Dkk1对骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化的影响

目的：探讨经典Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1对骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）成骨分化的影响。方法：以C3H10T1/2为目的细胞,通过重组腺病毒介导BMP9过表达,联用重组腺病毒Dkk1抑制经典Wnt信号通路。检测各处理组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性变化、钙盐沉积、骨钙素（osteocalcin,OC）、骨桥素（osteopontin,OPN）变化;体内异位成骨实验分析Dkk1对BMP9诱导MSCs成骨分化的影响。结果：BMP9可诱导C3H10T1/2细胞成骨分化;Dkk1显著降低BMP9诱导的C3H10T1/2细胞ALP活性（F=1 467.21,P=0.000）、钙盐沉积、OC（F=32.95,P=0.000）和OPN（F=127.23,P=0.000）蛋白表达;异位成骨模型中Dkk1抑制BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化和骨块成熟。结论：Wnt信号通路胞外拮抗因子Dkk1可降低BMP9诱导的C3H10T1/2成骨分化,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化可能需要经典的Wnt信号通路参与。     

转化生长因子-?茁1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化

目的：探讨转化生长因子?茁1（transforming growth factor-?茁1,TGF-?茁1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）成骨分化过程中的作用。方法：应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-?茁1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型。改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰa2型胶原（collagenⅠa2,COLⅠa2）、骨桥素（osteopotin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化。荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平。结果：TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积（F处理=18 782.10,P=0.000）,持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-?茁1单独处理与对照组间无明显差异（F=1.03,P=0.318）。TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COLⅠa2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高（COLⅠa2的F处理=250.30,P=0.000;OPN 的F处理=795.64,P=0.000;OCN的F处理=206.55,P=0.000）,COLⅠa2增高发生较早和显著（F=250.30,P=0.000）;细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强。TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性（?字2=32.84,P=0.000）。结论：在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-?茁1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-?茁1在成骨分化中可能存在互补效应。     

过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9

目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1 intracellular domain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-RCR）和Western blot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5 d：（33 167.66±2 018.45） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（58 981.33±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5 d：（44 812.66±4 174.94） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（64 622.93±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02） vs. （0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01） vs. （11.80±0.02）,P=0.000],Western blot得到相同结果[（1.32±0.01） vs. （0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01） vs. （0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01） vs. （0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01） vs. （0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01） vs. （0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02） vs. （0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01） vs. （0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against decapentaplegic）信号通路。     

钛纳米管及不同化学诱导条件对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：在不同培养基中,对比研究 SD大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在 TiO2纳米管表面的成骨向分化特点。方法：分离并纯化 MSCs,电化学阳极氧化法制备 TiO2纳米管。使用 4 种培养体系：常规培养体系、抗坏血酸+β-甘油磷酸钠培养体系、抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+1α,25-双羟维生素 D3 培养体系、抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系,分别在光滑面纯钛片,管径 30、70、100 nm 的 TiO2纳米管表面培养 MSCs,3、7、14 d 后检测碱性磷酸酶活性;21 d 后检测钙沉积量;14 d 后real-time PCR检测成骨相关基因Runx2及OSX的表达。结果：同一种 TiO2纳米管结构表面,抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松组碱性磷酸酶活性（F=338.542,P=0.000）、钙沉积量（F=417.012,P=0.000）及成骨相关转录因子 Runx2（F=14.419,P=0.000）和 OSX（F=42.011,P=0.000）的表达均较其他组高,差异具有统计学意义;同一种培养体系下,管径 30 nm 的 TiO2纳米管结构表面碱性磷酸酶活性（F=53.170,P=0.000）、钙沉积量（F=264.268,P=0.000）及成骨相关转录因子 Runx2（F=3.196,P=0.037）及 OSX（F=5.895,P=0.003）的表达均较其他组高,差异具有统计学意义。培养体系与材料结构有交互作用（碱性磷酸酶活性（F=6.322,P=0.000）、钙沉积量（F=33.330,P=0.000）、OSX的表达量（F=2.825,P=0.015）,其中抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系和管径 30 nm的 TiO2纳米管结构是最佳组合。结论：MSCs的成骨向分化与材料的表面结构和诱导药物的化学刺激相关。在相同的 TiO2纳米管结构表面,MSCs在抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系下成骨向分化能力较好;在相同培养体系下,管径 30 nm的 TiO2纳米管结构更有利于MSCs的成骨向分化;抗坏血酸+β-甘油磷酸钠+地塞米松培养体系和管径 30 nm 的 TiO2纳米管结构的组合条件最有利于MSCs 的成骨向分化。     

AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨

目的：研究转录蛋白2（activator protein 2,AP2）α在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法：重组腺病毒 Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△bHLH和AP2α-△TAD抑制 AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）表达,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果：BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、OPN及骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的增高（OC：F=56.929,P=0.000;OPN：F=54.789,P=0.000;OPG：F=159.451,P=0.000）,ALP活性（F=69.776,P=0.000）及红色钙盐沉积减少。结论：BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。     

DLL1在骨形态形成蛋白9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的 探讨Notch配体Delta-like1(DLL1)在骨形态形成蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及机制.方法 利用DLL1重组腺病毒上调永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)中DLL1 mRNA的表达,分别采用细胞化学染色、活性测定对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积的影响;其次裸鼠皮下异位成骨实验进一步了解DLL1的体内成骨作用;最后用qRT-PCR、Western blot和荧光素酶检测DLL1对BMP9经典信号通路中Ⅰ型受体、Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)转录活性影响.结果 与对照组相比,DLL1在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs早期成骨指标ALP活性和晚期成骨指标钙盐沉积的生成;同时也能明显促进BMP9诱导的MSCs裸鼠皮下异位成骨作用;BMP9信号通路中ALK2表达明显增加,而对ALK1则没有影响;Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性明显增加(P＜0.05).结论 DLL1可以促进BMP9诱导的MSCs成骨分化,可能通过影响BMP9信号通路来实现其促成骨作用.     

