重组腺病毒Ad-P2G-DCN的构建及在HEK-293细胞中的表达

目的制备表达基质细胞衍生因子(SDF-1)拮抗剂P2G与饰胶蛋白聚糖(decorin,DCN)嵌合基因的重组腺病毒,并检测其在HEK-293细胞中的表达情况。方法以前期构建的pET-30a+/P2G-DCN为模板,PCR扩增目的基因P2G-DCN,并克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV;然后将化学合成的SDF-1信号肽序列插入P2G-DCN的5’端,构建为重组穿梭质粒pAdTrack-CMV/SP-P2G-DCN;经PmeⅠ酶切线性化,与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,筛选重组腺病毒质粒pAd-SP-P2G-DCN。PacⅠ酶切线性化的pAd-SP-P2G-DCN通过脂质体介导转染人胚肾转化细胞系HEK-293,包装并扩增重组腺病毒Ad-P2G-DCN。荧光计数确定病毒感染滴度,并以Western blot法检测嵌合蛋白P2G-DCN在HEK-293细胞中的表达情况。结果构建了携带P2G-DCN基因的重组腺病毒,该重组腺病毒感染HEK-293细胞后可高效分泌表达重组嵌合蛋白P2G-DCN。结论成功构建了重组腺病毒Ad-P2G-DCN,为后续系统研究Ad-P2G-DCN在肿瘤基因治疗中的作用奠定了实验基础。     

人K562细胞糖皮质激素受体基因阻断模型的建立

目的 利用腺病毒载体介导的RNAi技术，建立糖皮质激素受体基因阻断的人K562细胞模型。方法 将针对糖皮质激素受体发挥RNAi效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中，在含有pAdEasy-I病毒骨架的BJ5183大肠菌内进行同源重组；重组体通过脂质体介导转染293T细胞，并在293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒，通过反复感染扩增病毒以达感染靶细胞的适当滴度，通过绿色荧光表达来监测腺病毒扩增；应用Western blot法检测人K562细胞感染病毒后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果 重组腺病毒穿梭质粒psiGR/Adeno和重组腺病毒pAdEasy-siGR的成功构建；转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光，随着时间逐渐增强并且出现明显的细胞病变效应，经过3轮扩增，病毒达到合适的滴度；受腺病毒感染的K562细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论 可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNAi腺病毒载体，为进一步研究糖皮质激素受体的生物学功能奠定基础。     

人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白,功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程,多水平、多通路地调节靶因子,其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系,文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接,构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein,GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后,转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率,用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功;重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达;获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测,SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比,SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET,并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用,为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。     

编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体构建及鉴定

目的:构建编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体.为进一步研究其蛋白功能提供工具.方法:穿梭质粒pAdTrack-CMV-PGC1α线性化后与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183菌中完成同源重组,筛选并提取重组正确的腺病毒质粒,PacI线性化,脂质体转染293细胞包装出成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒,TCID50法测定病毒滴度,Western bloting检测PGC1α蛋白在293细胞的表达.结果:测序及酶切鉴定表明目的基因正确插人穿梭质粒,读码框未发生移位.重组腺病毒扩增后滴度约3×1010TCID50/ml,能在293细胞中表达PGC1α蛋白.结论:利用细菌内同源重组的方法成功构建了编码小鼠PGC1α基因的重组腺病毒载体,并观察到其蛋白表达.     

小鼠雌激素受体α基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建C57BL/6小鼠雌激素受体α（Esr1）重组腺病毒表达载体,扩增并纯化重组腺病毒颗粒.方法：采用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠卵巢细胞扩增目的Esr1 CDS区基因片段,至pMD19-TSimple载体后测序鉴定.亚克隆Esr1CDS区基因片段至腺病毒穿梭质粒pDNR-CMV,再与骨架质粒pLP-Adeno-X-CMV在感受态大肠杆菌ElectroMAXTMDH10BTMCells中进行同源重组获得腺病毒载体质粒Adeno-Esr1,PacI酶切线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,测定感染性滴度,获得重组腺病毒Ad-Esr1.将病毒感染HEK293细胞,Western Blot检测Esr1蛋白表达.结果：测序证实提取的Esr1 CDS区基因序列完全正确;测序及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功;感染性滴度为6.4×1013（pfu/L）,Western Blot检测Ad-Esr1感染的HEK293细胞能表达Esr1蛋白,而未感染的HEK293细胞蛋白不表达.结论：成功构建了C57BL/6小鼠Esr1基因重组腺病毒载体,为进一步研究Esr1在神经系统中生物学功能及对神经系统疾病的基因治疗奠定了基础.     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

【目的】为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制，构建其重组腺病毒载体，并在PC12细胞中表达。【方法】RT—PCR获取大鼠DNA多聚酶β（POLβ）的编码序列，TA克隆测序，酶切POLβ基因并连人穿梭质粒pAdTrack—CMV，电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183。重组腺病毒质粒（pAd—polp）和Lipofectamine2000转染293细胞，用重组腺病毒感染PC12细胞。【结果】10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致，同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带。DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后，感染Ad—polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光，重组腺病毒Ad—polβPCR鉴定含目标条带，Ad—polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达。【结论】成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

hHGF腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建人重组肝细胞生长因子(human hepatocyte growth factor,hHGF)基因腺病毒载体(Ad-HGF),转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs),为转基因治疗提供实验基础.方法:设计含有SalⅠ及XbaⅠ酶切位点的引物,PCR扩增hHGF,将扩增产物克隆到带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的pAdTrack-CMV穿梭质粒上.重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组,筛选获得含有hHGF的重组腺病毒质粒,PCR、酶切鉴定并测序.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化,脂质体转染293A细胞,经3轮扩增,制备高效表达的AdGFP/HGF,并转染hucMSCs.结果:重组腺病毒质粒经PCR和SalⅠ,XbaⅠ酶切鉴定,证实含有HGF基因,测序结果和设计片段的序列一致.荧光显微镜下发现293A细胞发光率几乎为100%,感染的hucMSCs亦可表达绿色荧光蛋白.结论:成功构建了hHGF腺病毒表达载体,并获得高滴度的病毒, 能高效感染hucMSCs,为后续研究奠定了基础.     

Ad-HBx的构建及在肾小球足细胞系的表达

目的 构建携带HBx基因的非复制型重组腺病毒载体,并感染小鼠肾小球足细胞株MPC5,使目的 基因HBx在该细胞株有效表达.方法 由质粒PCI-neo-HBx中扩增目的 基因HBx.插入至pShuttle-CMV(-)穿梭质粒中,而后再与pAdxsi质粒酶切连接为重组腺病毒质粒pAd-HBx,经酶切及测序鉴定正确后,以Pac Ⅰ酶切线性化转染293细胞进行包装扩增得到Ad-HBx.以Ad-HBx感染MPC5细胞,Western blot检测感染后目的 蛋白HBx的表达.结果 重组腺病毒载体经限制性内切酶酶切、电泳和基因测序鉴定,证实Ad-HBx构建成功;当MOI=50时.MPC5细胞即可100%被重组腺病毒感染,且持续至感染后72 h仍有较强水平的表达;感染Ad-HBx的MPC5细胞可稳定表达HBx蛋白.结论 成功构建了Ad-HBx,并能在MPC5细胞中稳定表达,为进一步研究HBx基因在乙型肝炎病毒相关性肾炎发病中的作用奠定了基础.