α-粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中DNA修复基因DNA-PK的表达和突变分析

目的: 研究α-粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化中DNA修复基因DNA-PK的结构和表达变化.方法:用Northern blot杂交检测基因转录水平,聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析基因编码序列结构变化.结果:癌变细胞中DNA修复基因Ku70(XRCC-6)的编码碱基发生突变,第1 148～1 153位点由AGGATC突变为GAGTAC,致使编码的氨基酸由RI变为EY;细胞恶性转化过程中,DNA修复基因DNA-PKcs(XRCC-7)的表达发生改变,在恶性转化早期即α-粒子照射后第21代就已被抑制,但发生癌变(第35代)后,部分细胞克隆的该基因表达又重新上调.结论:DNA修复基因DNA-PK的结构和表达的变化,导致细胞DNA修复能力缺陷,基因组不稳定性增加,是α-粒子癌变的分子机制之一.     

α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究

目的:建立α-粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化细胞的克隆细胞系,研究其核型和DNA链断裂修复能力.方法:1.5 Gy α-粒子照射的BEP2D细胞传35代后接种裸鼠成瘤,取出瘤细胞进行亚克隆,挑出单个克隆扩大培养,G带显示分析细胞核型,脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂.结果:亚克隆了5个恶性转化细胞系(RP35T-1,-2,-4,-5,-6),核型基本与BEP2D细胞相近,但有着不同的染色体缺失,其中2株细胞(RP35T-2和RP35T-4)多倍体高达40%,明显高于BEP2D细胞.恶性转化细胞RP35T-1和RP35T-4的DNA双链断裂重接修复缺陷.结论:建立了α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的克隆细胞系,DNA链断裂修复缺陷可能是α-粒子致癌的一个重要特点.     

α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究

目的:建立α-粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化细胞的克隆细胞系,研究其核型和DNA链断裂修复能力.方法:1.5 Gy α-粒子照射的BEP2D细胞传35代后接种裸鼠成瘤,取出瘤细胞进行亚克隆,挑出单个克隆扩大培养,G带显示分析细胞核型,脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂.结果:亚克隆了5个恶性转化细胞系(RP35T-1,-2,-4,-5,-6),核型基本与BEP2D细胞相近,但有着不同的染色体缺失,其中2株细胞(RP35T-2和RP35T-4)多倍体高达40%,明显高于BEP2D细胞.恶性转化细胞RP35T-1和RP35T-4的DNA双链断裂重接修复缺陷.结论:建立了α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的克隆细胞系,DNA链断裂修复缺陷可能是α-粒子致癌的一个重要特点.     

α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因cDNA文库的构建

目的: 建立α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的文库.方法:抑制消减杂交法(SSH).结果:建立了3个人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库.其中,A差减文库(永生化人支气管上皮细胞BEP2D的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B差减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver) 有301个克隆,C差减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.,对文库中70个cDNA克隆单向测序后发现:61个cDNA为己知基因,9个cDNA在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因.结论:3个差减文库的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,此为进一步研究α粒子诱导肺癌发生的分子机制奠定了基础.     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮恶性转化细胞DNA修复基因点突变的研究

背景与目的： 研究甲基丙烯酸环氧丙酯(glycidyl methacrylate,GMA)致人支气管上皮(16HBE)恶性转化细胞DNA修复基因点突变情况。 材料与方法： 采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)检测GMA致16HBE恶性转化细胞DNA修复基因hMSH2、XRCC1、XPD及XRCC3的重要位点的突变情况,并以DNA测序方法加以验证。 结果： 16HBE细胞hMSH2 IVS12-6(T>C)位点发生了突变,由野生基因型TT型突变为TC基因型,其它位点未检测到突变。DNA测序结果相符。 结论： 错配修复基因hMSH2 IVS12-6(T>C)位点的突变可能为GMA诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中的重要起始分子事件之一。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱研究

