黄芩苷对中波紫外线所致HaCaT细胞凋亡、细胞周期变化及p16、原癌基因c-myc蛋白表达的影响

目的:观察中波紫外线(UVB)辐射引起的人表皮角质形成细胞株HacaT细胞凋亡、细胞周期及p16、c-myc蛋白水平的影响及传统中药黄芩苷(baicalin)对它的干预作用.方法:以200 mg/L黄芩苷预处理HacaT细胞,以流式细胞仪检测经0、30、60和90 mJ/cm2的UVB照射后24 h细胞周期和凋亡率变化;以Western blot方法检测90 mJ/cm2 UVB照射后p16、c-myc 蛋白的表达水平.结果:UVB照射可诱导HaCaT细胞产生凋亡,凋亡率呈剂量依赖性增加;30 mJ/cm2 剂量下细胞可出现明显S期阻滞,随UVB剂量增大,S期细胞数量相对下降;照光后p16、c-myc蛋白水平均有所增高.加入黄芩苷处理可抑制UVB引起的上述变化.结论:黄芩苷可明显抑制UVB引起的凋亡与细胞周期阻滞以及p16、c-myc蛋白表达,证实该药具有有效的光保护作用.     

中波紫外线对HaCaT细胞核因子-κB和p53表达的影响

目的研究中波紫外线(UVB)对HaCaT细胞核因子-κB(NF-κB)和p53表达的影响。方法以60mJ/cm2的UVB照射HaCaT细胞后8h、16h和24h,采用real time PCR和western blot等技术检测NF-κB和p53的表达情况。结果 1与未处理组相比,UVB照射HaCaT细胞8h、16h和24h后,NF-κB mRNA水平升高程度分别为27%、32%和42%,p53 mRNA水平升高程度分别为13%、20%和28%;2未处理组HaCaT细胞NF-κB和p53蛋白的表达水平分别为0.3989±0.04802和0.3018±0.03605,UVB照射8h、16h和24h后,二者的表达均随时间延长而升高,NF-κB为0.4283±0.0195、0.5976±0.0401和0.8255±0.0214,p53为0.3925±0.0244、0.4595±0.0362和0.5811±0.0482,差异有统计学意义(P0.05)。结论 UVB可致HaCat细胞中NF-κB和p53表达水平升高。     

川芎嗪对UVA诱导人皮肤成纤维细胞衰老的拮抗作用及MMP-1、MMP-3 mRNA表达影响

目的 探讨川芎嗪对长波紫外线（UVA）诱导人皮肤成纤维细胞（HDF）衰老的拮抗作用及对基质金属蛋白酶（MMP）-1和MMP-3 mRNA表达的影响。 方法 酶消化法分离 HDF进行原代培养,用不同浓度川芎嗪分别作用UVA多次照射前后的HDF。CCK-8法检测川芎嗪作用24、48、72 h或川芎嗪预处理24 h进行多次UVA照射的各组HDF体外增殖情况。光学显微镜下观察经多次UVA照射的各组细胞形态变化及β半乳糖苷酶染色情况,实时荧光定量PCR检测各组细胞内MMP-1和MMP-3 mRNA相对表达量。 结果 浓度为20、50 mg/L的川芎嗪作用HDF 24、48、72 h对细胞的体外增殖活性无促进或抑制作用,但100 mg/L作用48 h对HDF出现短暂抑制作用,与未给药组比较细胞增殖活性差异有统计学意义（P < 0.05）。20、50、100 mg/L的川芎嗪预处理HDF 24、48、72 h对经多次UVA照射的HDF体外增殖均有一定的促进作用,各组间细胞增殖活性在3个时间点差异有统计学意义（F值分别为17.451,15.231,23.535,均P < 0.01）。多次UVA照射后HDF形态出现体积变大、颗粒增加及β半乳糖苷酶表达增加等衰老现象,接近复制性衰老的HDF（P55组）。而20、50、100 mg/L的川芎嗪预处理HDF 24 h可减轻这种衰老现象,其中UVA组β半乳糖苷酶阳性率（68.417 ± 1.181）%,UVA + 川芎嗪20 mg/L组（58.167 ± 5.620）%,UVA + 川芎嗪50 mg/L组（45.167 ± 5.502）%,UVA + 川芎嗪100 mg/L组（43.000 ± 2.000）%,未照射组（33.667 ± 5.865）%,P55组（76.000 ± 6.557）%,各组间差异有统计学意义（F = 45.918,P < 0.01）,且UVA + 各浓度川芎嗪组、未照射组与UVA组比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。川芎嗪可降低多次UVA照射诱导的HDF表达MMP-1和MMP-3 mRNA,且UVA + 各浓度川芎嗪组、未照射组与UVA组比较差异有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 川芎嗪对多次UVA照射诱导的HDF衰老有拮抗作用,并能降低HDF衰老过程中MMP-1和MMP-3 mRNA的表达。     

