两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响

【目的】比较两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响。【方法】20只SD大鼠随机分为尾静脉注射（IV）组和心肌内注射（IM）组各10只,分别于冠状动脉结扎前后在体转染携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光在心肌组织中的表达情况。【结果】术后存活的6只IV组大鼠心肌组织在腺病毒转染后24h和14d均观察不到绿色荧光,但在其肝脏组织中检测到大量绿色荧光表达。术后存活的7只IM组大鼠注射部位心肌在腺病毒转染后24h和14d均检测到绿色荧光表达,而肝脏组织内未见绿色荧光。【结论】心肌内注射法能够使外源基因在心脏组织中特异性地高表达,而静脉注射法却不能。     

两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响

 【目的】 比较两种基因转染方法对外源基因在心肌组织中表达的影响。【方法】 20只SD大鼠随机分为尾静脉注射(IV)组和心肌内注射(IM)组各10只,分别于冠状动脉结扎前后在体转染携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒,荧光显微镜下观察绿色荧光在心肌组织中的表达情况。【结果】 术后存活的6只IV组大鼠心肌组织在腺病毒转染后24 h和14 d均观察不到绿色荧光,但在其肝脏组织中检测到大量绿色荧光表达。术后存活的7只IM组大鼠注射部位心肌在腺病毒转染后24 h和14 d均检测到绿色荧光表达,而肝脏组织内未见绿色荧光。【结论】 心肌内注射法能够使外源基因在心脏组织中特异性地高表达,而静脉注射法却不能。     

质粒重组体在体转染大鼠心肌的可行性

目的：探讨应用阳离子脂质体lipofectamine2000在体转染质粒重组体基因至大鼠心肌的可行性．方法：构建含有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达质粒．将22只雄性SD大鼠随机分为4组：阴性对照组（Ⅰ组，n=4），心肌注射组（Ⅱ组，n=6），尾静脉注射组（Ⅲ组，n=6）和冠状动脉灌注组（Ⅳ组，n=6）．分别采用心肌局部注射、尾静脉液压注射、冠状动脉灌注三种不同方式实施在体心肌转染．Ⅱ～Ⅳ组于转染后2，14d时间点各随机处死3只大鼠，阴性对照组各处死2只大鼠，取心肌组织作快速冰冻切片，荧光显微镜下观察EGFP表达情况．结果：在荧光显微镜下观察EGFP表达情况，阴性对照组隐约可见淡绿色荧光，第2天各转染组均可见明显的绿色荧光分布于所取心脏组织．各转染组荧光强度与阴性对照组相比，其差异均有统计学意义（P〈0．05）．心肌注射组和尾静脉注射组间荧光强度差异无统计学意义（P=0．17）．冠状动脉灌注转染组荧光强度较其余两组增强7．37倍（P=0．013）．第2周转染各组荧光强度明显减弱，与阴性对照组差异无统计学意义（P=0．41）．结论：阳离子脂质体lipofectamine2000可有效的将质粒重组体通过各种方式转染心肌组织，而通过冠状动脉灌注转染可以明显提高其转染效率．     

9型重组腺相关病毒转染microRNA-21前体在大鼠心肌的转染效率及安全性

目的 研究含荧光标记ZsGreen的9型重组腺相关病毒(rAAV9)转染目的基因microRNA-21前体(pre-miR-21)至大鼠心肌的转染效率、表达时间及安全性.方法 用冠脉注射方法转染PBS及rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21 1.0×1010 vg/只、1.0×1011 vg/只、1.0 x 1012vg/只至SD大鼠心肌,倒置荧光显微镜观察心肌组织荧光表达并计算转染效率,Realtime PCR方法测定miR-21表达,超声心动图观察大鼠心功能.结果 冠脉注射后7 d PBS组未见绿色荧光,余各组大鼠心肌均可观察到少量绿色荧光表达,第14天达高峰,之后呈下降趋势.14d高病毒量组较其他中、低病毒量组转染效率明显高[(73.7±8.4)％ vs (39.6±4.8)％,(P＜0.001)];[(73.7±8.4)％ vs (24.1±4.2)％,(P＜0.001)].14d miR-21表达在低、中、高病毒量组较PBS组分别增加1.51倍、2.89倍及4.43倍.rAAV9转染后对大鼠心功能无影响(P＞0.05).结论 rAAV9-Zs-Green-pre-miR-21可以有效、持久、安全地在大鼠心肌表达.     

