2001bp),均插入pQE30质粒,构建质粒在大肠埃希菌M15中表达,表达产物经亲和层析纯化及WesternBlot和ELISA鉴定。结果构建的3种重组质粒(pQE30/S1a、pQE30/S1b、pQE30/S1c)均高效表达,重组蛋白相对分子质量分别为26700、22500和46000,表达量分别占菌体总蛋白质的35%、35%和30%。3种重组蛋白经Ni亲和层析树脂得到成功纯化。经Western-Blot及ELISA证实,重组蛋白片段S1c(746～2001bp)可以被SARS患者血清所识别。结论成功构建了SARS-CoVS蛋白S1区基因分段表达载体,重组蛋白S1c具有较强的免疫原性,它的获得为下一步疫苗的研制奠定了基础。     

Kadipiro病毒TaqmanReal—timePCR检测方法的建立

目的利用TaqManReal—timePCR技术,建立Kadipiro病毒（KDV）实时荧光定量PCR检测方法。方法根据GenBank发表的KDV基因序列资料分析结果,在其第12片段基因区段设计KDV特异引物与探针,利用14株不同科属病毒核酸验证方法特异性,重复实验检验方法稳定性,利用体外转录的定量RNA标准品建立基因拷贝数定量分析模型。结果引物与探针具有良好的特异性,同一样品重复检测D值的变异系数均〈1．8％,定量分析模型的灵敏度为100拷贝／反应。结论建立了一种特异、灵敏、高效的KDV一步法TaqManReal-timePCR检测方法,为今后该病毒的监测与研究工作提供技术手段。     

一种新型冠状病毒基因的克隆和序列分析与传染性非典型肺炎病原学的调查

目的 探讨冠状病毒感染与传染性非典型肺炎发病的关系，分析冠状病毒基因序列变异的临床意义，建立诊断冠状病毒变异株感染的分子生物学方法。方法 收集非典型肺炎(SARS)患者的不同临床标本，采用PCR技术分别进行衣原体、甲肺炎病毒以及冠状病毒等的基因检测。以冠状病毒相对保守的依赖RNA的RNA多聚酶基因为靶基因，采用Nested RT—PCR技术从非典型肺炎患者的鼻咽吸取物标本和濑喉液标本中扩增出冠状病毒基因，将PCR产物直接克隆到T载体，进行序列测定，进一步比较不同分离株间的核苷酸和氨基酸序列同源性。结果 在27例非典型肺炎患者中检出冠状病毒基因阳性6例，阳性率为22．2％。而在15例健康对照中，全部阴性。采用BLAST软件将所获得的冠状病毒的基因序列与基因库(GenBank)登记的序列比较，结果显示本次分离克隆的冠状病毒基因与既往报道的所有冠状病毒在核苷酸水平没有相关性，核苷酸同源性最高不超过40％。但在氨基酸水平的同源性为80％左右(70％-82％)。从不同患者中分离的冠状病毒基因之间在核苷酸水平的同源性在98％以上。与刚刚公布的加拿大、中国香港、英国等SARS冠状病毒的核苷酸序列同源性在99％以上。结论 相当部分非典型肺炎患者存在冠状病毒的感染，提示本次的非典型肺炎发病与感染冠状病毒有关。序列分析结果表明从本次非典型肺炎患者中分离的冠状病毒为一种新的冠状病毒，并与世界其他地区分离的SARS冠状病毒同源性达99％以上。以RNA多聚酶为靶基因Nested RT—PCR技术可以用于诊断这一新种冠状病毒感染。     

SARS-CoV的S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10的信号分子机制研究

目的：研究SARS冠状病毒S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10（interferon-gamma inducible protein 10）的信号分子机制。方法：通过基因芯片检测SARS冠状病毒的S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE后信号通路基因表达谱的变化；采纳RT-PCR、EMSA、Western blotting等方法进一步分析JAK-STAT通路中信号分子的磷酸化、IRF-1和IP-10基因表达的变化及其相应信号分子抑制剂对表达水平的影响。结果：S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE诱导了JAK-STAT信号通路涉及的重要转录因子基因IRF-1的表达，该信号通路的转录因子STAT1在刺激后15 min发生磷酸化，2 h即可检出IP-10基因的表达， IP-10的表达可以完全被STAT1、JAK2抑制剂阻断。EMSA显示：支气管上皮细胞在S蛋白的作用下，其核蛋白能够特异性与ISRE和GAS DNA基序相结合，而不能与NF-κB的 DNA基序相结合。结论： SARS－CoV的S蛋白通过激活JAK-STAT信号转导通路诱导IP-10在宿主细胞的生成。提示病毒诱导的JAK-STAT信号通路激活在病毒感染相关的急性肺损伤发生中具有重要地位。     

