Aβ_(1-42)寡聚体对α-syn过表达SHSY5Y~(A53T)细胞自噬功能的影响

目的构建人A53T突变型α-突触核蛋白过表达的SHSY5Y细胞模型,观察Aβ_(1-42)寡聚体对细胞的毒性作用和自噬功能的影响。方法利用慢病毒稳转方法构建A53T突变型α-突触核蛋白过表达的SHSY5Y细胞及空载体对照细胞,RT-qPCR方法检测SHSY5Y细胞中α-突触核蛋白mRNA的表达。用Aβ_(1-42)寡聚体干预两组细胞24 h,CCK-8法检测Aβ_(1-42)寡聚体对细胞增殖的影响,Western Blot检测细胞自噬相关蛋白的表达水平。结果慢病毒转染SHSY5Y细胞后,过表达组细胞内α-突触核蛋白表达水平较正常细胞组及开载体对照组增加,差异有统计学意义(P0.001);人A53T突变型α-突触核蛋白过表达不影响细胞的增殖;不同浓度Aβ_(1-42)寡聚体(0、0.5μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理细胞24 h后,细胞增殖抑制率成浓度依赖性;Aβ_(1-42)寡聚体处理后,α-突触核蛋白过表达组细胞LC3-Ⅱ,Beclin-1自噬蛋白表达水平较对照组细胞显著降低(P0.05)。结论人A53T突变型α-突触核蛋白过表达不影响的SHSY5Y细胞增殖,Aβ_(1-42)寡聚体对α-突触核蛋白过表达细胞具有显著毒性,对细胞的损伤机制可能通过抑制细胞自噬功能。     

Aβ42寡聚体对PC12细胞损伤作用的研究

目的 研究Aβ42寡聚体对PC12细胞的损伤作用,观察Aβ42寡聚体的聚集状态的变化.方法 用不同浓度Aβ42寡聚体作用于PC12细胞,并与Aβ42作用的PC12细胞、正常PC12细胞进行对照研究.应用MTT、LDH检测细胞活性,原位末端标记（TUNEL）方法检测细胞凋亡.应用原子力显微镜（AFM）观察Aβ42寡聚体的聚集状态、PC12细胞表面形貌变化.结果 MTT、LDH在Aβ42寡聚体组的改变较对照组、Aβ42组差异有显著意义（P＜0.05）;TUNEL法测定Aβ42寡聚体组凋亡率高,较对照组、Aβ42组差异有显著意义（P＜0.05）.Aβ42寡聚体对PC12细胞的损伤作用随浓度增高而增加.原子力显微镜可观察到Aβ42寡聚体、Aβ42的不同聚集状态.结论 Aβ42寡聚体的细胞损伤作用与浓度相关,且强于Aβ42.利用原子力显微镜可观察Aβ的聚集变化.     

糖基化终末产物对人神经母细胞瘤细胞APP表达及Aβ生成的影响

目的通过研究糖基化终末产物（AGEs-BSA）以及阻断其与特异性受体RAGE的结合对培养的人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）的表达以及β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）生成的影响。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为4组,空白对照组、BSA组、AGEs-BSA组、AGEs-BSA＋抗RAGE中和抗体组。用MTT法观察细胞形态以及确定AGEs-BSA的最佳干预时间及浓度。用免疫细胞化学方法及免疫印迹方法来检测各组细胞内APP、RAGE表达和Aβ生成情况。结果不同蛋白浓度的BSA处理细胞24、48、72h,与空白对照组比较细胞MTT代谢率,APP、RAGE及Aβ的表达水平没有明显差异,（P〉0.05）;不同蛋白浓度的AGEs-BSA（〉50μg/ml）处理细胞与BSA组比较,细胞MTT代谢率明显降低,并随蛋白浓度升高差异越明显,APP、RAGE、Aβ的表达水平较BSA组明显增加（P〈0.05）,预先用抗RAGE中和抗体（1∶100）1h后再加入AGEs-BSA,APP、Aβ的表达水平较AGEs-BSA组明显减少（P〈0.05）,但仍高于BSA组（P〈0.05）。结论糖基化终末产物能够促使SH-SY5Y细胞中APP、RAGE、Aβ的表达和生成增加。通过阻断其与特异性受体RAGE的结合可以部分减少APP、Aβ的表达和生成。     