腺相关病毒载体介导Zs Green基因在体转染大鼠心肌组织的实验研究

目的 观察腺相关病毒载体9型(AAV9)介导Zs Green基因在体转染心肌组织的效果.方法 采用冠状动脉灌注法将携带报告基因Zs Green的腺相关病毒9型(AAV9-Zs Green)以不同滴度(5×106TU,1×107TU)转导至大鼠心肌组织,分别于转染后1、2和4周在荧光显微镜下观察大鼠心肌组织绿色荧光表达情况.结果 病毒载体转染1周后心肌组织可见绿色荧光表达;2周时可见大量绿色荧光表达,荧光强度较1周时明显增强(P＜0.01);4周时荧光强度较2周有所减弱(P＜0.05),但仍有较强表达;随着病毒转导滴度提高,荧光强度明显增加(P＜0.05).结论 腺相关病毒载体能够有效介导Zs Green转染大鼠心肌组织,并长期稳定表达.     

同一滴度不同方法转染AAV9-SERCA2a基因对大鼠的有效性和毒副作用评价

目的 研究同一滴度不同心脏基因转染方法转染携带肌浆网钙ATP酶2a（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a,SERCA2a)基因的9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype9,AAV9)即AAV9-SERCA2a对SD大鼠心肌的有效性及对机体毒副作用的影响。方法 体外成功构建AAV9-SERCA2a-EGFP病毒载体系统,90只雄性SD大鼠随机分为尾静脉注射（Tail vein injection,TVI）组、心肌注射（Intramyocardial injection,IMI）组、心包腔注射（Intrapericardial injection,IPI）组,采用相应方法在体分别转染滴度1×1011 vg/mL AAV9-SERCA2a-EGFP、AAV9-EGFP、NS各200µL。转染后30d,荧光显微镜下观察心肝肾组织绿色荧光表达情况,Western Blot检测SERCA2a基因在大鼠各组织的相对表达量,体表12导联心电图检测心律失常发生率,HE染色观察病理学变化,心脏彩色多普勒超声评价心功能,血液生化学指标检测肝肾功能。结果 三组左心室可见大量绿色荧光表达,IMI组荧光局限在注射点,三组肝肾组织均可见微弱荧光;三组心肌SERCA2a蛋白相对表达量显著高于肝肾（P<0.01）,TVI组和IMI组心肌SERCA2a蛋白相对表达量明显高于IPI组（P<0.01）;TVI组和IPI组心电图正常,IMI组2只大鼠发生室性早搏;三组转染AAV9-EGFP、AAV9-SERCA2a-EGFP与转染NS相比,心功能、组织病理学、血液生化学指标均无显著差异（P>0.05）。结论 三种方法转染滴度1×1011 vg/mL AAV9-SERCA2a基因,TVI法和IMI法在心肌的有效性优于IPI法,TVI法和IPI法对机体的毒副作用小于IMI法,综合三种方法的有效性和毒副作用评价,TVI法优于IMI法和IPI法。     

BDNF-GFP转染神经干细胞对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响

目的探讨脑源性神经营养因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）和绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）转染后神经干细胞（Neural Stem Cells,NSCs）移植对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响。方法以携带BDNF-GFP基因的腺病毒转染NSCs,免疫组化及Western blot检测转染后NSCs BDNF表达。40只Wistar大鼠中假手术组8只,32只大鼠制成T9左侧横断模型,并随机分成四组：BDNF和GFP修饰的N-SCs移植组、GFP修饰的NSCs移植组、单纯NSCs移植组和模型组。在各NSCs移植组,脊髓损伤后向横断处显微注射等体积细胞,模型组在相同的部位注射等体积的PBS。实时定量PCR检测各实验组BDNF表达情况。结果免疫组化显示BDNF-GFP转染的NSCs可表达BDNF（黄色荧光）。Western blot结果显示BDNF-GFP转染的NSCs可表达相对分子质量约为41kU的融合蛋白条带。NSCs移植可使BDNF的表达量明显增高（P〈0.05或P〈0.01）,以BDNF-GFP转染的NSCs移植组BDNF表达量最高（P〈0.01）。结论 BDNF-GFP转染后NSCs可在脊髓半切模型中存活并高表达具有生物活性的BDNF。     