背景与目的 :DNA修复系统在细胞基因组完整性维持中发挥重要作用 ,本研究探讨α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱变化。 材料与方法 :采用Cy5和Cy3分别标记的癌变细胞BERP35T4和亲本细胞BEP2D的cDNA探针与DNA修复基因cDNA微矩阵杂交、ScanArray3000扫描仪扫描和ImaGene3.0软件分析比较基因表达差异。 结果 :分析比较了人支气管上皮细胞癌变前(BEP2D)和后(BERP35T4)126个DNA修复相关基因的表达谱 ,发现细胞癌变后有10个修复基因的表达降低 ,这些基因分别参与DNA链断裂修复、核苷酸切除修复和碱基切除修复反应 ,3个基因(DNA_PKcs、SMUG和RAD18)表达上调。结论 :细胞DNA修复表达改变是辐射诱发细胞恶性转化的机制之一。     

~(238)Puα粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究

目的　建立氡及其子体诱发细胞转化的模型 ,模拟氡致肺癌的过程。方法　利用2 3 8PuO2 释放的α粒子 ,照射体外培养的人支气管上皮细胞系BEP2D ,诱发转化。结果　 1.5Gy单次照射的R15H细胞在连续培养 2 2周后获得了转化 ,转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变 ,生长失去接触抑制 ,ConA凝集现象明显 ,获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力 ,与对照细胞相比均有统计学意义上的增强。结论　从BEP2D到α粒子转化的R15H细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程 ,可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。     

结晶型硫化镍诱发细胞恶变过程中端锚聚合酶mRNA的表达

背景与目的:探讨结晶型硫化镍(NiS)诱发人支气管上皮细胞恶变过程中端锚聚合酶(tankyrase)mRNA的变化。材料与方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞tankyrasemRNA的表达。结果:Tankyrase在细胞恶变过程中不同阶段细胞的表达均高于正常细胞。结论:结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化涉及了tankyrase活性改变,tankyrase活性改变可能是结晶型NiS诱发肺癌的早期分子事件。     

^238Puα粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究

目的 建立氡及其子体诱发细胞转化的模型,模拟氡致肺癌的过程,方法 利用＾２３８ＰｕＯ２释放的α粒子,照射体外培养的人支气管上皮细胞系ＢＥＰ２Ｄ,诱发转化。结果１．５Ｇｙ单次照射的Ｒ１５Ｈ细胞在连续培养２２周后获得了转化,转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变,生长失去接触抑制,ＣｏｎＡ凝集现象明显,获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力,与对照细胞相比均有统计学意义上的增强,结论：从ＢＥＰ２Ｄ到α粒子转化的Ｒ１５Ｈ细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程,可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。     

α粒子诱发BEP2D细胞转化过程中染色体数目的变化

目的：人支气管上皮细胞ＢＥＰ２Ｄ在受到１．５Ｇｙ＾２３８Ｐｕα粒子单次照射诱发转化，观察染色体数目的变化。方法：常规的中期梁色体计数方法。结果：在细胞转化过程中，细胞染色数目不稳定，有向非整倍体发展的趋势，而且主要涉及Ｃ组和Ｄ组染色体的丢失。结论：可能是芰粒子照后细胞转化的早期事件，在转化的启动和促进中发挥重要和。     

α粒子诱发 BEP2D细胞转化过程中肺癌相关基因表达的 cDNA Microarray研究

目的：探讨辐射诱发人支气管上皮细胞（BEP2D）转化过程中肺癌相关基因的表达。方法：用Cartesian PixSys5500cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。提取α离子辐射前BEP2D细胞（原代）和α粒子辐射后20代、35代细胞总RNA,经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中cDNA进行杂交。结果：原代细胞中检测到40个基因表达;20代检测到47个基因表达;35代检测到20个基因表达。所检测的基因中,抑癌基因的mRNA丰度的原代和20代后细胞中急剧下降;大多数癌基因的表达丰度在20代以后细胞中仅轻微下降;生长因子类基因大都在20代细胞表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮转化细胞中,抑癌基因的失活可能与细胞恶化有关,癌基因及生长因子类基因可能促进了细胞的转化。     

XRCC基因多态性与乳腺癌关系的研究进展

肿瘤的发生发展是由于多种因素共同作用所致,DNA的损伤是其中的重要原因之一。XRCC是X线修复交叉互补基因,参与DNA的修复过程。目前已经克隆的有单链断裂修复基因XRCC1和双链断裂修复基因XRCC2-7,有大量研究证明:它们的多态性与乳腺癌的易感性有着密切的相关性。本文就XRCC1-7与乳腺癌易感性的相关性进行综述。     