海风藤对β淀粉样蛋白寡聚体激活小胶质细胞的影响

目的 研究海风藤提取物对β淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体诱导小胶质细胞激活的影响.方法 模拟体内生理条件诱导Aβ单体形成Aβ寡聚体,原代培养新生大鼠小胶质细胞,分别用Aβ25-35寡聚体、Aβ25-35寡聚体+海风藤提取物、Aβ25-35寡聚体+DMSO干预小胶质细胞,并设空白对照组,48 h后测上清液中白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)水平,并比较各组间炎性因子差异.结果 Aβ寡聚体组上清液中IL-1β、IL-6水平明显高于空白对照组[IL-1β:(67.06±1.79)pg/mL vs.(36.30±1.40)pg/mL;IL-6:(181.14±4.46) pg/mLvs.(110.90±4.62)pg/mL,均P＜0.05];Aβ寡聚体组上清液中IL-1β、IL-6水平明显高于Aβ寡聚体+海风藤提取物组[IL-1β:(63.24±2.00) pg/mL,IL-6:(170.34±3.47) pg/mL,P＜0.05];Aβ寡聚体组上清液中IL-1β、IL-6水平和Aβ寡聚体+DMSO组[IL-1β:(68.26±1.38) pg/mL,IL-6:(184,7±6.06) pg/mL]比较无统计学差异.结论 Aβ寡聚体能激活小胶质细胞;海风藤提取物能明显抑制Aβ寡聚体诱导小胶质细胞的激活.     

加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究

目的观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制。方法采用5μMAβ_(1-40)作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ_(1-40)处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究。倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平。结果 Aβ_(1-40)孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ_(1-40)孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高。结论加兰他敏通过抑制Aβ_(1-40)诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用。     

靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体的构建及细胞内酸化模型的建立

目的构建靶向人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）RNA干扰（RNAi）腺病毒表达载体,感染SH-SY5Y细胞,建立细胞内酸化模型,为进一步研究细胞内pH值变化与散发性阿尔茨海默病间的关系奠定基础。方法利用基因重组技术构建4个含NHE-1前体微小RNA（miRNA）的重组干扰质粒pcDNA^TM6.2-GW/miR和阴性对照质粒pcDNA6^TM6.2-GW/neg-miR,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测NHE-1 mRNA表达变化,筛选最佳干扰靶序列;BP和LR重组系统获得腺病毒干扰质粒pAd-miR-NHE-1,经包装、纯化后检测腺病毒滴度;感染复数（MOI）值梯度试验确定靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值,以最佳条件感染SH-SY5Y细胞,荧光探针法检测不同处理组细胞内pH值。结果聚合酶链反应（PCR）提示最佳靶向人NHE-1 RNAi病毒表达载体构建成功,且能有效抑制NHE-1 mRNA表达;靶向人NHE-1 RNAi腺病毒感染SH-SY5Y细胞最佳MOI值为160。当最佳MOI值为160时,NHE-1 miRNA腺病毒感染24、48和72 h后SH-SY5Y细胞内pH值分别为5.97±0.03、5.98±0.02和5.98±0.02;空载体对照组为6.05±0.04、6.04±0.07和6.03±0.05;空白对照组为6.03±0.06、6.05±0.04和6.03±0.04。不同测量时间点,SH-SY5Y细胞内pH值均显著低于空载体对照组和空白对照组,差异具有统计学意义（24 h:p=0.002,0.015;48 h:p=0.030,0.012;72 h:p=0.018,0.010）;但感染RNAi腺病毒后不同测量时间点（24、48和72 h）SH-SY5Y细胞内pH值差异无统计学意义（p=0.762）。结论最佳靶向人NHE-1 RNAi腺病毒表达载体及细胞内酸化模型的成功建立,可为探索细胞内酸碱平衡与β-淀粉样蛋白产生之间的关系提供一种有效工具。     