慢病毒载体介导的 shRNA 沉默非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ A 对骨髓间充质干细胞旁分泌的影响

目的：观察慢病毒介导 shRNA 沉默非肌肉球蛋白重链ⅡA（MYH9）对骨髓间充质干细胞（BMSCs）旁分泌功能的影响。方法采用脂质体法将含 MYH9干扰序列的 pHBLV －U6－ZsGreen －Puro（实验组）质粒转染到293T 细胞,以转染 pHBLV －U6－ZsGreen －Puro 空载质粒的细胞为空载组,以正常未转染细胞为对照组,包装产生的病毒液感染 BMSCs。用荧光显微镜观察荧光蛋白表达;以β－actin 为内参,分别用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT －PCR）和免疫印迹（Western blot）检测 MYH9 mRNA 及蛋白表达;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测其培养基上清液中血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、促血管生成素1（ANG －1）和促血管生成素2（ANG －2）的含量。结果成功构建重组质粒 pHBLV －U6－MYH9－ZsGreen －Puro,转染293 T 细胞产生高滴度慢病毒,荧光显微镜下可见被慢病毒感染的 rBMSCs 表达强绿色荧光蛋白,qRT －PCR 和 Western blot结果显示2条慢病毒感染 MYH9 mRNA 表达水平明显下调,显著低于对照组和空载组（P ＜0．05）;沉默 MYH9基因后,实验组的 ANG －1和 bFGF 在增殖末期较对照组和空载组有明显上升（P ＜0．05）,ANG －2和 VEGF 未见明显差异（P ＞0．05）。结论pHBLV －U6－MYH9－ZsGreen －Puro 慢病毒包装质粒转染 BMSCs 后,BMSCs 旁分泌能力未受明显影响。     

腺病毒载体转染大鼠颈动脉的实验研究

目的观察腺病毒载体转染大鼠颈动脉的有效性和外源性基因表达的时间过程。方法用ＡｄＶ５－ＣＭＶ质粒（对照组）或Ａｄｖ５－ＣＭＶ／ＬａｃＺ质粒（治疗组）转染大鼠颈动脉３０分钟。术后２、７、１４、２８、６０及９０天取被转染的颈动脉,行β－半乳糖苷酶活性测定和组织化学染色。结果对照组所有颈动脉均无β－半乳糖苷酶活性,治疗组术后２天颈动脉即有β－半乳糖苷酶的表达,７～１４天为表达高峰期,２８天后表达量明显减少,但可持续表达３个月之久。治疗组术后２、７、１４、２８、６０及９０天每条颈动脉均可见蓝染,其中术后７及１４天每条颈动脉横切面的全周均有蓝染,血管壁内层、中层的大部分细胞被染成蓝色。对照组所有动脉均未见蓝染。结论腺病毒载体能高效转染大鼠在体颈动脉。转染后,外源性基因的高水平表达只能维持１个月左右。     

转γ-干扰素基因大鼠肝细胞模型的建立

目的：使用多聚阳离子脂质体载体（ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ）在体外建立转γ干扰素（ＩＦＮγ） 基因的大鼠肝细胞模型。方法：利用ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ在体外将ＩＦＮγ基因转染大鼠肝细胞。分别以ＲＴＰＣＲ 和ＥＬＩＳＡ方法检测所转ＩＦＮγ基因在大鼠肝细胞的转录和表达情况。结果：以ｌｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ为载体的ＩＦＮγ基因转染大鼠肝细胞后,可被有效的转录并产生具有生物活性的ＩＦＮγ。结论：ＩＦＮγ基因可被成功转染入大鼠肝细胞并可有效表达。这可能为细胞因子的免疫治疗提供一种新途径。