全反式视黄酸抑制大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及其机制

目的：探索全反式视黄酸（all-trans retinoic acid,at-RA）对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs）成骨分化的影响及其机制。方法：成骨诱导培养基诱导rBMSCs,加入不同浓度（0.1、1.0、5.0 μmol/L）at-RA,诱导第7天用组织化学染色法和检测试剂盒检测各组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性,第21天用茜素红染色后倒置显微镜观察并经提取法后检测钙盐沉积。于诱导第7、14、21天采用real-time PCR检测骨钙素（osteocalcin,OCN）、骨桥素（osteo－pontin,OPN）,在上述时间点的基础上,再增加第1、3天2个时间点检测Runx2、Osterix以及视黄酸受体RARs（?琢、?茁）mRNA表达。结果：rBMSCs在成骨培养基诱导下经形态和茜素红染色观察证实能分化为成骨细胞,加入at-RA后培养7 d,ALP活性较对照组增加（F=107.177,P=0.000）,与对照组比较,at-RA为1.0、5.0 μmol/L 2组明显升高（P<0.05）。然而经茜素红染色测定,ALP升高组其钙盐沉积与对照组比较反而减少（F=57.554,P=0.000）。选at-RA浓度5.0 μmol/L做real-time PCR检测,与对照组相比在上述3个时间点OCN（F=211.145,P=0.000）、OPN（F=30.835,P=0.005）表达均降低,Runx2（F=106.536,P=0.000）、Osterix（F=452.546,P=0.000）、RAR?琢（F=253.159,P=0.000）的表达在第21天均下降,除Osterix表现为全程下调外,其他2个基因也在多个时间点有统计学差异;而RAR?茁表达则全程明显上升（F=2 294.377,P=0.000）。结论：at-RA抑制rBMSCs成骨分化,其机制可能与RAR?琢的下调和RAR?茁的上调,进而影响Runx2、Osterix的表达有关。     

携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒,探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列,将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒,经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒,利用RT-PCR及Western blot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2,采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）,骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及BMP下游靶基因Id 1、Runx 2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒,并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒,转染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达,成骨相关基因Runx 2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2,该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程,从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。     

BMPs与wnt-3a促进C3T3-E1细胞成骨作用的研究

【目的】 在促进MSCs骨形成的众多调节因子中,骨形成蛋白(BMPs)家族在胚胎发育及骨骼形成中扮演重要的角色。目前发现的BMPs家族成员骨诱导活性中,具有成骨活性的有 BMP2、7、9 亚型。除了BMP通路外,wnt通路在骨形成中也起到了重要的作用。本实验旨在进行BMP-2/wnt-3a、BMP-7/wnt-3a、BMP-9/wnt-3a三种联合转染,观察感染后细胞各基因和蛋白的干扰效率及细胞体外成骨分化的影响,评价三种转染的成骨分化能力的强弱,并与单独转染效果进行比较。 【方法】 以cDNA文库为模版,应用PCR方法获得BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a基因的编码序列,经大肠杆菌转化后抽取质粒,构建基因表达质粒载体,酶切鉴定重组体并且经测序进一步确定。然后用pLP/VSVG、pLP2、pLP1质粒与BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a共转染293FT细胞。包装pELNS-BMP2、BMP7、BMP9、wnt-3a后转染小鼠间充质干细胞MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果。茜素红染色检测钙结节,蛋白质印迹和real-time PCR检测成骨相关基因(Runx2)的表达水平,鉴定各成骨诱导因子的单独转染效能。最后用双基因联合转染(BMP-2/wnt-3a,BMP-7/wnt-3a,BMP-9/wnt-3a三组)MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染效果;应用ELISA检测MC3T3-E1细胞培养上清中BGP和ALP的表达水平;应用real-time PCR检测Runx2 mRNA的表达水平;应用蛋白质印迹法检测蛋白的表达水平,鉴定双基因联合转染的成骨分化效能。 【结果】 pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a表达质粒构建成功。重组慢病毒pELNS-BMP2、pELNS-BMP7、pELNS-BMP9、pELNS-wnt3a构建成功,成功转染MC3T3-E1细胞;Runx2表达水平:BMP2>BMP9>BMP7;茜素红染色显示BMP-2钙结节数量最多。双基因联合转染MC3T3-E1细胞,GFP荧光证实转染成功;蛋白质印迹与real-time PCR法显示三组联合转染Runx2表达水平比单独转染明显上升,且联合转染Runx2表达水平:BMP-2/wnt-3a>BMP-9/wnt-3a>BMP-7/wnt-3a; BGP表达与 ALP表达亦然。 【结论】 BMPs能促进间充质干细胞向成骨细胞分化, 其中BMP2成骨效果最好。而BMPs与wnt-3a的联合转染成骨效果高于单独转染,说明BMP通路与wnt通路有协同作用。其中BMP-2/wnt-3a双基因联合转染比另两种转染(BMP-7/wnt-3a和BMP-9/wnt-3a)成骨效能更高。这为组织工程骨重建研究提供了重要的理论依据和技术支持。