PGN对Aβ1-42寡聚体促进BV2细胞分泌IL-1β的影响

目的探讨前炎介质肽聚糖(peptidoglycan,PGN)激活BV2细胞内吞β淀粉样蛋白(amyloid pro-teinβ,Aβ)1-42寡聚体后,对白细胞介素-1β(IL-1β)分泌的影响及其机制。方法采用细胞株传代法培养BV2细胞替代小胶质细胞,按Klein方法制备Aβ1-42寡聚体。将BV2细胞分为PGN(20μg/mL)组、Aβ1-42寡聚体(0.5μmol/L)组、PGN(20μg/mL)+Aβ1-42寡聚体(0.5μmol/L)组,比较BV2细胞分泌IL-1β水平;将BV2细胞予PGN(20μg/mL)及PGN+SB202190,比较两组IL-1β分泌水平;将不同浓度的PGN(0、5、10、20、40μg/mL)加入BV2细胞中培养,分别检测培养液中IL-1β的水平。采用ELISA方法测定BV2细胞培养液中IL-1β的水平。结果 PGN、Aβ1-42寡聚体、PGN+Aβ1-42寡聚体均可激活BV2细胞分泌IL-1β,分泌IL-1β高峰分别为孵育后24h、12h、24h;孵育后6、12、24h同时间相比,PGN+Aβ1-42寡聚体组BV2细胞分泌IL-1β水平均较PGN组和Aβ1-42寡聚体组明显增多(均P<0.05);PGN激活BV2细胞分泌IL-1β的水平与PGN浓度有剂量依赖关系(P<0.05);丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB202190使BV2细胞分泌IL-1β量明显减少(P<0.01)。结论 PGN可激活BV2细胞分泌IL-1β,且促进Aβ刺激BV2细胞分泌IL-1β增多,p38MAPK抑制剂可抑制IL-1β分泌,推测p38MAPK可能参与BV2细胞分泌IL-1β的过程。     

Aβ寡聚体损伤PC12细胞毒性研究

目的研究Aβ寡聚体对PC12细胞的毒性损伤作用及机制。方法不同比例的Aβ42/Aβ40 Aβ寡聚体作用于PC12细胞构建AD模型,分别应用CCK-8检测细胞活力、ELISA法检测Aβ42蛋白含量,Western blot法检测凋亡相关蛋白Caspase 3表达、自噬相关蛋白Beclin 1及PS1蛋白表达。结果 Aβ42/Aβ40不同比例寡聚体作用于PC12细胞:Aβ42比例越大,Aβ的表达及凋亡越明显,且具有剂量依赖性; PC12细胞活力一定浓度范围呈现增强,超过一定范围后其活力下降; Aβ42/Aβ40对细胞自噬的激活在一定的浓度范围内有效,当浓度过大时,细胞自噬减弱,引起细胞损伤;不同比例Aβ寡聚体损伤PC12细胞,PS1的表达水平无差异。结论 (1) Aβ损伤PC12细胞AD早期细胞模型构建成功;(2) Aβ寡聚体损伤PC12细胞Beclin1蛋白在一定的浓度范围内表达增加,自噬受激活,当Aβ42的浓度达到某一浓度时,Beclin1蛋白的表达减低,自噬被抑制;(3) Aβ寡聚体不改变细胞内PS1的表达水平,其可能通过改变PS1的结构和功能引起Aβ沉积。     

醒脑静对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及机制

目的探讨醒脑静对Aβ25~35诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其机制。方法建立Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡模型;MTT法检测不同浓度醒脑静对Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞增殖的影响;Annexin-V/PI流式细胞分析法检测不同浓度醒脑静对Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响;Western blot法检测细胞中线粒体凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达水平变化情况。结果 SH-SY5Y细胞经过Aβ25~35造模处理后,细胞形态由梭形变为方形,细胞大小固缩,数量减少,凋亡小体形成,凋亡模型构建成功;醒脑静可以促进Aβ诱导的SH-SY5Y细胞增殖;醒脑静可以抑制Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡、下调Bax蛋白表达及上调Bcl-2蛋白表达抑制Aβ25~35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。结论醒脑静对Aβ25~35诱导的SHSY5Y细胞凋亡具有一定的保护作用,其机制可能是通过调节Bcl-2及Bax水平抑制细胞凋亡的发生。     

