狂犬病毒糖蛋白重组痘苗病毒生物学特性的研究

用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和免疫荧光法检定狂犬病毒糖蛋白重组痘苗病毒（简称重组病毒），证实狂犬病毒糖蛋白在痘苗病毒中得以表达，分子量为６４０００道尔顿。实验表明，重组病毒增殖力比亲本株降低５－１０倍，致细胞病变过程减缓，但增殖曲线和亲本株呈平行趋势，３天达到增殖高峰；重组病毒绝大部分在细胞内，仅不足１％释放到培养液中；在制备鸡胚细胞的同时接种重组病毒，３天收获，用超声波处理后，可提高病毒收获量，在最适条件下可达５ｘｌ０ｌｔｐＦＵ／Ｌ。并探讨重组病毒及其亲本株的蚀斑形成单位（ＰＦＵ）和血凝效价（ＨＡ）之间的相关关系。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白gpK8.1的抗原性与免疫原性分析

目的表达并纯化卡波济肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）包膜糖蛋白gpK8．1，分析其抗原性和免疫原性。方法异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl—βD—thiogalactopyranoside，IPTC）诱导重组大肠杆菌表达KSHVgpK8．1，用KSHV病人阳性血清作为抗体，经ELISA和Westernblot检测其抗原性；用纯化的gpK8．1蛋白免疫新西兰兔，观察诱发抗体产生的时间及其效价，并用Western blot检测兔抗gpK8．1多克隆抗体特异性识别重组与天然gpK8．1抗原的能力，评价其免疫原性。结果ELISA和Westernblot证实3份KSHV阳性血清均能识别重组gpK8．1蛋白；重组gpK8．1蛋白免疫动物6周后，兔血清多克隆抗体效价达到1驴。结论高效表达并纯化的gpK8．1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，为KSHV检测试剂和疫苗研究提供了基础资料。     

狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗的联合免疫研究

目的 研究联合运用狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果。方法 构建狂犬病毒糖蛋白（GP）的真核表达质粒pcDNA3.1/CVS-N2c GP作为核酸疫苗，瞬时转染COS－7细胞，间接免疫荧光试验检测pcDNA3.1/CVS-N2c GP的表达；以基因枪方法进行初次免疫接种和首次加强免疫，以表达同一抗原的复制缺陷型重组腺病毒通过鼻腔接种进行第二次加强免疫；ELISA试验检测血清狂犬病毒特异性IgG抗体，快速荧光灶抑制试验（RFFTT）检测狂犬病毒中和抗体。结果 间接免疫荧光试验表明pcDNA3.1/CVS-N2c GP能有效地表达GP于转染的细胞膜上，ELISA试验表明小鼠接受基因核核酸免疫后，仅诱导产生低水平的特异性抗体，而且重组腺病毒进行加强免疫后，特异性抗体水平显著提高。结论 联合运用狂犬病毒糖蛋白基因重组腺病毒与同种抗原核酸疫苗可克服它们单独使用时各自的缺点，能有效地诱导小鼠产生抗狂犬病毒特异免疫。     

狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建

克隆了狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白(GP)基因，并进行了GP全基因序列测定和对比分析。结果显示CVS-N2c GP基因编码区长1575bp，编码524个氨基酸，与国内外发表的狂犬病毒疫苗株3aG株、ERA株、和HEP-Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为89．0％，89．3％，94．5％，而推导的氨基酸序列同源性分别为87．6％、88．4％、和91．2％。在此基础上，用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒。电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm，Western blot显示重组病毒表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别，表达的GP蛋白分子量约为66kD，与天然的狂犬病毒GP的分子量相符。该表达CVS-N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础。     

用免疫金银染色法和免疫电镜观察重组痘苗病毒对狂犬病毒糖蛋白的表达

用负染及超薄切片的方法电镜观察了表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＴＴＶ１１ＫＲＧ株（简称重组病毒）的纯度、形态与结构，显示重组病毒呈典型的砖形及卵圆形。用特异的抗狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体为一抗，胶体金标记的羊抗鼠ＩｇＧ为二抗，作免疫金银染色，在普通光学显微镜下显示该重组病毒感染的ＣＶ－１细胞膜上存在大量金银颗粒的吸附。进一步作胶体金免疫电镜，显示该感染细胞经金标后细胞膜上存在大量电子密度致密的金颗粒，从而直观地证实了该重组病毒在感染的宿主细胞膜上有大量狂犬病毒糖蛋白的表达。     

狂犬病毒糖蛋白和核蛋白在不同表达系统中的表达

狂犬病波及范围广，所致疾病症状严重，病死率极高，无有效治疗手段，其控制主要依赖于疫苗的接种。狂犬病毒的糖蛋白和核蛋白是有效的保护性抗原成分，常被用来制备亚单位疫苗。糖蛋白和核蛋白在大肠杆菌、酵母、痘病毒、腺病毒、杆状病毒和中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中均进行表达，大肠杆菌中表达出的蛋白无免疫保护作用，酵母、痘病毒、腺病毒和杆状病毒系统中表达出的蛋白在实验室和野外对动物均有一定的免疫保护作用。     