支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变研究

目的 研究人支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中pl6基因甲基化改变以及pl6基因mRNA转录情况。方法 选取正常人支气管上皮细胞系BEP2D及其经α粒子照射20周(R-20)、21周(R-21)、35周(T-35)和54周(T-54)的BEP2D细胞株作为研究对象(其中R-20、R-21末发生恶性转化，而T-35、T-54已发生恶性转化)．采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测各细胞株中pl6基因的甲基化改变情况，再运用半定量反转录PCR(retro-translation PCR，RT-PCR)检测pl6基因mRNA在各细胞株中的表达情况。结果 ①正常BEP2D细胞株pl6基因未发生甲基化，而R-20、R-21、T-35和T-54细胞的pl6基因均发生了甲基化改变。②与正常BEP2D细胞相比，R-20、R-21、T-35和T-54细胞p16基因mRNA转录水平均降低。结论 pl6基因甲基化改变发生在肺癌形成的早期阶段。p16基因甲基化可导致p16基因mRNA转录水平降低。     

α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中细胞内抗氧化蛋白和活性氧水平研究

目的：研究α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化过程中细胞内主要抗氧化蛋白的表达和活性氧（ROS）水平以及DNA双链断裂水平的变化。方法：选择BEP2D细胞、RH22细胞和BERP35T-1细胞,采用Western blot检测细胞内抗氧化蛋白过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）以及铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和锰-SOD（Mn-SOD）的表达;采用SOD测定试剂盒检测细胞内总SOD（T-SOD）、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD酶活力;荧光探针标记结合流式细胞仪检测细胞内基础H_2O_2和O_2~（？）水平;中性彗星电泳法检测细胞内DNA双链断裂水平。结果：与BEP2D细胞相比,RH22和BERP35T-1细胞内抗氧化蛋白CAT和GPX1表达下调（P〈0.05或P〈0.01）,GPX3、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表达增强（P〈0.05或P〈0.01）;且T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活力均显著升高（P〈0.05或P〈0.01）。RH22和BERP35T-1细胞内基础O_2~（？）水平低于BEP2D细胞,基础H_2O_2和DNA双链断裂水平则高于BEP2D细胞（P〈0.05）。结论：细胞内氧化/抗氧化失衡形成氧化压力,促进DNA氧化损伤和基因组不稳定性,可能是α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化的机制之一。     

nm23参与α粒子辐射致大鼠气管上皮细胞恶性转化的原发过程

目的：克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。方法：采用ｍＲＮＡ差异显示技术识别原代大鼠气管上皮细胞同由α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的差别表达基因。结果;共克隆到１５个可能同α粒子辐射致细胞恶性转化相关的差异表达基因片段,共向ＧｅｎＢａｎｋ登录７条新基因序列。其中克隆ＺＣ７６６同肿瘤转移抑制基因ｎｍ２３高度同源,经Ｎｏｒｔｈｅｒｍ杂交证实其在恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达,序列分析提示ｎ     

EB病毒的BARF1基因在人支气管上皮细胞恶性转化和肿瘤形成中的作用

目的探讨EBV-BARF1基因对人支气管上皮细胞生长特性的影响,并初步探讨其作用机制。方法构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBEC),检测BARF1基因的表达,观察细胞生长状况、生长速度,在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,在软琼脂中形成多个集落,并在裸鼠体内成瘤。结论EBV的早期基因BARF1能明显地改变上皮细胞的生物学行为,使细胞发生恶性转化、获得肿瘤细胞的生长特性,该基因不仅与上皮细胞的早期永生化有关,在细胞的恶性转化及肿瘤形成过程中亦可能起重要的作用。     