FZS中药合剂对Aβ42寡聚体致PC12细胞损伤的保护作用研究

目的探讨FZS中药合剂对Aβ42寡聚体致PC12细胞损伤的保护作用,及不同浓度Aβ42寡聚体的PC12细胞毒性作用比较研究。方法分别用不同浓度Aβ42寡聚体作用于PC12细胞,加FZS中药合剂进行干预并与正常细胞进行对照研究。应用噻唑蓝（MTT）、LDH检测细胞活性,同时采用光镜、原位末端标记（TUNEL）方法检测细胞凋亡。原子力显微镜（AFM）鉴定并观察Aβ42寡聚体、Aβ42及细胞表面的形态变化。结果MTT在Aβ42寡聚体组表达明显降低（P＜0．05）；LDH在Aβ42寡聚体组表达明显增高（P＜0．05）；光镜观察及TUNEL染色Aβ42寡聚体组均发现典型的凋亡PC12细胞,凋亡率较Aβ42组差异有显著意义（P＜0．05）。FZS中药合剂组细胞凋亡串均明显降低,差异有显著意义（P＜0．05）。结论Aβ42寡聚体在神经细胞凋亡过程中发挥了重要的作用,其聚集变化可通过AFM进行观察。FZS中药合剂有确切的神经细胞保护作用,其作用与药物浓度相关。     

青蒿素通过Nrf2/HO-1通路改善Aβ_(1-42)对SH-SY5Y细胞的细胞毒性作用

目的研究青蒿素(Artemisinin)在β淀粉样蛋白1-42(amyloid-β1-42,Aβ1-42)诱导的SH-SY5Y细胞毒性作用中的保护性作用及其可能机制。方法 SH-SY5Y细胞分为control组、Aβ1-42组、control+Aβ1-42组和Artemisinin+Aβ1-42组。利用细胞增殖实验检测细胞增殖情况,乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验检测细胞的受损情况,免疫荧光检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达水平,Western blotting检测Nrf2和HO-1蛋白的表达。结果与control组相比,Artemisinin能够改善Aβ1-42对SH-SY5Y细胞的损伤以及增殖活力的抑制。除此之外,Artemisinin还能够抑制Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞内ROS的表达,上调Nrf2和HO-1蛋白的表达。结论 Artemisinin能够通过Nrf2/HO-1通路改善Aβ1-42诱导的氧化应激对SH-SY5Y细胞的毒性作用。     

不同形式Aβ对老年痴呆细胞模型中炎性因子和神经型尼古丁乙酰胆碱受体表达的影响

目的 研究Aβ寡聚体(Amyloid-beta oligomers,Aβoligomers,AβOs)在阿尔茨海默氏病(Alzheimer Disease,AD)患者中的表达情况,用不同聚集形式的Aβ处理拟老年痴呆细胞模型中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosjs factor-α,TNF-α)、炎性趋化因子单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1/CCL-2),巨噬细胞炎性蛋白-1α(Macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α/CCL-3)及神经型尼古丁乙酰胆碱受体(Neuronal nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)的表达.探讨炎性因子及nAChRs与Aβ寡聚体在阿尔茨海默氏病发病机制中的作用.方法 应用免疫组织化学方法检测AD患者(海马结构、颞叶及额叶皮质)Aβ寡聚体的表达.Elisa检测拟老年痴呆细胞模型中各组细胞TNF-α、MCP-1、MIP-lα的表达.Western blotting检测拟老年痴呆细胞模型中各组细胞α3、α7nAChRs的表达.结果 AβOs主要在神经细胞内表达,齿状回颗粒细胞、海马CA1-CA4锥体细胞及内嗅区皮质各层神经元胞体及突起内均见棕黄色粒状阳性表达,此外,小血管壁也见AβOs阳性表达.与老龄对照者相比,AD患者海马各区锥体细胞及内嗅区皮质各层神经元AβOs表达明显增强,半定量分析显示平均灰度值显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01).采用1mol/L浓度的Aβ1-42单体、纤丝体及寡聚体处理SH-SY5Y细胞48h后与对照组相比,Aβ寡聚体处理组α3、α7nAChRs蛋白表达水平明显降低,炎性因子明显升高(P＜0.05).结论 Aβ寡聚体能升高TNF-α、MCP-I、MIP-Iα,加速Aβ沉积,形成恶性循环的慢性炎症过程,降低神经型尼古丁乙酰胆碱受体α3、α7nAChRs的表达,说明AD发病机制中可溶性、呈寡聚状态的AβOs可能是引起AD神经元功能失调的主要神经毒性形式.     

