腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达血管紧张素Ⅱ2型受体的研究

目的：体外培养大鼠血平滑肌细胞（VSMC）并以腺病毒介导转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）。方法：取大鼠主动脉血管,以常规组织块贴壁法培养VSMC;用同源重组方法构建带AT2R基因的复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R),并加以鉴定,扩增,以制取高滴度AdCMV-AT2R转染液,体外转染,VSMC,;用RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,免疫组织化学法及蛋白免疫印迹法检测AT2R蛋白表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,同时检测AT1R的表达变化。结果：构建的AdCMV-AT2R体外转染培养VSMC表达率为89．51％,以免疫组化、免疫印迹和RT－PCR检测AT2R表明,转染后AT2R表达明显增强,并随表达时间延长而增加,48小时达峰值,AT2R转染表达不影响AT1R表达。结论：腺病毒载体可较高效率介导AT2R在体外培养的VSMC转染表达,AT1R表达不受其影响,转表达AT2R的SMC可作研究AngⅡ对其增殖、迁移以及凋亡等生物学行为影响的良好细胞模型。     

腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达血管紧张素Ⅱ2型受体的研究

目的体外培养大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）并以腺病毒介导转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT     

血管紧张素Ⅱ型受体基因转染表达对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的 :探讨血管紧张素 （Ang ） 2型受体 （AT2 R）基因表达对血管平滑肌细胞 （VSMC）迁移能力的影响。方法 :构建带 AT2 R基因的重组复制缺陷腺病毒载体 （Ad CMV - AT2 R） ,体外转染培养的大鼠主动脉 VSMC,用流式细胞仪检测 AT2 R转染表达率 ,RT- PCR方法检测 AT2 R m RNA表达 ,VSMC迁移用改良 Boyden’s趋化小室法检测 ,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白 F- actin的表达。结果 :构建的 Ad CMV - AT2 R体外转染培养 VSMC表达率为 89.5 %。 AT2 R峰值表达时 ,VSMC的跨膜迁移数降低 6 2 .2 % ,F- actin表达明显减少。结论 :AT2 R转染表达可显著抑制体外培养 VSMC迁移 ,这为防治血管再狭窄提供了新的思路。     

血管紧张素Ⅱ2型受体转染表达对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的　探讨血管平滑肌细胞 (VSMC)转染表达血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2 R)对其增殖和迁移的影响。方法　构建带AT2 R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV AT2 R) ,体外转染大鼠主动脉VSMC ,用RT PCR方法检测AT2 RmRNA表达 ,流式细胞仪检测AT2 R表达率 ,用细胞周期、分裂指数、MTT比色法和 5 溴尿苷(BrdU)掺入法检测VSMC增殖。VSMC迁移用改良Boyden‘s趋化小室法检测 ,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F actin的表达。结果　构建的AdCMV AT2 R体外转染培养VSMC表达率为 89.5 1%。AT2 R峰值表达时 ,其S期和G2 M期细胞比率从 31.7%降低到 13.9% (P <0 0 5 ) ,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低 6 1.4%和 5 1.6 %(P <0 0 (1)。VSMC的跨膜迁移数降低 6 2 .2 % ,F actin表达明显减少。结论　AT2 R转染表达可显著抑制体外培养VSMC的增殖和迁移 ,这一作用对再狭窄防治是有益的。     

血管紧张素Ⅱ2型受体转染表达对血管平滑肌细胞增殖及迁移的影响

目的探讨血管平滑肌细胞（VSMC）转染表达血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）对其增殖和迁移的影响。方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体（AdCMV-AT2R）,体外转染大鼠主动脉VSMC,用RT-PCR方法检测AT2RmRNA表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,用细胞周期、分裂指数、MTT比色法和5-溴尿苷（BrdU）掺入法检测VSMC增殖。VSMC迁移用改良Boyden`s趋化小室法检测,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F-actin的表达。结果构建的AdCMV-AT2R体外转染培养VSMC表达率为89.51%。AT2R峰值表达时,其S期和G2-M期细胞比率从31.7%降低到13.9%（P<0.05）,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61.4%和51.6%(P<0.0(1)。VSMC的跨膜迁移数降低62.2%,F-actin表达明显减少。结论AT2R转染表达可显著抑制体外培养VSMC的增殖和迁移,这一作用对再狭窄防治是有益的。     

