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1.
目的:将抗hTNF-α单链抗体基因克隆入融合表达载体pGEX4T-1中,以期得到GST-ScFv融合表达蛋白。方法:将限制性内切酶酶切拼接法获得的E6ScFv基因克隆入融合表达载体pGEX4T-1中,转化大肠杆菌DH5α,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,12%SDS-PAGE检测表达产物,光密度扫描和Western-blot验证表达产物。结果:SDS-PAGE显示,E6ScFv表达产物约为52ku左右,与预期的结果相符;光密度扫描结果表明,GST-E6ScFv融合蛋白占菌体总蛋白的40%;Western-blot证实,在相应分子量处,有GST-E6ScFv融合蛋白的显色印迹;进一步对表达产物的形式分析,GST-E6ScFv融合蛋白的表达产物为包涵体形式。结论:在大肠杆菌中成功地表达了抗hTNF-α单链抗体基因与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)基因的融合蛋白 相似文献
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目的 在大肠杆菌中表达抗入TNF-α单链抗体(ScFv),并分析它的结合活性和中和活性。方法 在获得抗人TNF-αEScFv基因的基础上,用热诱导载体pBV220在大肠杆菌中表达E6ScFv蛋白。ELISA测定抗体的结合活性,实时BIA技术确定亲和常数。L929细胞毒试验分析其中和活性。结果 克隆了抗人TNF-αE6ScFv基因的热诱导载体pBV220在大肠杆菌中,经42℃热诱导,得到了相对分子质 相似文献
3.
抗内毒素单链抗体基因的构建、序列分析及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建抗内毒素(LPS) 单链抗体基因, 并尝试其在E.coli 中的表达。方法: 采用linker Prim er Mix ,按VHlinkerVL 的结构将鼠抗LPS m Ab C3A2 的VH ,VL 基因拼接成单链抗体(ScFv) 基因;用PE373A 型全自动DNA序列分析仪测定其核苷酸序列。PCR 扩增抗LPS ScFv 基因并更换两端接头序列后,插入谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合表达载体pGEX4T1 ;转染E.coli JM109 ,以IPTG 诱导表达,SDSPAGE 分析表达产物。结果:扩增出的ScFv基因长735bp , 序列分析表明,该序列完整、正确;SDSPAGE 显示,转染入重组质粒p4TC3A2Fv 的JM109 菌经诱导后,有相对分子质量( Mr) 约为52 000 的外源蛋白表达。结论:成功地构建了鼠抗LPS ScFv 基因,并在E.coli JM109中表达了GSTScFv 融合蛋白。 相似文献
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胶质瘤单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的高效表达 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建并高效表达抗胶持瘤单链抗体(ScFv),为基因工程双功能抗体的制备及进一步用于脑肿瘤的诊治奠定基础。方法 以重、轻链可变区基因构建ScFv基因,并克隆入表达载体pGEX-5X-1,在大肠杆菌BL21DE3中诱导表达。以SDS-PAGE及Western blot检测表达产物。结果 以限制性内切酶酶切及DNA测序证实,基因构建正确,表达产物的相对分子质量(Mr)为52000,与理论值相符,表 相似文献
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目的研究人源抗人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)gp120单链抗体(ScFv)。方法以人工合成的HIV-lgp120V3环多肽为抗原,利用噬菌体抗体库技术,筛选含有抗-gp120ScFv基因的噬菌体,提取质粒,转化大肠杆菌HB2151,表达可溶性ScFv。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达产物分子量为28kD左右,且具有c-myc活性;ELISA和Dotblot结果表明,可溶性ScFv具有较好的抗原结合活性和较强的特异性;竞争性ELISA实验结果进一步证明表达产物的特异抗-gp120活性。结论该技术便捷有效,可大量获得人源抗HIV抗体片段,为进一步研究抗HIV抗体的生物活性和HIV感染诊治打下基础 相似文献
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高糖、肿瘤坏死因子促进血管内皮细胞表面整合素(α_vβ_3)表达 总被引:2,自引:0,他引:2
本文采用ELISA方法检测培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表面玻璃连接蛋白受体(VitronectinreceptorVnR即整合素家庭的α_vβ_3)的表达改变;用(51)Cr-标记血小板((51)Cr-platelete,(51)Cr-pL)检测HUvEc的粘附功能;Fura-2/Am负载EC,测定HUVEC胞内游离钙离子浓度([Ca(2+)]),观察了高糖、肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)对EC粘附功能的影响。结果表明:①高糖(30mmol/L)可明显促进EC与PL的粘附(CPM值:361±2l.93VS2l9.67±16.26,n=6P<0.01),抗β3亚单位单抗(β3McAb)可部分阻断EC与PL粘附。TNF-α(1000μ/m1)也有相同作用(CPM值:4l0.7±17.6VS219.67±16.261n=6P<0.01),β3McAb也部分阻断TNF-α诱导的EC-PL间的粘附。②不同浓度高糖和TNF-α不同时间可影响EC表面的α_vβ_3表达,并且在一定范围内有浓度和时间依赖性。③高糖和TNF-α可明显增加EC的[Ca(2+)]i,上述资料提示? 相似文献