醒脑静对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞线粒体损伤的保护作用

目的 观察醒脑静注射液对Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞线粒体损伤的保护作用。方法 将培养的SH-SY5Y细胞随机分为5组,即(1)正常对照组:细胞正常培养27 h;(2)AD细胞模型组:细胞正常培养3 h,随后用老化的Aβ_25-35(25μmol/L)处理24 h;(3)醒脑静低浓度组:醒脑静注射液(5 μl/mL)预处理细胞3 h,随后用老化的Aβ_25-35(25 μmol/L)处理24 h;(4)醒脑静中浓度组:醒脑静注射液(10 μl/mL)预处理细胞3 h,随后用老化的Aβ_25-35(25μmol/L)处理24 h;(5)醒脑静高浓度组:醒脑静注射液(20 μl/mL)预处理细胞3 h,随后用老化的Aβ_25-35(25 μmol/L)处理24 h; 处理后各组细胞利用MTT法检测细胞存活率,紫外分光光度法检测细胞内ATP含量,流式细胞仪检测线粒体膜电位水平。结果 AD细胞模型组细胞存活率较正常对照组降低(P<0.05),醒脑静不同浓度组细胞存活率较AD细胞模型组均明显升高(P<0.05); AD细胞模型组细胞内ATP含量、线粒体膜电位水平较正常对照组下降(P<0.05),醒脑静不同浓度组细胞内ATP含量、线粒体膜电位水平较AD细胞模型组显著升高(P<0.05)。结论 醒脑静预处理可抑制Aβ_25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,提高细胞存活率,其机制可能与醒脑静提高细胞内ATP含量及线粒体膜电位水平而发挥线粒体保护作用有关。     

Aβ25-35寡聚体对大鼠海马神经细胞的活性影响及形态学观察

目的 研究以β淀粉样蛋白(Aβ25-35)损伤原代培养海马神经元建立Alzheimer病(AD)细胞模型的方法.方法 运用细胞原代培养的方法培养大鼠海马神经元并进行鉴定,以不同浓度Aβ25-35寡聚体建立海马神经元损伤模型,将培养的细胞分为Aβ25-35寡聚体致伤高、中、低剂量组,同时设立正常对照组,倒置显微镜观察细胞形态学变化及通过四唑盐(MTT)比色实验检测细胞存活率.结果 当Aβ25-35寡聚体终浓度为5.0 μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L时,作用于细胞24h,可使神经细胞的形态发生改变和活力显著下降,在显微镜下可见神经元形态有明显的变化,失去贴壁能力或易脱落、突起变短、细胞存活率明显下降,与对照组相比较差异有显著性(P＜0.01).结论 Aβ25-35寡聚体可导致原代培养海马神经元变性、死亡,且有剂量依赖关系,可用于构建AD的细胞模型;并筛选出5.0μmol/L Aβ25-35寡聚体为AD模型的适宜致伤浓度.     