血管紧张Ⅱ2型受体转染表达对血管平滑肌细胞殖及迁移的影响

目的 探讨血管平滑肌细胞（VSMC）转染表达血和这紧张素Ⅱ（AngⅡ）2型受体（AT2R）对其增殖和迁移影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制缺隐型腺病毒载体（AdCMV-AT2R）,体外转染大鼠主动脉VSMC,用RT－PCR方法检测AT2RmRNA表达,流式细胞仪检测AT2R表达率,用细胞周期、分裂指数、MTT比色法和5－溴尿苷（BrdU）掺入法检测VSMC增殖。VSMC迁移用改良Boyden‘s趋化小室法检测,用激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F－actin的表达。结果 构建的AdCMV－AT2R体外转染培养VSMC表达率为89．51％。AT2R峰值地,其S期和G2－M期细胞比率从31．7％降低到13．9％（P＜0．05）,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低61．14％和51．6％（P＜0．01）。VSMC的跨膜迁移数降低62．2％,F-actin表明明显减少。结论 AT2R转染表达可显著抑制体外培养VSMC的增殖和迁移,这一作用对再狭窄防治是有益的。     

血管紧张素Ⅱ介导血管平滑肌细胞迁移的作用机制

血管平滑肌细胞（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌ,ＶＳＭＣ）从血管中膜向内膜下迁移是血管成形术后再狭窄形成过程中最具特征性的细胞生物学事件之一。迁移进入内膜下层的ＶＳＭＣ有一半可以进一步分化、增殖成为内膜下层的主要细胞,另一半则不再增殖［１］。由此可以推断：ＶＳＭＣ的增殖和迁移是两个相对独立而又相互关联的过程。既往对再狭窄发病机制的研究多集中在ＶＳＭＣ增殖及血管重塑上,对ＶＳＭＣ迁移机制的研究很少。因此,阐明ＶＳＭＣ迁移的细胞生物学机制可能有助于寻找潜在的抑制ＶＳＭＣ迁移的…     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因对血管平滑肌细胞的促凋亡作用

目的探索血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)2型(AT2)受体基因对血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响.方法用同源重组技术构建携带AT2受体基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-AT2R),将VSMC分为对照组及转染组(体外转染培养的大鼠VSMC),用流式细胞术检测其细胞转染率,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测AT2受体、bcl-2和baxmRNA表达,流式细胞术、原位末端标记法检测VSMC凋亡.结果构建的AdCMV-AT2受体体外转染培养的VSMC的表达率为89.51%,VSMC表达AT2受体后,其凋亡发生率较对照组增加4.2倍(P＜0.01),bax表达增加76.3%,bcl-2则无明显变化,原位末端标记法检测结果表明转染组出现大量凋亡细胞.结论转染AT2受体基因可显著增加VSMC的凋亡,这对血管再狭窄的防治是有益的.     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),增强VSMC中gax基因的表达.方法采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax),经293细胞扩增,纯化制备高滴度病毒转染液;以病毒转染液常规转染VSMC后,应用RT-PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达.结果流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示AdCMV-gax转染VSMC后,VSMC的Gax蛋白表达率明显增高,转染后24小时即可达80%左右,高水平的表达可维持5天以上; AdCMV-gax转染前,PDGF-BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用,AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.结论腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC,并且表达为蛋白质.这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响.     

腺病毒介导gax基因转染在培养的血管平滑肌细胞中的表达

目的 以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC)，增强VSMC中gax基因的表达。方法 采用位置特异性重组方法构建携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)，经293细胞扩增，纯化制备高滴度病毒转染液；以病毒转染液常规转染VSMC后，应用RT—PCR、流式细胞仪和免疫细胞化学等方法分别检测VSMC中gax mRNA和蛋白质的表达。结果 流式细胞仪检测和免疫细胞化学染色均显示．AdCMV—gax转染VSMC后，VSMC的Gax蛋白表达率明显增高，转染后24小时即可达80％左右，高水平的表达可维持5天以上；AdCMV—gax转染前，PDGF—BB对gax基因转录和翻译水平的表达均有下调作用，AdCMV—gax转染后，无论有无PDGF—BB刺激，VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。结论 腺病毒载体可有效地介导gax基因转染VSMC，并且表达为蛋白质。这有利于进一步研究gax基因对VSMC生物学行为的影响。     

