免疫磁珠分选骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit+lin-

目的:利用免疫磁性细胞分选系统分离纯化骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit lin-。方法:实验于2006-07/08在南方医科大学实验动物中心完成。6～8周龄的SPF级纯系BALB/C雄性小鼠10只,体质量18～20g。收集小鼠股骨骨髓细胞,利用免疫磁性细胞分选系统,通过两步法分选纯化c-Kit lin-:将获取的lin-细胞悬液8℃条件下1500r/min离心10min,弃上清,按80μL/107加入Buffer重悬细胞。按20μL/107加生物素抗体磁珠,混匀,4℃冰箱孵育15min,按1mL/107加入Buffer洗细胞1次,8℃条件下1500r/min离心10min,弃上清,按500μL/108加入Buffer重悬细胞。Buffer500μL润MS柱,悬液过柱后,Buffer500μL/次洗柱3次,柱子脱离磁场,加1mLBuffer,用配套柱塞推出柱中的c-Kit lin-细胞,收集到c-kit lin-细胞,细胞计数。取2.0×106个细胞分成10等份,流式细胞仪分析c-Kit lin-细胞纯度,计算回收率,评估纯化效率,苔盼兰染色检测纯化前后的细胞活力。计算活细胞的百分率。细胞纯度和细胞回收率的计算:细胞纯度=分离产物中的阳性细胞数/分离细胞的总细胞数×100%,细胞回收率=分离产物中的阳性细胞数/起始标本阳性细胞总数×100%。结果:10只小鼠均进入结果分析。利用免疫磁性细胞分选系统分选出的骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit lin-细胞纯度和回收率分别为(77.98±2.34)%,75.40%,纯化前后细胞活力不受影响。结论:免疫磁性细胞分选系统能有效分选骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit lin-,纯度和回收率高,且不影响细胞活力。     

免疫磁珠分选骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit~+lin~-

目的：利用免疫磁性细胞分选系统分离纯化骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit^＋lin^-。方法：实验于2006—07／08在南方医科大学实验动物中心完成。6～8周龄的SPF级纯系BALB，C雄性小鼠10只，体质量18～20g。收集小鼠股骨骨髓细胞，利用免疫磁性细胞分选系统，通过两步法分选纯化c-Kit^＋lin^-：将获取的lin^-细胞悬液8℃条件下1500r/min离心10min，弃上清，按80μL/10^7加入Buffer重悬细胞。按20μL/10^7加生物素抗体磁珠，混匀，4℃冰箱孵育15min，按1 mL/10^7加入Buffer洗细胞1次，8℃条件下1500r/min离心10min，弃上清，按500μL/10^8加入Buffer重悬细胞。Buffer 500μL润MS柱，悬液过柱后，Buffer 500μL/次洗柱3次，柱子脱离磁场，加1mL Buffer，用配套柱塞推出柱中的c-Kit^＋lin^-细胞，收集到c-kit^＋lin-细胞，细胞计数。取2．0x108个细胞分成10等份，流式细胞仪分析c-Kit^＋lin^-细胞纯度，计算回收率，评估纯化效率，苔盼兰染色检测纯化前后的细胞活力。计算活细胞的百分率。细胞纯度和细胞回收率的计算：细胞纯度：分离产物中的阳性细胞数，分离细胞的总细胞数×100％，细胞回收率：分离产物中的阳性细胞数，起始标本阳性细胞总数×100％。结果：10只小鼠均进入结果分析。利用免疫磁性细胞分选系统分选出的骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit^＋lin^-细胞纯度和回收率分别为（77．98±2．34）％，75．40％，纯化前后细胞活力不受影响。结论：免疫磁性细胞分选系统能有效分选骨髓衍生肝干细胞亚群c-Kit^＋lin^-，纯度和回收率高，且不影响细胞活力.     

