小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

SHP-2重组腺病毒的包装及对心肌细胞的感染

目的 采用HEK293细胞包装Ad-GFP-SHP-2和Ad-GFP-SHP-2-E76A并扩增Ad-GFP重组腺病毒并感染乳鼠心肌细胞.方法 纯化两种载体;Pac Ⅰ酶切线性化;线性化的载体转染入HEK293细胞进行包装;从病变的HEK293细胞分离重组腺病毒.利用重组的腺病毒感染乳鼠心肌细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.结景 Pac Ⅰ酶切后,琼脂糖凝胶上显示有4.5 kb的条带;转染线性化的重组腺病毒载体人HEK293细胞中,反复冻融HEK293,其上清中含有重组腺病毒,当感染乳鼠心肌细胞感染复数为100时,感染效率大于90%.结论 成功包装重组腺病毒,包装后的腺病毒可高效感染乳鼠心肌细胞.     

细菌内同源重组法快速制备重组腺病毒

目的：探讨细菌内同源重组两步转化法快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒的方法。方法：将腺病毒骨架质粒pAdEasyl转化BJ5183高效感受态,制备pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态,将线性化的腺病毒穿梭质粒pAdtrack—CMV转化至含pAdEasy—1的BJ5183感受态,筛选获得重组腺病毒载体pAdEazy—CMV。获得的重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞,包装、扩增出重组腺病毒RAdCMV,氯化铯梯度离心法进行纯化,采用电镜负染鉴定重组腺病毒,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达并检测重组腺病毒的滴度。继而用纯化的蘑组腺病毒感染HeLa细胞,测定转染效率。结果：成功构建了重组腺病毒载体pAdEazyCMV,透射电镜和绿色荧光鉴定证实病毒包装成功,并且具有感染力,病毒的滴度呵达2．0×10^10pfu／ml。结论：细菌内同源重组两步转化法可以快速构建重组腺病毒质粒,为后续构建携带不同目的基因的重组腺病毒奠定基础。     

miR-1腺病毒载体的构建及表达分析

目的构建并鉴定microRNA-1(miR-1)的腺病毒表达载体。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeI酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAdprecusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率。结果基因测序及酶切鉴定证实重组Adprecursor-miR-1腺病毒载体构建成功;腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平。结论利用同源重组的方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达水平。     

编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF-1α的重组腺病毒

目的:利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF-1α cDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF-1α重组腺病毒. 方法: 制备感受态BJ5183,将pAdEasy-1转化BJ5183,制备含pAdEasy-1的BJ5183感受态,将线性化的pShuttle-EGFP-hSDF-1α转化含pAdEasy-1的BJ5183感受态菌. 采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-EGFP-hSDF-1α. pAd-EGFP-hSDF-1α用Pac Ⅰ线性化后,再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况. 结果:pShuttle-EGFP-hSDF-1α成功地转化了含pAdEasy-1的BJ5183,并在其内发生了同源重组. 荧光显微镜下观察证实了pAd-EGFP-hSDF-1α转染AD293后,产生了重组腺病毒Ad-EGFP-hSDF-1α. 病毒滴度为4.1×1015 pfu/L. 结论:用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF-1α的高滴度重组腺病毒. 为研究hSDF-1α在动员骨髓源干细胞迁移到组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.     

β-catenin腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建人β-catenin基因的重组腺病毒载体,为进一步研究Wnt/Wingless信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制奠定重要基础.方法:以含有β-catenin的pcmv-βNS-FC质粒为模板PCR获得目的基因,将目的基因定向克隆至腺病毒穿梭质粒构建阳性重组pAd track-β-catenin,并经PmeI线性化后在BJ5183细菌中与腺病毒骨架质粒pAd Easy-1同源重组获得β-catenin重组腺病毒载体,再将PacI线性化的腺病毒质粒转染HEK293细胞包装重组腺病毒.结果:PCR及酶切鉴定证实目的基因正确克隆至腺病毒质粒中,目的基因序列与GENEBANK报道一致,荧光显微镜可观察到GFP的表达.结论:成功构建pAd-β-catenin腺病毒质粒载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒.     