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目的:探讨诱导时间对目的蛋白表达量的影响。为大量获得抗TNF-α单链抗体提供实验依据。方法:将E6ScFv基因分别克隆入表达载体pET15b-Etag和pBV220中,构建重组质表达质粒pETE6ScFv和pBVE6ScFv。在化学诱志和温度诱导两种条件下,于诱导后相同时间点等量取菌体,用SDS-PAGE对各时间点表达产物扫描定量。 相似文献
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丙型肝炎病毒结构蛋白在痘苗病毒中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
为研究中国丙型肝炎病毒(HCV)的抗原性及在细胞内的加工,将丙型肝炎病毒(HCV)5’非编码区(NTR)和结构基因(Core+E1+E2/NS1)插入痘苗病毒表达载体pJSA1175中,转染TK-143细胞,经纯化得到丙型肝炎(HCV)重组痘苗病毒vJSA1175CE株。Southernblot杂交表明,HCV结构基因存在于痘苗病毒之中。Westernblot分析发现,vJSA1175CE表达蛋白带位于90kDa,为一多聚蛋白;此蛋白为分泌型,分泌量与细胞裂解物内量大致相同 相似文献
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目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过RT-PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株(2D1,3F8)中克隆出VH和VL基因,然后利用重组PCR技术,将VH和VL基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3的Linker拼接成单链抗体基因(ScFv),将ScFv克隆到表达载体pCANTAB5E上并将其分别在大肠杆菌E.coki HB2151及TG1中进行 相似文献
10.
抗人CD3单链抗体的表达及其分离纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究将构建的抗人CD3单链抗体基因,克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,用IPTG诱导表达GST-ScFv融合蛋白,并以SDS-PAGE分析,在Mr为52000左右出现一条新生蛋白带,表达量约占菌体总蛋白的40%。经初步纯化和复性后,用GST亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗人CD3ScFv,竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有CD3亲和活性 相似文献
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Our aim was to construct the eukaryotic expressional system of single-chain antibody (ScFv(2F9)) derived from a new clone of monoclonal antibody named ZCH-7-2F9 against human CD14 antigen, and to obtain the ScFv(2F9) protein with a high biological activity for further studies on ScFv(2F9) immunotoxin and other kinds of genetically engineered antibodies. Primers were synthesized according to the gene sequence of ScFv(2F9), 4 tandem glysines and 1 serine (Gly4Ser)3 linker and multiple cloning site(MCS) of pSectag2A vector, which included SfiI and EcoRI enzyme cleaving site, 6 x His and stop code TGA sequences. ScFv(2F9) gene was amplified through splicing by overlap extension (SOE) using the high fidelity Taq polymerase. Then the gene was cloned to pGEM-T easy and pSectag2A vectors. Positive recombinants (pSectag2A/ScFv(2F9)) were identified through enzyme cleaving and sequenced before expression. The recombinant plasmids were transfected into Chinese hamster ovary (CHO) cells for expression. The relative molecular weight (MW) and the binding activity of the interesting protein were determined by SDS-PAGE, Western-blot and flow cytometry (FCM), respectively. The scFv(2F9) V(H) is a member of the IgH gene family V(1) subgroup and the scFv(2F9) V(L) gene belongs to the Ig(kappa) gene family V(10) subgroup. The recombined ScFv(2F9) gene was identified to be functional