免疫磁珠法分选骨髓CD34^＋细胞：纯度影响因素的分析

背景：免疫磁珠分选技术已成为分选CD34^＋细胞的主要方法之一,在长期实验中发现诸多因素影响其分离纯度,包括磁珠与细胞孵育时干冰与碎冰的使用、磁珠与细胞孵育及分离时摇床的摇摆方向、红细胞裂解液裂解单个核细胞的使用等。目的：在免疫磁珠分选CD34^＋细胞过程中分别对上述影响因素进行分析改进,以提高分选CD34^＋细胞的纯度。设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2008-07/2009-03在太原市中心医院皮肤科实验室完成。材料：骨髓象筛选正常的人骨髓29份,由太原市中心医院血液科提供,取材均经患者同意。CD34^＋免疫磁珠为Dynal公司产品。方法：采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离培养人骨髓单个核细胞,用免疫磁珠法分选骨髓CD34^＋细胞,对其分选过程中的主要环节如冰块与碎冰、摇床的种类以及红细胞裂解液的使用进行方法改进。方法1：按试剂盒提供方法进行磁珠常规分选CD34^＋细胞。方法2：在方法1基础上,用碎冰替代冰块进行磁珠与单个核细胞孵育。方法3：在方法2基础上,用万向摇床替代水平摇床。方法4：在方法3基础上,向单个核细胞中预先加入红细胞裂解液裂解残留红细胞。主要观察指标：通过流式细胞仪检测不同方法分选出的CD34^＋细胞纯度。结果：随着不同环节的逐渐改进,CD34^＋细胞纯度由（32.7±6.6）%升至（84.5±5.2）%,方法1,2,3,4所分选出的CD34^＋细胞纯度逐渐升高,组间方差分析差异显著（F=76.209,P〈0.01）,Bonferroni法两两比较差异亦有非常显著性意义（P〈0.01）。结论：碎冰、万向摇床及红细胞裂解液的使用能有效提高免疫磁珠法分选人骨髓CD34^＋细胞的纯度。     

骨髓衍生肝干细胞的可塑性及应用前景

目的:骨髓干细胞具有向其他细胞或组织分化的的能力,这种可塑现象同样存在于肝脏组织中。文章综述骨髓衍生肝干细胞的来源和发生,并探讨其可塑性在肝病领域的研究进展和临床应用前景。资料来源:应用计算机检索PUBMED1990-01/2006-06期间的相关文章,检索词为"stem cell,hepatic",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库CNKI1990-01/2006-06期间的相关文章,检索词为"肝,干细胞",并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与肝干细胞相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到231篇相关文献,31篇文献符合纳入标准,排除的200篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的31篇文献中,分别涉及骨髓衍生肝干细胞横向分化的可塑性依据、分离和鉴定、向肝迁移分化的机制与调控因素、在肝病领域的应用前景。资料综合:近几年研究证实,在骨髓细胞中确实存在肝前体细胞,它们不仅可以在肝内定居,而且可以分化形成肝细胞和胆管细胞,这种细胞通常在文献中称为骨髓衍生肝干细胞。CD34( ),C1qR( ),CD133( ),C-kit( ),Thy1( ),Sca-1( )等骨髓造血干细胞群中都含有骨髓衍生肝干细胞亚群,但对该细胞群中特有的表面分子组合及体外扩增等特性还未见报道。近来在放射性小鼠肝损伤修复领域发现,c-kit Lin-(CD117)细胞即为骨髓衍生肝干细胞。找出了骨髓衍生肝干细胞群中特有的表面分子组合,这样就可以直接从骨髓细胞中分离纯化骨髓衍生肝干细胞,然后移植入肝病患者体内,不仅能够恢复因病变而减少的肝细胞数量,也可以修复因病变的肝组织结构,达到与肝移植相同的目的且不存在排斥反应。结论:目前对于晚期肝病如肝硬化等的最佳治疗方法是肝脏移植,但由于供体的缺少以及排斥反应,使其在临床上应用受限。相比之下,干细胞移植不仅来源广泛,而且创伤性很小,干细胞的免疫源性低使得排斥反应远远低于肝脏移植。不但可以应用于晚期肝病,也可以治疗重症肝病,前景广阔。     

免疫磁珠法分选骨髓CD34+细胞:纯度影响因素的分析

背景:免疫磁珠分选技术已成为分选CD34+细胞的主要方法之一,在长期实验中发现诸多因素影响其分离纯度,包括磁珠与细胞孵育时干冰与碎冰的使用、磁珠与细胞孵育及分离时摇床的摇摆方向、红细胞裂解液裂解单个核细胞的使用等.目的:在免疫磁珠分选CD34+细胞过程中分别对上述影响因素进行分析改进,以提高分选CD34+细胞的纯度.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-07/2009-03在太原市中心医院皮肤科实验室完成.材料:骨髓象筛选正常的人骨髓29份,由太原市中心医院血液科提供,取材均经患者同意.CD34+免疫磁珠为Dynal公司产品.方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离培养人骨髓单个核细胞,用免疫磁珠法分选骨髓CD34+细胞,对其分选过程中的主要环节如冰块与碎冰、摇床的种类以及红细胞裂解液的使用进行方法改进.方法1:按试剂盒提供方法进行磁珠常规分选CD34+细胞.方法2:在方法1基础上,用碎冰替代冰块进行磁珠与单个核细胞孵育.方法3:在方法2基础上,用万向摇床替代水平摇床.方法4:在方法3基础上,向单个核细胞中预先加入红细胞裂解液裂解残留红细胞.主要观察指标:通过流式细胞仪检测不同方法分选出的CD34+细胞纯度.结果:随着不同环节的逐渐改进,CD34+细胞纯度由(32.7±6.6)%升至(84.5±512)%,方法1,2,3,4所分选出的CD34+细胞纯度逐渐升高,组间方差分析差异显著(F=76.209,P<0.01),Bonferroni法两两比较差异亦有非常显著性意义(P<0.01).结论:碎冰、万向摇床及红细胞裂解液的使用能有效提高免疫磁珠法分选人骨髓CD34+细胞的纯度.     