狂犬病毒糖蛋白及核蛋白在非复制型痘苗病毒天坛株中的共同表达

目的　提高重组痘苗病毒狂犬疫苗的有效性和安全性。方法　利用TK区表达狂犬病毒糖蛋白 (RG)的重组痘苗病毒作为亲本株 ,通过两步同源重组 ,删除痘苗病毒基因组CK片段间与毒力和宿主范围相关的核酸片段 ,同时将狂犬病毒核蛋白 (RN)基因插入C K片段之间 ,获得了含有RG基因和RN基因的非复制型重组痘苗病毒VTKRGΔCKLacZRN。结果　经PCR鉴定 ,RN基因已插入CK区 ;Westernblot结果显示 ,该株病毒能同时表达RG和RN ,相对分子质量 (Mr)分别为 6 5× 10 3 和 5 0 5× 10 3。VTKRGΔCKLacZRN在人源细胞如TK 143细胞中不能正常繁殖 ,在鸡胚成纤维细胞 (CEF)中能正常复制。与非复制型重组病毒VTKRGΔCK相比 ,VTKRGΔCKLacZRN免疫小鼠后能更快地诱生较高滴度的中和抗体 ,效果相当于复制型重组病毒VTKRG免疫组 ;它们均能保护小鼠针对致死剂量狂犬病毒国际标准攻击毒株 (CVS)的攻击。结论　VTKRGΔCKLacZRN具有良好的免疫效果和安全性     

重组狂犬病毒在原核细胞中的表达

目的：探讨狂犬病毒Ｎ蛋白的免疫原性,方法：采用生物工程技术,基因重组方法。结果：以狂犬病毒基因文库及ＩＬ－２基因文库设计两对引物,基因扩增后分别得到完整狂犬病毒Ｎ蛋白基因片段（１．４ｋｂ）和ＩＬ－２基因片段（０．４ｋｂ）两基因片段经重组后,构建了狂犬病毒Ｎ蛋白及ＩＬ－２重组基因工程菌,重组基因产物具有特异性生物活性,用ＩＬ－２单抗检测有一定ＩＬ－２活性,免疫小鼠后,小鼠可抵抗狂犬病毒脑内攻击,结论     

狂犬病毒CTN株糖蛋白重组鸡痘病毒与核酸疫苗的联合免疫

目的 构建狂犬病毒糖蛋白重组鸡痘病毒，研究联合运用重组病毒与同一抗原核酸疫苗对小鼠的免疫效果，为狂犬病疫苗的研究提供基础。方法 以中国鸡痘病毒疫苗株282E4为基础构建的表达载体pUTA-2的ATI-P7．5复合启动子下游，插入狂犬病毒CTN-18l株糖蛋白基因，构建了重组转移载体pUTA-RgC。以脂质体转染法将pUTA-RgC转染至已感染鸡痘病毒282E4株(FPV)2～3h的鸡胚成纤维(CEF)细胞中。待细胞出现明显病变后收获病毒，用BrdU进行连续3次加压筛选，挑取蚀斑毒株、纯化、扩增，间接免疫荧光鉴定。用重组鸡痘病毒vUTA-RgC单独及与核酸疫苗联合免疫小鼠，在细胞及体液免疫，攻毒保护水平评价所构建的重组病毒及联合免疫效果。结果 间接免疫荧光结果表明已成功构建重组鸡痘病毒，免疫后能诱导机体产生细胞与体液免疫，并能抵抗标准攻毒株的攻击，联合免疫效果较为理想。结论 获得一株能够表达狂犬病毒糖蛋白的vUTA．RgC，并证明有一定的免疫原性，与核酸疫苗联合应用能够克服各自的缺点。     

小鼠对表达狂犬病毒3aG株糖蛋白的重组复制缺陷型腺病毒的免疫应答

目的研究表达狂犬病毒3aG株糖蛋白(GP)的重组复制缺陷型腺病毒Ad/GP＇及Ad/GP免疫小鼠后所产生的特异性体液免疫应答,体外脾细胞增殖反应,及免疫小鼠对狂犬病毒致死性颅内攻击的保护力。方法1×10     

中国广西狂犬病毒野毒株（CGX89—1株）糖蛋白基因核…

本报告了中国广西狂犬病毒野毒株（ＣＧＸ８９－１株）糖蛋白基因ｃＤＮＡ的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。ＣＧＸ８９－１株的糖蛋白基因从起始密码ＡＴＧ到终止密码ＴＡＡ共有１５７５个核苷酸残基，可编码形成５２４个氨基酸残基的多肽链，经修饰后形成具有５０５个氨基酸残基构成的狂犬病毒糖蛋白。ＣＧＸ８９－１株的糖蛋白基因和核苷酸组成分别为：Ａ占２７．１１％，Ｔ占２６．２９％，Ｃ占２１．９７％和Ｇ占２４．６３％     

狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒的构建及免疫原性的初步研究

目的 构建狂犬病病毒糖蛋白基因DNA真核表达质粒,并检测其免疫原性.方法 用RT-PCR法扩增和分离CTN株狂犬病病毒糖蛋白基因,测序后克隆至pcDNA5.0载体,构建重组质粒pcDNA5.0-G,提取质粒,转化293T细胞,检测糖蛋白瞬时表达,并以该重组质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,狂犬病病毒CVS株攻击,观察小鼠存活情况.结果 酶切、测序结果显示重组质粒pcDNA5.0-G构建成功,瞬时表达结果显示糖蛋白获得大量表达.经肌肉注射质粒常规免疫小鼠,病毒攻击后小鼠保护率为73.3％,对照组为6.7％.结论 所构建狂犬病病毒糖蛋白真核表达质粒pcDNA5.0-G经肌肉注射免疫后可有效保护小鼠免受狂犬病病毒攻击,具有良好的免疫原性,这为后期核酸疫苗的研发奠定基础.     

中国广西狂犬病毒野毒株（CGX89－1株）糖蛋白基因核酸序列测定和分析

本文报告了中国广西狂犬病毒野毒株（ＣＧＸ８９－１株）糖蛋白基因ｃＤＮＡ的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列。ＣＧＸ８９－１株的糖蛋白基因从起始密码ＡＴＧ到终止密码ＴＡＡ共有１５７５个核苷酸残基，可编码形成５２４个氨基酸残基的多肽链，经修饰后形成具有５０５个氨基酸残基构成的狂犬病毒糖蛋白。ＣＧＸ８９－１株的糖蛋白基因和核苷酸组成分别为：Ａ占２７．１１％，Ｔ占２６．２９％，Ｃ占２１．９７％和Ｇ占２４．６３％。核苷酸序列和巴斯德株（ＰＶ株），国际标准攻击毒株（ＣＶＳ株），中国狂犬病毒疫苗株（３ａＧ株）相比，同源性分别为８４．１％，８３．１％和８４．５％。其推导的氨基酸序列和ＰＶ株、ＣＶＳ株和３ａＧ株相比其同源性分别为９２．４％，８９．７％和８９．５％。ＣＧＸ８９－１株也具有３个Ｎ－糖基化位点，分别位于第３７位、１５７位和３１９位的氨基酸残基上。糖蛋白的膜外区部分重要抗原位点和ＰＶ株、ＣＶＳ株及３ａＧ株具有较高的一致性。     

新疆出血热病毒重组核蛋白及糖蛋白片段能诱导小鼠免疫应答

目的研究重组表达的新疆出血热病毒(XHFV)核蛋白和糖蛋白截短片段在刺激机体免疫应答中的作用。方法采用基因重组技术和亲和层析技术对XHFV截短的核蛋白(NP2)、糖蛋白片段(Gc和Gn)进行表达和纯化,并通过蛋白免疫及核酸初次免疫、蛋白加强免疫的方式免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测鼠血清抗体效价,采用T淋巴细胞增殖试验检测细胞免疫应答的效果,对上述表达产物刺激小鼠免疫应答的作用进行初步评价。结果利用原核表达系统成功表达纯化出XHFV核蛋白和糖蛋白截短片段。重组蛋白免疫BALB/c小鼠后能刺激机体产生Ig G(效价为1∶12 800以上),并能与相应的抗XHFV核蛋白及糖蛋白的多克隆抗体发生特异性反应。各组均能有效地激发较强的细胞免疫应答,其中p VAX1-Gc联合r Gc实验组小鼠脾脏淋巴细胞增殖明显,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。结论获得的重组XHFV核蛋白、糖蛋白片段能有效刺激小鼠的体液和细胞免疫应答。     

无细胞百日咳菌苗的抗原性和免疫原性研究

采用百日咳杆菌C.S中国株经培养、盐析、浸提、组分分离以及脱毒等工艺,制备出含有LPF和FHA两种主要免疫原的无细胞百日咳菌苗。SDS-PAGE的结果表明,菌苗的LPF和FHA组分和参考品的相同,测得的分子量与文献报道的结果相一致。小鼠体重减轻、白细胞增多、组织胺敏感以及热原质等试验证明,菌苗中无内毒素;菌苗的免疫原性经我国和日本的国家检定部门检定,其效价为14.5～44.3IPU/ml,说明菌苗是安全有效的,     

中国狂犬病毒疫苗株（5aG）糖蛋白基因在痘苗病毒中的…

将克隆到的中国狂犬病毒疫苗株的糖蛋白基因重组到痘苗病毒ＴＫ区，并在痘苗病毒Ｐ１１启动子控制下，构建了狂犬－痘苗重组病毒。经间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印染证明，重组病互惠ＶＶａＧ能良好地表达狂犬病毒糖蛋白，其分子量约为６６００。