β淀粉样蛋白25-35致神经细胞损伤的机制及信号转导通路初步研究

目的探讨β淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)导致神经细胞损伤的机制及在损伤过程中涉及的信号转导通路中相关酶caspase-3的变化。方法采用荧光染色法、流式细胞法、反转录PCR法研究Aβ25-35对SH-SY5Y细胞的损伤机制及信号转导通路中caspase-3的变化。结果经Aβ25-35处理的SH-SY5Y细胞核中出现浓染的碎块状荧光,流式细胞法检测到凋亡特有的亚二倍体峰,对照组细胞凋亡率为(3.57±0.28)%(n=9),经10、20μmol/L Aβ25-35处理30 h的细胞,其凋亡率分别为(17.44±1.27)%和(38.82±2.06)%,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。反转录PCR产物凝胶电泳的caspase-3与看家基因-βactin的比(0.92)高于对照组(0.19)。结论Aβ25-35促使SH-SY5Y细胞凋亡,此过程中caspase-3转录水平增高。     

鱼藤酮建立帕金森病细胞模型的方法研究

目的探讨鱼藤酮诱导SH-SY5Y细胞建立帕金森病(Parkinson disease,PD)细胞模型的方法。方法实验分为空白对照组及鱼藤酮0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L组共5组,各组分别于鱼藤酮加入24h、48h点,观察SH-SY5Y细胞形态变化,采用MTT比色法检测细胞活力;于24h时采用Western blot法检测细胞α-突触核蛋白(α-synuclein)表达量;对空白对照组及鱼藤酮0.5μmol/L、1.0μmol/L组于24h、48h行HE染色观察细胞内包涵体形成情况。以激光共聚焦免疫荧光法观察鱼藤酮1.0μmol/L组24h时α-synuclein的分布情况。结果空白对照组细胞生长较密,神经突起细长;在鱼藤酮药物组24时,0.5μmol/L组细胞突起变短,1.0μmol/L组细胞突起短缩更明显,2.5μmol/L组胞体肿胀明显,5.0μmol/L组圆缩细胞增多;各浓度组48h时与24h时比较,细胞突起变短、细胞肿胀、圆缩更明显。MTT试验显示1.0μmol/L鱼藤酮24h组和0.5μmol/L鱼藤酮48h组分别使细胞活性下降到空白对照组的(86.06±9.06)%和(62.06±7.13)%,与对照组比较差异均具有统计学意义(P0.05)。Western blot结果显示鱼藤酮0.5、1.0、2.5和5.0μmol/L组SH-SY5Y细胞内α-synuclein相对表达水平分别为(1.23±0.11)、(1.41±0.20)、(1.77±0.09)和(1.31±0.28),其中1.0μmol/L、2.5μmol/L鱼藤酮组α-synuclein水平高于空白对照组(P0.05);HE染色显示,在1.0μmol/L鱼藤酮24h组和0.5μmol/L鱼藤酮48h组均观察到细胞质内出现嗜伊红、边界清楚的类路易小体样包涵体;免疫荧光染色显示在1.0μmol/L鱼藤酮24h组观察到细胞内出现颗粒状α-synuclein免疫染色阳性聚集体,可被Thioflavin S共定位。结论 1.0μmol/L鱼藤酮24h诱导SH-SY5Y细胞所建立的PD模型能够很好地模拟PD病理改变,可作为研究PD发病机制的细胞模型。     

一种稳定阿尔茨海默病细胞模型的建立方法

目的旨在应用不同浓度Aβ_(1-42)诱导新生SD大鼠海马神经元,建立稳定阿尔茨海默病细胞模型。方法分离并培养新生24 h内SD大鼠原代海马神经细胞;分别加入不同浓度Aβ_(1-42)诱导,诱导后采用MTT法观察细胞活力,选取理想Aβ_(1-42)诱导的海马神经细胞作为阿尔茨海默病细胞模型;通过免疫荧光技术(IF)鉴定神经元特异性烯醇化酶(NSE)在海马神经元细胞的表达。结果 Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降,可导致海马神经元细胞胞体变形、收缩和细胞膜完整性破坏,胞间网络结构消失或断裂,细胞外基质乱不清,神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)诱导后的海马神经细胞存活率下降与Aβ_(1-42)浓度成线性关系;加入不同浓度Aβ_(1-42)(0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L)后实验各组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(98.55±1.42)%、(90.37±3.25)%,(66.34±2.76)%、(53.23±3.41)%和(41.55±2.37)%,其中20μmol/L组与0μmol/L组相比P<0.05,30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L组与对照组相比P<0.01。结论 Aβ_(1-42)可导致海马神经元大量凋亡;Aβ_(1-42)浓度为20μmol/L诱导的SD大鼠海马神经元可作为理想的阿尔茨海默病细胞模型。     