腺病毒介导反义血管紧张素Ⅱ1型受体cDNA对人肺动脉平滑肌细胞生物学行为的影响

目的探讨腺病毒介导的反义血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1型受体(AT1R)cDNA转染对培养的人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)迁移、增殖和凋亡的影响。方法构建重组反义人AT1R腺病毒(AdCMVahAT1)和表达β半乳糖苷酶的对照腺病毒载体AdCMVLacZ,将培养的PASMC分为DMEM组、AdCMVLacZ组和AdCMVahAT1组,分别给予不同的干预因素干预PASMC,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT PCR)和免疫组化及彩色图像分析法检测AT1R的表达情况,并用改良的迁移小室进行细胞迁移实验。又将培养的PASMC分为DMEM组,AngⅡ组,AdCMVLacZ+AngⅡ组和AdCMVahAT1+AngⅡ组,用流式细胞仪检测各组PASMC的增殖指数和凋亡率,绘制DNA合成直方图。结果转染AdCMVahAT1后48h的PASMC,AT1RmRNA明显低于对照组[AT1R/βactin吸光度(A)比值:AdCMVahAT1组为0.48,DMEM组为0.97,AdCMVLacZ组为0.96];AdCMVahAT1组AT1R蛋白表达水平(A值为176.39±21.63)显著低于DMEM组(A值为310.21±29.82)和AdCMVLacZ组(A值为306.45±30.09),差异均有统计学意义(P均<0.01),转染AdCMVahAT1后24h的PASMC迁移距离为(40.93±9.69)μm,显著短于DMEM组的(78.23±11.79)μm和AdCMVLacZ组的(77.80±10.66)μm,差异均有统计学意义(P均<0.01)。给予AngⅡ刺激48h,AngⅡ组PASMC的增殖指数(59.69±3.46)显著高于     

血管紧张素Ⅱ2型受体研究进展

血管紧张素Ⅱ2型受体是80年代末发现的血管紧张素Ⅱ受体新成员,主要分布于胚胎及新生儿期组织中,对胚胎期组织、器官的发育和分化起重要调节作用。血管紧张素Ⅱ2型受体表达在出生后迅速下降,成年后基本消失,但在细胞出现过度增殖或肥大时上调,介导抑制细胞增殖、肥大和诱导凋亡的作用,显示出与AT－1受体相反的功能,可能为机体一种内源保护机制。     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用。方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs。以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达。运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用。结果(1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P<0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P<0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响。(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P<0.05),而OPN正义、错配义组无此变化。结论(1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达。(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移。     

骨桥蛋白参与血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移

目的检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对骨桥蛋白(OPN)表达的影响及其涉及的信号传导途径,并探讨OPN在AngⅡ诱导中膜平滑肌细胞(VSMCs)迁移中的作用.方法采用贴壁法培养SD大鼠胸主动脉的VSMCs.以免疫印迹(Western blot)法检测OPN表达.运用Transwell观察反义OPN在AngⅡ诱导的VSMCs迁移中的作用.结果 (1)体外培养的大鼠VSMCs在基础状态下表达一定水平的OPN蛋白,经10-7mol/L AngⅡ诱导24 h后,OPN蛋白水平与对照组相比增加1.3倍(P＜0.05);(2)预先给予AngⅡ1型(AT1)受体拮抗剂氯沙坦(losartan)、胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD98059和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190后,AngⅡ诱导的OPN的表达分别下降44.2%、23.6%及72.5%(P＜0.05),而其2型(AT2)受体拮抗剂PD123319对OPN的表达没有影响.(3)反义OPN可以明显抑制AngⅡ诱导的VSMCs迁移(每个视野平均迁移细胞数目26.34±5.47 vs 50.23±6.12,P＜0.05),而OPN正义、错配义组无此变化.结论 (1)AngⅡ上调VSMCs中OPN的表达;(2)AT1受体、ERK和P38MAPK信号系统参与AngⅡ诱导的OPN表达.(3)OPN参与AngⅡ诱导的VSMCs迁移.     

血管紧张素转化酶基因转染协同厄贝沙坦下调血管紧张素1型受体的表达

目的研究血管紧张素转化酶(ACE)2基因转染对血管平滑肌细胞(VSMC)血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)表达的影响。方法用含有ACE2基因的质粒pm-ACE2转染VSMC,通过RT-PCR和Western印迹比较ACE2基因转染、血管紧张素Ⅱ(Ang)Ⅱ、厄贝沙坦不同干预因素对AT1R表达的影响。结果与对照组相比,AngⅡ使AT1R表达明显增加(P0.05),ACE2转染和厄贝沙坦干预则使AT1R表达明显减低(P0.05);ACE2转染和厄贝沙坦干预均能明显抑制由AngⅡ诱导的AT1R表达。不论有无AngⅡ干预,ACE2基因转染联合厄贝沙坦干预抑制AT1R表达作用较单用ACE2基因转染或厄贝沙坦干预明显增强(P0.05)。结论 ACE2基因转染具有下调VSMC AT1R表达的作用,并且能与厄贝沙坦协同下调AT1R的表达。     