乳腺干细胞的体外培养及免疫磁珠法分离

目的：乳腺干细胞可以从正常乳腺腺体、良性或恶性乳腺肿瘤的瘤旁组织以及乳汁分离的乳腺上皮细胞中获得。实验选取乳腺癌旁正常组织，体外培养并利用免疫磁珠法分离出具有干细胞特性的乳腺细胞，拟进一步验证在成人乳腺组织中含有可为组织工程所用的种子细胞。 方法：实验于2007—03／10在吉林大学公共卫生学院放射生物学教研室完成。①细胞来源：标本取材于吉林大学第一医院乳腺外科同期收治的20例女性乳腺癌患者手术切除的癌旁组织（〉3cm），经病理证实为正常乳腺腺体，患者对治疗及实验均知情同意。②实验方法：去除乳腺腺体周围脂肪组织及毛细血管，剪碎成约为0．3cm^3的组织块，离心，去上清，Ⅰ型胶原酶消化，加入含10％胎牛血清的DMEM／F12基础培养基进行原代培养。2周后待细胞接近铺满整个培养瓶底部时，用胰蛋白酶＋D—HANKS液将贴壁细胞消化分离，按1：2或1：3传代。利用免疫磁珠系统分离筛选乳腺成体干细胞。③实验评估：观察原代与传代培养的乳腺细胞生长特点，以及免疫磁珠分选后的乳腺干细胞形态、生长特性。采用免疫组化法对分选结果进行鉴定。 结果：①体外培养的乳腺细胞生长特点：原代培养72h后可见乳腺细胞贴壁，5d后细胞呈纺锤形、多角形生长，10d后细胞生长旺盛且排列紧密，随着培养时间的延长梭形细胞逐渐占据优势。传代后细胞增殖速度加快，细胞更加均匀有序的生长。②乳腺干细胞的形态特点及生长特性：分离出的人乳腺成体干细胞生长状态良好，呈类圆形，培养3d后呈多角形分化生长。③分选结果免疫组化鉴定：免疫磁珠分选出的乳腺干细胞均表达上皮特异性抗原，而不表达唾液黏蛋白。 结论：成人乳腺组织中存在唾液黏蛋白1^-上皮特异性抗原^＋且具有干细胞特性的乳     

应用免疫磁珠法分离人胚胎神经干细胞的培养及鉴定

目的：从流产胚胎中分离出神经干细胞并培养、扩增和进行鉴定，为神经干细胞移植寻找源泉。方法：实验于2001-02／2005-06在加拿大多伦多大学和南京大学附属鼓楼医院完成。收集流产的胎儿脑组织，制备人胚胎大脑组织细胞悬液，免疫磁珠法分离神经干细胞，实验设计共随机选择24个分离的单个神经干细胞通过反转录酶聚合链反应技术的方法用DNA扩增仪检测单个细胞中nestin神经干细胞标记物，以beta actin为内参对照。结果：分离的人胚胎神经干细胞生长、扩增正常，nestin阳性细胞纯度极高。结论：免疫磁珠法对胚胎神经干细胞的分离，及反转录聚合酶链反应技术在神经干细胞鉴定中的应用是值得进一步探讨的途径。     