流感病毒型别及亚型的多重RT-PCR方法快速检测

目的为适应流感疫情监测中快速诊断的需要,建立敏感特异的流感病毒多重逆转录PCR(MRTPCR)检测方法。方法对甲1型(H1N1)、甲3型(H3N2)、乙型流感病毒的血凝素(HA)基因保守区域分别设计引物进行MRTPCR。另设计了两对引物对H1N1和H3N2亚型流感病毒的神经氨酸酶(NA)N1、N2作亚型判断。结果MRTPCR可特异性检测出各型流感病毒的目的片段,相互间无交叉反应。二次PCR反应后对H1N1、H3N2流感病毒的检测灵敏度可达0.10TCID50/50μl以下,对乙型流感病毒的检测灵敏度可达0.01TCID50/50μl以下。应用此方法也可特异性地检测出H1N1和H3N2流感病毒的NA基因。结论用MRTPCR从临床患者含漱液标本中检出相关流感病毒的灵敏度要高于用狗肾传代细胞(MDCK)或鸡胚分离的灵敏度,达到了快速、敏感、正确检测流感病毒及其亚型的目的。     

人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法的建立及应用

目的 建立人类肠道病毒（HEV）分子生物学分型鉴定方法,用于临床分离肠道病毒的分型鉴定.方法 根据已知各型别人类肠道病毒基因的核苷酸序列和文献资料,分别合成HEV种属特异性和分型鉴定引物;提取病毒RNA,采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒cDNA,通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析,鉴定病毒并分型,并与血清中和试验相互验证.结果 采用种属特异性引物鉴定18株疑似HEV毒株,其中17株阳性;型特异性引物鉴定结果：18株病毒中4株为科萨奇病毒A24型,3株为科萨奇病毒B3型;科萨奇病毒B2、A9、A15型、埃可病毒3、6、7、9、11、14、33型和鼻病毒9型各1株,分型结果与中和试验相符.结论 建立的人类肠道病毒分子生物学分型鉴定方法,具有特异性强、敏感性高、快速简便等优点,可以直接鉴定并分型诊断人类肠道病毒感染,适用于人类肠道病毒感染的实验室诊断和流行病学研究.     

实验性柯萨奇B_(3m)病毒性心肌病变及其病原的原位逆转录-聚合酶链反应检测

目的　建立柯萨奇B3m(CoxB3m)病毒性心肌病变模型 ,用原位PCR方法检测心肌病变中的病原 ,以阐明CoxB3m病毒在发病过程中的作用。方法　 (1)用Balb/C小鼠 30只 ,制作CoxB3m病毒性急性心肌病变模型 ,5 0只制作慢性反复感染心肌病变的动物模型 ;并与 2 5只正常Balb/C小鼠相对照 ;(2 )对病毒反复感染所致慢性心肌病变动物模型的左室侧壁厚度及左室腔的面积大小 ,采用KS40 0型图像分析系统进行图像分析 ;(3)应用碱性磷酸酶联接的抗地高辛抗体标记的核苷酸直接掺入法建立原位PCR检测心肌组织中柯萨奇B3m病毒RNA。结果　不论是在急性或反复感染的慢性心肌病变模型心肌组织中 10 0 %可找到CVB RNA阳性信号 ,慢性病变者经图像分析证明左心腔扩大 ,室壁变薄 ,与正常对照组相比P <0 .0 1～ <0 .0 5。结论　在病变心肌组织中 ,用原位PCR检测都有阳性的CVB RNA信号 ,说明柯萨奇B3m病毒不仅能引起急性病变 ,反复感染者亦可造成慢性病变 ,后者心腔常扩大且室壁变薄。     

登革病毒RT—PCR核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品的建立

目的 登革病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品建立与评价.方法 将登革病毒核酸检测靶基因序列间引入180碱基与登革病毒无关基因序列构建内参照检测靶靶标并在其下游通过核糖体内部进入位点基因介导的荧光蛋白报告基因后引入慢病毒包装载体,在辅助质粒的帮助下转染HEK 293T细胞,收获假病毒颗粒,定量分析后加入到到待检样本和模拟样本中一起进行评价和应用.结果 所构建的登革病毒病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照品能够充当RT-PCR法检测不同型别登革病毒的内参照品,扩增片段大小和病毒目的 扩增片段明显不同,易于区别,能够监测反应的整个过程.结论 登革病毒核酸检测竞争性假病毒颗粒型内参照系统,容易制备,保存简单,易于改造为多种RNA病毒的核酸检测的内参照.     

SARS-CoV的培养和灭活条件的研究

目的　研究SARS CoV的大量培养和灭活方法,为制备马抗SARS免疫球蛋白制剂提供安全的病毒。方法　使用SARS CoV感染Vero、Vero E6和2BS细胞株,筛选对SARS CoV较敏感的细胞株和最佳病毒感染量;在2 5℃、33℃和37℃培养条件下,检测SARS CoV的最适培养温度。在室温下,使用1∶2 0 0 0～1∶2 0 0 0 0的β丙内酯浓度灭活SARS CoV ,观察最佳灭活时间和效果。结果　SARS CoV对Vero和Vero E6细胞株比较敏感。在37℃、5 %CO2 孵箱中培养72h ,细胞病变达75 %以上。1∶4 0 0 0的β丙内酯能够完全灭活SARS CoV。将灭活后的病毒液在2℃～8℃作用16h ,37℃水浴2h能够完全使β丙内酯的毒性水解。结论　用Vero或Vero E6细胞培养SARS CoV ,在37℃、5 %CO2 孵箱中培养72h ,病毒滴度最高。用1∶4 0 0 0的β丙内酯浓度加入病毒液中,作用1h能够完全灭活SARS CoV。