降钙素基因相关肽介导内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化

目的初步探讨内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的分子机制。方法从人脐带血分离、培养、诱导内皮祖细胞分化并鉴定,制备早期内皮祖细胞条件培养基,酶联免疫吸附试验检测降钙素基因相关肽分泌情况。经降钙素基因相关肽抗体预处理内皮祖细胞条件培养基或阻断内皮祖细胞降钙素基因相关肽受体后,采用逆转录聚合酶链反应和免疫印迹观察内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞收缩表型标志基因平滑肌α-肌动蛋白以及合成表型标志基因骨桥蛋白表达变化的作用;进一步观察内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖信号通路(ERK、核因子κB通路)的作用。结果早期内皮祖细胞能够分泌较高浓度的降钙素基因相关肽,并且较晚期内皮祖细胞及脐静脉内皮祖细胞高;内皮祖细胞条件培养基处理能明显抑制血管平滑肌细胞表型转化;阻断降钙素基因相关肽作用后,内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞表型转化的抑制能力明显降低;同时内皮祖细胞条件培养基能够明显抑制血管紧张素Ⅱ诱导的ERK以及核因子κB通路的活化;阻断降钙素基因相关肽作用后,内皮祖细胞条件培养基对血管紧张素Ⅱ诱导的ERK、核因子κB信号通路活化的抑制能力明显降低。结论降钙素基因相关肽参与介导内皮祖细胞抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞的表型转化,其机制可能与其抑制血管平滑肌细胞ERK、核因子κB信号通路活化有关。     

腺病毒介导性基因导入血管平滑肌细胞

目的 :探讨腺病毒介导性基因导入血管平滑肌细胞 ( SMC)的有效性。方法 :选用含有细菌 L ac Z基因的重组腺病毒及脂质体载体导入培养主动脉 SMC并用组织化学法定性定量检测基因表达的产物。结果 :腺病毒与 SMC接触几分钟就可使 SMC转染 ,2 h即可使 10 0 %的细胞受其转染并表达 L ac Z基因 ;基因表达的程度与病毒滴度呈剂量依赖关系 ;转染后 2 4h即可在 SMC中检出外源基因的表达 ,3～ 5 d达高峰 ;脂质体转导法仅可使不足 1%的 SMC表达外源基因 ;腺病毒介导性基因导入法约为脂质体转导法的 2 5 0倍。结论 :本研究获得的腺病毒介导性基因导入 SMC的多种参数 ,可为其未来的研究和治疗应用提供依据     

血管紧张素Ⅱ2型受体基因可调控体外培养的血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶2的表达

目的利用强力霉素—开放可调控哺乳动物表达系统,对体外培养血管平滑肌细胞的血管紧张素Ⅱ2型受体表达进行有效调控,在此基础上对基质金属蛋白酶2的表达受血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂的影响进行研究。方法建立强力霉素可调控表达血管紧张素Ⅱ2型受体基因的双重稳定大鼠血管平滑肌细胞。观察该血管平滑肌细胞中血管紧张素Ⅱ2型受体受调控表达情况,以及血管紧张素Ⅱ及其1型、2型其受体拮抗剂干预上述细胞后基质金属蛋白酶2的表达情况变化。结果强力霉素—开放可调控哺乳动物表达系统可成功介导血管紧张素Ⅱ2型受体基因在原代培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的表达,该表达受到强力霉素给予/去除的紧密调控;强力霉素干预可在48h内迅速诱导该血管平滑肌细胞表达血管紧张素Ⅱ2型受体,该表达在强力霉素干预后72h进一步增强(P<0.01)。血管紧张素Ⅱ2型受体基因的可调控表达抑制由于血管紧张素Ⅱ干预后引起的基质金属蛋白酶2表达的增强(P<0.01)。这一作用被血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂进一步增强(P<0.01);而被加入2型受体拮抗剂干预取消;同时给予上述两种拮抗剂时基质金属蛋白酶2的表达与基础状态时的情况一致。结论血管紧张素Ⅱ干预增强基质金属蛋白酶2的表达,该作用是通过血管紧张素Ⅱ1型受体介导的;经强力霉素诱导表达血管紧张素Ⅱ2型受体基因可以明显抑制这一生物学作用,说明血管紧张素Ⅱ2型受体基因经诱导后表达可以有效调控血管平滑肌细胞细胞外基质合成和降解。