早老素-1V97L基因突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响

目的 探讨早老素-1(presenilin-1,PS-1)Val97Leu位点突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响.方法采用一步法定点突变技术,由含有野生型(wild type,wt)PS-1的pcDNA3.1/Zeo(+)质粒合成携带有突变位点Val97Leu的突变型(mutation type,mt)PS-1质粒并转染至神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中,筛选出稳定表达的细胞系.用ELISA法和放射免疫法来检测培养基及胞浆中Aβ42和总Aβ含量;同时检测APP及BACE表达水平的变化.结果48小时,转染突变PS-1基因的细胞,细胞内和细胞外Aβ42的含量较24小时有显著提高,且相对未转染、wt和mock转染的细胞也有显著提高,而各组间总Aβ的含量变化无明显差异.APP及BACE的表达水平各组间也无明显差异.结论 此中国人阿尔茨海默病家系中发现的PS-1基因Val97Leu突变为一新的突变位点,可选择性引起细胞内外Aβ42的增高,因此认为是一病理性突变.     

β-淀粉样蛋白25-35片段致大鼠嗜铬细胞瘤细胞损伤的钙离子机制

目的：探讨水溶性Aβ25-35损伤体外培养大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的钙离子机制。方法：应用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）分析法研究细胞活性的改变，应用激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子浓度的 相对变化。结果：用MTT分析法发现10μmol/LAβ25-35、10μmol/LAβ25-35＋5μmol/L硝苯地平、10μmol/LAβ25-35＋10μmol/L硝苯地平3个实验组的细胞活生较对照组分别下降34．5％、25．1％和11．0％；预加10μmol/L硝苯地平可有效地阻Aβ25-35所致的细胞活性下降。0．1、1、10、20和30μmol/L不同浓度的Aβ25-35可致胞内离子浓度分别升高约6．4％、6．4％、62．2％、69．3％和107．5％，呈一剂量依赖性。预加Aβ25-351min后可以增强氯化钾升高细胞内钙离子的程度。上述两种作用依赖于细胞外钙离子，同时可被L－电压门控钙通道特异性阻断剂硝苯地平所拮抗。结论：水溶性Aβ25-35作用早期可以破坏神经经细胞的钙离子稳态，使细胞对外界生理性或闰理性刺激敏感度增强，空易遭受损伤。     

谷氨酸致人神经母细胞瘤细胞兴奋性毒损伤的机制(英文)

目的探讨谷氨酸导致人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y cells)兴奋性毒损伤的机制。方法MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率;测定乳酸脱氢酶释放量观察细胞损伤程度;DAPI染色法观察细胞凋亡形态学特点;钙流法检测胞浆钙离子浓度变化 ;以胞内谷胱甘肽、超氧化物歧化酶活性和胞外丙二醛含量检测谷氨酸引发SH-SY5Y细胞的氧化应激状态。结果谷氨酸导致SH-SY5Y细胞受损,包括存活率下降、乳酸脱氢酶释放量增多及形态结构发生改变;谷氨酸处理 20 min 后,胞浆钙离子浓度无显著改变,而处理 24 h 后,胞浆钙离子大量增加,且 MK801 (NMDA受体拮抗剂)及LY341495 (代谢型谷氨酸受体拮抗剂)均不能抑制钙离子内流的增多;谷氨酸可导致SH-SY5Y氧化损伤,包括胞内谷胱甘肽含量减少、超氧化物歧化酶活性降低、胞外脂质过氧化产物丙二醛水平升高等,而丹参酮IIA (一种抗氧化剂)可减轻这些氧化损伤。结论谷氨酸导致SH-SY5Y细胞兴奋性毒损伤可能是通过氧化损伤产生的,而不依赖于 NMDA 受体介导的钙稳态的破坏。