体内靶向树突状细胞的腺病毒通用肿瘤疫苗的构建

目的 采用细胞菌内同源重组法构建人端粒酶逆转录酶(hTRT)重组腺病毒,并将其以甘露聚糖进行表面修饰,以探索构建一种新型的体内靶向树突状细胞(DC)的通用型肿瘤抗原. 方法将编码hTRT的cDNA序列自pBABE-PURO-hTERT质粒亚克隆至腺病毒质粒pAdTrack-CMV中,将后者与骨架质粒pAdEasy-1经电冲击共转化宿主菌BJ5183进行同源重组.经过克隆筛选获得正确的重组腺病毒质粒后,将其线性化转染293细胞包装获得重组腺病毒.将重组腺病毒扩增纯化,以甘露聚糖进行表面修饰.最后将甘露聚糖修饰后的腺病毒免疫小鼠. 结果重组腺病毒能在293细胞产生细胞病变效应(CPE),腺病毒转染后的细胞通过PCR及免疫印迹能测到hTRT的表达.重组腺病毒经过甘露聚糖修饰后,经高碘酸席碱染色呈阳性.重组腺病毒能在小鼠体内靶向脾脏DC细胞. 结论成功构建能体内靶向DC细胞的hTRT重组腺病毒,为通用型肿瘤疫苗的研发作出了新的探索.     

人血管内皮生长因子165基因腺病毒载体的构建及其在C17.2神经干细胞的表达

[目的]构建含有人血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的重组腺病毒载体并观察其在C17.2神经干细胞的表达,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供基础.[方法]将VEGF165基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,获得重组质粒pAdTrack VEGF165,经酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同转染大肠杆菌BJ5183同源重组获得重组腺病毒质粒,将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得有感染能力但复制缺陷的重组腺病毒pAdCMV VEGF165,转化体外培养的C17.2神经干细胞.通过RT-PCR、原位杂交、免疫组化、Western blot法检测其在C17.2神经干细胞中的表达.[结果]重组腺病毒AdCMV VEGF165在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011efu/mL.病毒上清液经ELISA检测VEGF165表达的量为(1135±138)ng/L.重组腺病毒转染神经干细胞后有稳定表达.[结论]成功构建pAd VEGF165重组腺病毒,获得了稳定表达VEGF165的神经干细胞克隆,为下一步脑缺血的转基因细胞移植治疗提供了基础.     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

[目的]为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在PC12细胞中表达.[方法]RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列,TA克隆测序,酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞,用重组腺病毒感染PC12细胞.[结果]10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致,同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带.DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后,感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带,Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达.[结论]成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

新型Smad7 重组腺病毒载体的构建

目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7).方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack CMV Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy 1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7.RT PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况.结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT PCR检测证实Smad7表达增强.结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础.     

SHP-1基因重组腺病毒的构建与表达

目的 构建并鉴定人蛋白酪氨酸磷酸酶基因(SHP-1)重组腺病毒Ad-SHP1.方法 将人SHP-1 cDNA克隆于穿梭质粒pAdTrack-CMV,PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,获得带有SHP-1基因的重组腺病毒质粒pAd-SHP1,经PacⅠ线性化后通过Lipofectamine2000转染HEK293包装细胞,观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况.收获重组腺病毒,经PCR和Western Blotting鉴定后,扩增并纯化重组腺病毒,测定病毒滴度.结果 经测序、酶切电泳和感染后蛋白表达检测均表明成功构建重组腺病毒Ad-SHP1;病毒滴度为1.58×1010 pfu/mL.结论 成功构建带有人SHP-1 cDNA的重组腺病毒,为进一步研究结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤发生机制及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的构建含有大鼠β-NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础.方法设计一对含有HindⅢ及Sal Ⅰ酶切位点的β-NGF基因上下游引物,PCR法扩增含有大鼠β-NGF cDNA的质粒pUC19-β-NGF,产物经HindⅢ及Sal Ⅰ双酶切,插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-β-NGF,经Pme Ⅰ酶线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转入BJ5183中进行同源重组,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析,阳性克隆经293细胞包装,扩增,空斑法测定病毒滴度,转化体外培养的星形胶质细胞.通过RT-PCR、ELISA、Western blot法检测其在星形胶质细胞中的表达. 结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体pAd-β-NGF,重组腺病毒在293细胞中包装成功,病毒滴度达2×1011 PFU/ml.病毒上清液经ELISA 检测,β-NGF表达的量为(94.50±4.58) ng/L.结论该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础.     

人PRKAG2(R302Q)突变型SD乳鼠心肌细胞模型的建立及检测

目的 包装人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒后感染原代SD乳鼠心肌细胞构建细胞模型。方法 首先通过BP及LR重组获得人PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒表达载体,将其线性化转染293细胞进行腺病毒包装和扩增。收集纯化腺病毒液感染原代SD乳鼠心肌细胞后进行WB检测。结果 PRKAG2(R302Q)突变型的腺病毒载体经测序验证插入序列正确,腺病毒感染乳鼠心肌细胞后WB检测其过表达明显(P<0.05)。结论 包装人PRKAG2 (R302Q)突变型基因的腺病毒并成功感染SD乳鼠心肌细胞为进一步研究基因PRKAG2(R302Q)突变体的功能奠定了基础。     