MiR-146a 在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中作用机制的研究

目的：探讨长波紫外线（UVA）诱导人皮肤成纤维细胞（HSF）光老化中 miR-146a 的表达情况,以及上调 miR-146a 表达对其靶基因 Smad4及细胞光老化的影响。方法以10 J/cm2 UVA 照射 HSF （UVA 照射组）,分别在0、3、7、14 d 提取 RNA,实时定量 PCR 检测 miR-146a 的表达量。通过慢病毒转染上调 miR-146a 的表达（miR-146a 过表达组）,在7 d、14 d 后用荧光显微镜观察转染效率,并通过实时定量 PCR 验证细胞内miR-146a 表达量。空白对照组为正常培养的 HSF（不做任何处理）,miR-146a 过表达组为慢病毒转染 HSF 后,再用 UVA 照射。MTT 法检测空白对照组、UVA 照射组、miR-146a 过表达组、miR-146a 过表达组细胞增殖吸光度（A 值）,实时定量 PCR 检测各组细胞内老化相关基因 p53、p16和 p21 mRNA 的表达,Western 印迹法检测各组细胞内 Smad4蛋白表达。采用重复测量的方差分析、析因设计的方差分析进行统计学分析。结果重复测量的方差分析显示,随培养时间的延长,UVA 照射组和空白对照组 miR-146a 的表达量均逐渐下降（F =213.840, P <0.01）;UVA 照射组表达量低于空白对照组（F =52.55,P <0.01）,且照射时间越长,下调越明显。慢病毒转染HSF 后,细胞内均有较高的荧光表达,miR-146a 过表达组在第7天（10.31±0.17）与第14天时（9.65±0.19）的miR-146a 表达量差异无统计学意义（P >0.05）,但较空白对照组（分别为8.33±0.13和7.86±0.11）显著增高,组间差异有统计学意义（F =42.49,P <0.01）。析因设计的方差分析显示,UVA 照射对细胞增殖活性有抑制作用（P <0.01）,UVA 照射组、UVA + miR-146a 组细胞增殖均分别低于空白对照组、miR-146a 过表达组（P <0.01）;慢病毒转染上调 miR-146a 的表达对细胞增殖活性也有影响（P <0.01）,但 miR-146a 过表达组与空白对照组差异无统计学意义（P >0.05）,UVA + miR-146a 组显著高于 UVA 照射组（P <0.01）。实时定量 PCR 和 Western 印迹法结果显示,UVA 照射可上调 p21、p53、p16 mRNA 的表达（均 P <0.01）,同时对细胞内 Smad4蛋白表达有促进作用（P <0.01）;UVA 照射组、UVA + miR-146a 组 p21、p53、p16 mRNA 和 Smad4蛋白表达均分别高于空白对照组、miR-146a 过表达组（均 P <0.01）,而 miR-146a 过表达组与空白对照组相比差异均无统计学意义（均 P >0.05）, UVA + miR-146a 组均显著低于 UVA 照射组（均 P <0.01）。结论在 UVA 诱导光老化的 HSF 中,miR-146a 的表达受到抑制,上调其表达能够抑制 Smad4的表达,促进光老化细胞增殖,起到抗细胞光老化的作用。     