基于免疫磁珠分选的调节性T细胞亚群嵌合性定量分析

为了探讨免疫分选偶联短串重复序列（STR）方法用于调节性T细胞（Treg）嵌合性定量监测的可行性,以淋巴细胞不同比例混合制备14组人工嵌合体血样,以单个核细胞为起点,以免疫磁珠阴性和阳性选择法获取CD4＋CD25＋Treg细胞,分选后的Treg细胞再进行16位点的STR长度多态性分析。结果显示,从分选后的Treg细胞提取的DNA量能满足STR检测要求,当嵌合体中受体比例≥10%时,16个STR位点均能检出受体和供体特异性等位基因,按照STR峰面积计算的受体比例与理论值相符;当受体比例≤1%时,仅有部分位点能检出受体特异性等位基因,实测嵌合率与理论值存在差异。结论：建立了基于免疫分选的Treg细胞嵌合性定量分析方法,对造血嵌合体的检出灵敏度和准确性在1%-10%,可用于造血干细胞移植术后嵌合体监测。     

免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征

背景:骨髓间充质干细胞在一定条件下可分化成为多种结缔组织细胞,也可分化成神经系统的神经元和神经胶质细胞.目的:观察采用免疫磁珠法分离成人骨髓来源神经干细胞的生物学特征.设计、时间及地点:以患者自身骨髓组织为观察对象的实验,于2003-03/2007-06在菏泽市立医院检验科完成.材料:骨髓组织来自菏泽市立医院神经内科住院的中风、老年性痴呆、帕金森病、脑缺血等神经系统疾病患者.方法:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合,在磁场作用下使结合磁珠与其他细胞分离,从而获得神经干细胞,再将所分离的纯化神经干细胞接种到含体积分数为0.20胎牛血清的Eagles MEM培养液,再在培养基中加入碱性成纤维因子和表皮生长因子进行原代培养.主要观察指标:采用免疫组织化学染色与免疫荧光染色鉴定细胞,并采用流式细胞术测定细胞DNA含量.结果:在相差显微镜下观察培养的神经干细胞,细胞形态丰满,胞核及核仁清晰可见,神经突起粗大,网络稠密.免疫组织化学和免疫荧光染色显示,细胞神经元特异性烯醇化酶、神经蛋白、胶质纤维酸性蛋白酶、微管相关蛋白为阳性.传代后的细胞用流式细胞术测定DNA含量为正常二倍体,无诱发突变.结论:利用免疫磁珠表面的特异性抗体与骨髓组织中神经干细胞抗原相结合方法从成人骨髓分离出神经干细胞,在神经化学和形态上已具备神经细胞的特征.     

T cell function detected in murine bone marrow cells.

Mouse bone marrow cells were fractionated by BSA discontinuous density gradient centrifugation, and a small lymphocyte rich fraction was obtained at the high density. Cells of this fraction were shown to respond in vitro to T cell mitogens and alloantigens. Furthermore, they were able to mount a graft-versus-host reaction when assessed by spleen weight assay and by the method of inhibiting erythroid cell growth by allogeneic lymphoid cells. The results indicate that these lymphocytes possess T cell functions. On the other hand they were found to carry only little theta antigen assessed by the cytotoxic test and by the absorption test. It is presumed, therefore, that the amount of theta antigen on a cell might not correlate with T cell functions, and these lymphocytes might be mature ones in the course of postthymic maturation. Hemopoietic stem cells were determined by spleen colony formation and the peak of colony-forming efficiency was seen at the low density. These observations imply that immunocompetent cells causing GVHR can be separated from hemopoietic stem cells. This procedure may be applied for prevention and reduction of GVHR in allogeneic bone marrow transplantation in human.     

Interleukin 3 protects murine bone marrow cells from apoptosis induced by DNA damaging agents

Murine bone marrow-derived cells, dependent on interleukin 3 (IL-3) for their growth in culture, undergo programmed cell, or apoptosis, upon cytokine withdrawal. Here it is reported that a variety of DNA damaging agents cause a more rapid onset of apoptosis in a factor-dependent cell line, BAF3, deprived of IL-3. In contrast, when cultured in the presence of IL-3, or other growth promoting factors, BAF3 cells are highly resistant to X-irradiation and the cytotoxic drugs etoposide and cisplatin. Overexpression of the bcl2 gene product also protects BAF3 cells from DNA damage. The presence of IL-3 is not required during the initial events of DNA damage or its repair. In the absence of IL-3, cells still complete the repair of DNA breaks within 15 min, and continue to cycle for 5 h. At this time, IL-3 is necessary to prevent the accelerated onset of DNA cleavage from a G2 arrest point.     