by sequencing and expressing. The interesting protein could be detected in the culture supernatant of transformed CHO cells with a MW of 31 kDa. The blocking test showed that the positive cell percentages, the mean fluorescence intensity (MFI) and the peak of channel (peak Ch) were reduced by 90.02%, 63.3%and 63.38%, respectively after blockage of ScFv(2F9). The ScFv(2F9) gene was cloned and the interest protein against human CD14 antigen has been successfully expressed in eukaryotic cells with a high biological activity, which lays the foundation for further studies on its immunotoxin and other kinds of engineered antibodies. 相似文献
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抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39-PE40的原核表达、纯化及复性研究 总被引:3,自引:1,他引:3
目的 构建抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39-PE40基因并在大肠杆菌中表达。对主要以包涵体形式表达的产物进行变性和复性研究。方法 从质粒pVC85中克隆PE40基因,与抗胶质瘤的单链抗体(ScFv)-SZ39基因进行拼接,构建重组免疫毒素SZ39-PE40基因,并在大肠杆菌中表达,对表达产物(包涵体)进行分离,纯化,变性及复性处理后,以ELISA及免疫荧光技术,检查其对胶质瘤细胞的结合活性。结果 SDS-PAGE及Western blot分析显示,表达产物的相对分子质量(Mr)为68000左右,与SZ39-PE40融合蛋白的理论推算值相符,凝胶灰度扫描显示,其表达量占菌体总蛋白的20%。ELISA及免疫荧光技术均证实,经复性的SZ39-PE40融合蛋白具有结合胶质瘤细胞SHG-4的活性。结论 成功地构建并在原核细胞中表达SZ39-PE40融合蛋白基因,复性的表达产物具有特异性识别胶质瘤细胞的活性。为进一步应用于胶质瘤的导向治疗奠定了基础。 相似文献
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抗胶质瘤重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40的GST融合表达 总被引:5,自引:5,他引:0
目的:以GST融合蛋白的形式表达SZ39(ScFv)-PE40,为抗胶质瘤重组免疫毒素的下游研究与开发准备一条可供选择的路径。方法:将已构建的SZ39(ScFv)-PE40基因克隆入大肠杆菌GST融合表达载体pGEX-5X-1中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以IPTG诱导表达。结果:SDS-PAGE分析显示表达产物以包涵体形式存在,分子质量为95000u左右,与融合蛋白GST-SZ39(ScFv)-PE40的分子质量理论推算值相符;Western blot证实在相应的分子质量处出现特异性显色印迹;凝胶灰度扫描显示其表达量约占菌体总蛋白的25%。结论:重组免疫毒素SZ39(ScFv)-PE40也可以与GST融合表达的形式在大肠杆菌中高效表达。 相似文献
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原核分泌型表达载体的构建及癌胚抗原单链抗体的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的构建分泌型载体并表达癌胚抗原单链抗体。方法以pGEM-11zf(+)为基础,插入化学合成的14个寡核苷酸片段(共176bp),构建成含核糖体结合位点(RBS)、翻译起始点(ATG)、果胶酶信号肽基因(pelB)和翻译终止点(TAA)的分泌型表达载体(RPY)。化学合成带有抗体重、轻链可变区基因插入位点和惰性连接序列的82bp片段,并克隆到RPYpelB信号肽的下游,构建成抗体分泌型表达载体RPYA。将CEA单抗重、轻链可变区基因(VH、VL)插入到RPYA的相应位点,转化大肠杆菌HB2151,IPTG诱导表达。结果序列测定表明RPYA的序列与原设计序列一致,免疫印迹实验表明表达产物具有CEA结合活性,分子量为2.6×103,胞浆内结合有pelB信号肽的表达产物分子量为32×103。结论RPYA载体可用于单链抗体基因的表达 相似文献
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目的 在原核细胞中表达融合蛋白hTNFα-hPgnK5并鉴定其活性,方法 构建hTNFα-hPgnK5基因的表达载体。并在大肠杆菌DH5α中进行表达,以MTT法测定该融合蛋白体外抑制肿瘤细胞或血管内皮细胞增殖的活性。结果 成功地构建了hTNFα-hPgnK5的免疫活性。体外实验表明,该融合蛋白具有抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞增殖的活性。结论 hPgnK5蛋白可与fhTNFα可共同表达,表达产物可抑制肿瘤细胞和血管内皮细增殖。 相似文献
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抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。 相似文献