人TβRⅡ-IgG1Fc融合基因重组腺病毒载体的构建

目的 构建含有人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IBG1Fc段融合基因的腺病毒载体,并进行初步的功能活性鉴定.方法 RT-PCR扩增人TGF-β1Ⅱ型受体胞外区及IgG1Fc段基冈,通过Overlap PCR融合为目的 基因hTβRⅡ-IgG1Fc;克隆至pAdTrack-CMV穿梭质粒,线性化后转染含骨架质粒的BJ 5183菌,同源重组构建腺病毒质粒;将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,并扩增、纯化、RT-PCR鉴定;ELISA初步检测重组腺病毒的功能活性.结果 目的 基因经酶切分析、测序鉴定正确;RT-PCR及ELISA表明重组腺病毒能表达hTβRⅡ-IgG1Fc,中和HLF分泌的TGF-β1.结论 成功构建了含融合基因hTβRⅡ-IgG1Fc的腺病毒载体,体外实验证实表达的蛋白具有中和TGF-β1的作用.为进一步研究放射性肺纤维化的基因治疗提供实验依据.     

miR-1在心肌细胞生长中的调节作用

[摘要] 目的 构建并鉴定microRNA-1(miR-1) 的腺病毒表达载体,并探讨其在心肌肥厚中的介导作用。方法 PCR扩增含大鼠miR-1前体的DNA片段,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack。pAdTrack经PmeⅠ酶切线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183菌中进行同源重组。重组质粒pAd-precusor-miR-1线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到重组腺病毒颗粒Ad-miR-1。Ad-miR-1与Ad-GFP病毒转染培养的乳鼠心肌细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测miR-1的表达效率,并分析心肌细胞表面积及肥厚标志物ANP(Nppa)、β-MHC(myh7)的基因表达变化。结果 基因测序及酶切鉴定证实重组Ad-precursor-miR-1腺病毒载体构建成功,腺病毒Ad-miR-1转染心肌细胞后,实时荧光定量PCR方法证实腺病毒Ad-miR-1能够显著提高心肌细胞内miR-1的表达水平,减小心肌细胞表面积及Nppa、myh7的表达。结论 利用同源重组方法构建的miR-1腺病毒能够提高心肌细胞内miR-1的表达,抑制心肌细胞生长。     

mING基因的腺病毒载体的构建与表达

目的构建鼠ING4（肿瘤生长抑制因子4）的腺病毒载体，获得鼠ING4（mING4）重组腺病毒子，为ING4进行肿瘤的基因治疗奠定基础。方法以pcDNA3．0-mING4重组质粒为模板，PCR扩增miNG4，酶切连接到带有GFP标记的pAdTrack-CMV质粒上，PmeI线性化重组质粒pAdTrack-CMV-mING4，与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌，获得重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，经PacI线性化后转染293细胞，收获腺病毒重组病毒子，RT-PCR鉴定，并用MTT法检测mING4对肝癌细胞SMMC7721的作用。结果成功构建mlNG4的重组腺病毒表达载体pAdeasy-1-pAdTrack-CMV-mING4，获得了mING4重组病毒子。结论mING4的重组腺病毒表达载体可抑制SMMC7721细胞的生长。     

Hyper-IL-6融合基因重组腺病毒的构建及其在肝细胞中的表达

目的 在扩增出融合基因Hyper-IL-6的基础上,构建重组腺病毒Ad-HIL-6.用Ad-HIL-6感染人肝细胞LO2,观察细胞内Hyper-IL-6 rnRNA和蛋白的表达情况.方法 将Hyper-IL-6克隆至穿梭质粒,线性化后与腺病毒骨架质粒在BJ5183细菌内同源重组,构建重组腺病毒质粒.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞,PCR进一步证实重组腺病毒的存在.RT-PCR检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6基因的表达情况,Western blot法检测Ad-HIL-6感染LO2细胞后Hyper-IL-6的蛋白表达情况.结果 酶切及PCR鉴定表明同源重组成功,重组腺病毒质粒转染293细胞后可见绿色荧光,感染293细胞得到大量病毒.重组腺病毒Ad-HIL-6能在LO2细胞中表达出Hyper-IL-6基因和蛋白,条带分另q为1600bp和60KD左右.结论 重组腺病毒AdHIL-6构建成功,为以后进行基因治疗奠定基础.     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的 利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒.方法 从pcDNA3-DeltaNp73α-HA中酶切出DeltaNp73α基因,并插入pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒;pAdTrack-CMV-DeltaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli.BJ5183菌株内同源重组.筛选正确的重组质粒,PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒;并在293T细胞中反复扩增;增强离心法转染树突状细胞,Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒;Western blot检测出预期相对分子质量为67×103的特异条带.结论 成功构建了携带DeltaNp73α cDNA的重组病毒.