小鼠骨髓树突状细胞体外扩增方法的探索

背景树突状细胞(Dendritic cells,DC)是抗原提呈功能最强的细胞,但因数量极微限制了它的应用.目的建立小鼠骨髓DC体外大量扩增方法.设计完全随机对照研究.地点和对象实验地点基础医学部中心实验室;C57BL/6(H-2kh)小鼠,BALB/c(H-2kd)小鼠各6只.干预用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与白细胞介素4(IL-4)体外培养小鼠骨髓细胞.主要观察指标用相差显微镜观察形态学变化,3H-TdR掺入法检测细胞增殖能力,FACS检测细胞表面分子,ELISA检测细胞因子.结果扩增的DC形态学特征典型,具有强烈的激活T细胞增殖能力,表达IaKb,CD11c,CD80,CD86,ICAM-1分子以及分泌IL-12,IL-6,TNF-α和IL-1β水平增强.结论该法在体外扩增的大量的DC细胞,具很强的免疫学活性.     

Suppressor cells detected in murine bone marrow chimeras

Bone marrow cells from BALB/c mice were transplanted into lethally X-irradiated C3H/He mice, either intravenously (i.v.) or intrasplenically (i.s.). Chimeras created by intrasplenic transplantation (designated i.s. chimeras) showed a higher survival rate than chimeras created by intravenous transplantation (designated i.v. chimeras). During the course of the study on the mechanisms which caused such a difference, suppressor cells were detected in the spleen of i.s. chimeras by means of MLR co-culture assay and CTL assay. Although these cells were also detected in i.v. chimeras, time course study of the suppressor activity against donor anti-host MLR in i.v. and i.s. chimeras showed some difference. Namely, the suppressor activity in the i.s. chimeras was more constant than that in the i.v. chimeras. This difference may induce a beneficial effect of i.s. bone marrow transplantation.     

正负向磁性细胞分选技术纯化血小板方法的比较

目的获得纯化的血小板,为血小板免疫功能的研究提供实验基础。方法应用磁性细胞分选技术纯化血小板;流式法评价纯化后血小板活化率;白细胞绝对计数法评价有核细胞清除率。结果分选前血小板基础活化率为(2.39±1.10)%,负向分选后为(2.56±1.08)%,正向分选后为(16.76±4.04)%;正、负向分选的有核细胞清除率分别为(98.44±0.24)%及(98.47±0.18)%。正负向分选后血小板回收率分别为(76.5±1.49)%及(79.2±2.61%)。结论磁性细胞负向分选技术适合进行血小板纯化。     

Bcl-2+ tonsillar plasma cells are rescued from apoptosis by bone marrow fibroblasts

Plasma cells represent the final stage of B lymphocyte differentiation. Most plasma cells in secondary lymphoid tissues live for a few days, whereas those in the lamina propria of mucosa and in bone marrow live for several weeks. To investigate the regulation of human plasma cell survival, plasma cells were isolated from tonsils according to high CD38 and low CD20 expression. Tonsillar plasma cells express CD9, CD19, CD24, CD37, CD40, CD74, and HLA-DR, but not CD10, HLA-DQ, CD28, CD56, and Fas/CD95. Although plasma cells express intracytoplasmic Bcl-2, they undergo swift apoptosis in vitro and do not respond to CD40 triggering. Bone marrow fibroblasts and rheumatoid synoviocytes, however, prevented plasma cells from undergoing apoptosis in a contact- dependent fashion. These data indicate that fibroblasts may form a microenvironment favorable for plasma cell survival under normal and pathological conditions.     

鼠巨细胞病毒感染小鼠骨髓单个核细胞亚群的研究

本研究旨在探索鼠巨细胞病毒(MCMV)在小鼠骨髓单个核亚群细胞中的感染特性。采用免疫磁珠分选法(MACS)分选小鼠骨髓单个核亚群细胞,包括lin+细胞、lin-细胞、lin-CD117+和lin-CD117-细胞;用MCMV攻击分选的各组分细胞并以细胞因子和诱导剂诱导细胞分化,最后检测病毒核酸及相关蛋白。结果表明:在MCMV感染的lin+细胞中可检测到病毒DNA和立即早期基因的转录产物及其蛋白,而在感染的lin-细胞中则未检测到任何病毒产物。通过添加细胞因子GM-CSF、rhEPO或佛波酯,则可以在感染的lin-细胞中检测到MCMV的立即早期和早期基因转录产物以及蛋白表达。在lin-CD117+和lin-CD117-细胞中也未检测到病毒基因转录产物,但MCMV感染可抑制lin-CD117+造血干/祖细胞集落的形成以及下调其表面标志CD117抗原的表达。结论:MCMV可在小鼠骨髓单个核亚群细胞中潜伏感染;小鼠骨髓中具有原始干/祖细胞性质的细胞群对MCMV不易感,但MCMV感染可对这些细胞的功能产生抑制作用,可使细胞表面标志表达下调。