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将能与血小板膜糖蛋白Ⅲa特异结合的单克隆抗体SZ-21构建成单链抗体。应用RT-PCR技术,从分泌SZ-21单克隆抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,并构建成SZ-21单链抗体(SZ-21ScFv)。将该单链抗体基因亚克隆到高效表达质粒pET20b,得到pET20b-21ScFv。通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli BL21(DE3)PlysS中表达了功能分子。表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的21%。经过包涵体的溶解、Ni-NTA树脂亲和吸附纯化和蛋白质的体外重折叠等一系列的变性和复性过程,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段。ELISA和Western blot证实该融合蛋白保留了与亲本抗体同样的血小板结合特性。SZ-21单链抗体体外能够抑制ADP诱导的血小板聚集,其抑制能力呈剂量依赖性,在浓度为20mg/L时达到最大抑制率。流式细胞仪检测证实该单链抗体能与内皮细胞反应。该单链抗体有望用于血栓性疾病的治疗。 相似文献
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抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1抗体可变区基因克隆、串联和表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的克隆抗人核内不均一核糖核蛋白A2/B1(heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1,HnRNPA2/B1)单克隆抗体的重链可变区(variableregionofheavychain,VH)和轻链可变区(variableregionoflightchain,VL)基因,构建抗HnRNPA2/B1单链抗体(singlechainFv,ScFv)基因,并在大肠杆菌表达。方法采用斑点ELISA、Western印迹和免疫组化检测抗HnRNPA2/B1单克隆抗体3E8的特异性,并通过逆转录-聚合酶链反应、重叠延伸PCR来克隆、串联VH和VL基因,构建抗HnRNPA2/B1ScFv基因pET28(a )表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、竞争抑制ELISA检测表达产物。结果3E8抗体能特异性地与HnRNPA2/B1合成肽以及3株人肺癌细胞内HnRNPA2/B1结合;克隆的VH基因为345bp,VL基因为309bp,符合小鼠抗体可变区特性;抗HnRNPA2/B1ScFv蛋白以包涵体形式表达,分子量约28000,并具有与抗原结合活性。结论成功构建了抗HnRNPA2/B1ScFv基因克隆,并在大肠杆菌中获得了功能性表达,为阐明HnRNPA2/B1与肺癌相关性奠定了实验基础。 相似文献
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Development of a functional monoclonal single-chain variable fragment antibody against Venezuelan equine encephalitis virus 总被引:1,自引:0,他引:1
We have generated a single-chain variable fragment (ScFv) antibody, from a previously well-characterized monoclonal antibody (MAb) to Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus, 5B4D-6. The variable regions of the heavy (V(H)) and light (V(L)) chain antibody genes, were connected by a DNA linker and cloned in the phagemid vector pCANTAB5E. The ScFv clone in Escherichia coli strain TG-1, 5B4D-6-6, was expressed as a approximately 30 kDa ScFv protein and higher molecular weight fusion products which were functional in recognizing VEE virus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results were reproduced in Escherichia coli strain HB2151, where clone D66 was expressed mainly as soluble periplasmic protein. The D66 ScFv antibody bound VEE virus strongly as determined by ELISA. Nucleotide sequence analysis of 5B4D-6-6 ScFv indicated that the Vkappa gene belonged to family XVI, subgroup V, while the V(H) gene was unique in its sequence, though its amino acid sequence could be subgrouped as IA. The deduced protein sequence of D66 was highly homologous to published murine ScFv protein sequences. This work demonstrates, for the first time, cloning of a functional ScFv antibody against VEE virus. 相似文献