卷烟烟气诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化不同阶段的基因表达谱研究

背景与目的:应用基因芯片技术,分析卷烟烟气(cigarette smoke condense,CSC)诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D发生恶性转化不同阶段的基因表达谱变化.材料与方法:用CSC对不同代龄的永生化人支气管上皮细胞BEP2D进行染毒,用软琼脂克隆及流式细胞术对染毒细胞的恶性转化性状进行检测,分离培养已发生恶性转化的软琼脂克隆细胞.分别提取不同代龄染毒细胞的总RNA,选用人类全基因组寡核苷酸芯片Sentrix(R)Human-6 Expression Bead Chip,通过芯片的杂交、清洗及扫描,对染毒细胞的基因表达谱进行分析.结果:用CSC对BEP2D细胞染毒后,从第30代细胞(P30)开始,细胞获得了锚着独立生长特性,流式细胞术分析显示.P40细胞出现多倍体.我们从软琼脂克隆中分离出具有恶性转化特性的细胞C2,与烟气溶剂对照细胞相比,染毒后细胞P10、P20、P30、P40及C2中均表达下调的基因有269个,表达上调的基因有63个,这些基因的改变发生在CSC诱发BEP2D细胞恶性转化的早期阶段.与癌启动相关.CSC染毒后,P10、P20表达没有变化,而在P30、P40及C2中发生表达下调的基因有316个,表达上调的基因有147个,这些基因的改变发生在CSC诱发BEP2D细胞恶性转化的中期,与癌促进相关.结论:从CSC诱发BEP2D细胞恶性转化不同阶段的基因表达谱,筛选出一批与癌症的启动及发展阶段相关的基因,为深入了解吸烟致肺癌的发生、发展机制提供了有价值的信息,同时也为制备吸烟致肺癌相关基因的检测芯片奠定实验基础.     

BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞中60个肺癌相关基因的表达研究

目的：研究永生化人支气管上皮细胞（BEP2D）和α粒子辐射诱发BEP2D细胞后形成的恶性转化细胞（R15Hp35T-2)中60个肺癌相关基因的表达谱。方法：首先搜集了60个肺癌相关的基因，经扩增和纯化后，用Cartesian PixSys550 cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。然后提取BEP2D细胞和R15Hp35T-2细胞的RNA，经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中的cDNA进行杂交。结果：与BEP2D细胞相比，R15Hp35T-2细胞中上调表达的基因有27个，下调表达的基因有7个。大部分抑癌基因的mRNA丰度在2种细胞中表达相似；而大多数癌基因和生长因子类基因的mRNA丰度在R15Hp35T-2细胞中高表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮恶性转化细胞中，癌基因及生长因子类基因可能共同促进了细胞的转化。     

甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化相关DNA修复基因表达改变的研究

目的：检测甲基丙烯酸环氧丙酯（glycidyl methacrylate,GMA）致人支气管上皮细胞（16HBE）恶性转化相关DNA修复基因表达改变的情况,以探讨GMA致细胞癌变的机制。方法：采用＂基因组稳定和DNA修复基因芯片＂分析检测GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中,经鉴定具备恶性细胞表型特征的第30代转化细胞DNA修复基因表达的改变。结果：GMA转化第30代细胞与同代龄对照细胞比较,在113个基因中有8个基因的表达有显著差异,其中7个基因表达上调（ratio〉2）,分别是NBN、RAD50、RAD51、OGG1、XAB2、TOP3A、TNKS;NEIL2基因表达下调（0〈ratio〈0.5）。结论：GMA致16HBE细胞恶性转化是一个多基因参与涉及多通路的复杂过程,DNA修复基因表达的改变可能是该过程中重要的分子事件。     

BRCA1对辐射诱发乳腺癌的作用研究进展

抑癌基因BRCA1的突变几乎存在于所有遗传性乳腺癌与卵巢肿瘤的家属,大约一半家属仅发生乳腺癌,而且其遗传能增加发生乳腺癌和卵巢癌的概率也已被确认,但这种特殊肿瘤的易感性机制还尚未明确。抑癌基因BRCA1产物至少可以通过参与DNA损伤和修复反应途径发挥其肿瘤抑制功能。细胞对DNA损伤反应缺陷会诱发肿瘤,电离辐射可引起DNA簇损伤和双链断裂,成为细胞修复过程的问题。ATM、BRCA1和BRCA2三个基因的编码产物是正常细胞对DNA双链断裂反应所必不可少的,它们突变时就会诱发乳腺癌。其中BRCA1发挥重要作用。