芒果苷抑制中波紫外线诱导人成纤维细胞提前衰老的相关研究

【摘要】 目的 研究芒果苷是否对反复亚毒性剂量中波紫外线（UVB）诱导的人二倍体成纤维细胞的早衰起抑制作用及其可能的机制。 方法 实验分成空白对照组（不做处理）,UVB-应激诱导的提前衰老（SIPS）组（单纯照光）,芒果苷4.0 mg/L组（单纯加药）,UVB + 芒果苷1.0 mg/L组、UVB + 芒果苷2.0 mg/L组、UVB + 芒果苷4.0 mg/L组（UVB照射联合药物处理）。成纤维细胞经5次UVB 10 mJ/cm2照射后,用细胞计数法（CCK8法）检测细胞增殖活性,β半乳糖苷酶染色（SA-β-Ga1）计算衰老细胞百分比,流式细胞仪测定细胞周期,蛋白印迹检测衰老相关蛋白p53、p21、p16含量,实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测基质金属蛋白酶1（MMP1）、基质金属蛋白酶3（MMP3）、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和衰老相关基因p53、p21、p16 mRNA表达。采用单因素方差分析进行数据统计分析。 结果 UVB + 芒果苷1.0 mg/L组、UVB + 芒果苷2.0 mg/L组、UVB + 芒果苷4.0 mg/L组以及UVB-SIPS组细胞增殖活性（A450）依次为0.322 9 ± 0.011 3、0.336 1 ± 0.016 3、0.342 6 ± 0.014 4、0.288 2 ± 0.020 7（F = 110.08,P < 0.05）,β半乳糖苷酶染色阳性率依次为（88.83 ± 4.54）%、（46.33 ± 5.51）%、（32.17 ± 6.05）%、（93.67 ± 3.75）%（F = 283.54,P < 0.05;与UVB-SIPS组比较,除UVB + 芒果苷1.0 mg/L组外,其他两组均P < 0.05）;G1期细胞阻滞率依次为（72.19 ± 3.42）%、（60.99 ± 2.70）%、（49.80 ± 2.10）%、（82.09 ± 0.89）%（F = 156.01,P < 0.05）。与UVB-SIPS组相比,UVB + 各浓度芒果苷组细胞MMP1和MMP3 mRNA表达降低（F = 69.41、106.41,均P < 0.05）,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA表达增加（F = 66.41、46.81,除UVB + 芒果苷1.0 mg/L组P > 0.05外,其他各组均P < 0.05）,衰老相关基因p53、p21、p16 mRNA表达降低（F = 265.60、151.82、329.85,均P < 0.05）,衰老相关蛋白p53、p21和p16的合成减少（F = 160.51、158.53、75.38,均P < 0.05）,各指标检测值的变化与芒果苷浓度之间呈一定依赖性。 结论 芒果苷可能通过下调p53、p21、p16基因的表达来抑制UVB诱导的人二倍体成纤维细胞的早衰。     

黄芩苷抑制长波紫外线诱导的人成纤维细胞氧化损伤和凋亡

目的 探讨黄芩苷对长波紫外线(UVA)诱导的人二倍体成纤维细胞(HDF)氧化损伤和凋亡的抑制作用及其可能机制.方法 CCK-8法检测细胞活性,筛选最佳药物浓度.将成纤维细胞分成对照组、UVA照射组、UVA+ 6.25 mg/L黄芩苷组、UVA+12.5 mg/L黄芩苷组、UVA+ 25 mg/L黄芩苷组.利用荧光显微镜和流式细胞仪检测各组细胞中活性氧、超氧化物阴离子和一氧化氮含量的变化;流式细胞仪检测线粒体膜电位和细胞凋亡率的变化.Western印迹法检测凋亡相关蛋白caspase3含量.以上多组间比较均采用单因素方差分析.结果 UVA照射组的活性氧、超氧化物阴离子和一氧化氮含量分别为813.1±30.29、353.3±19.13、107.1±11.44,较对照组(442.5±29.45、223.4±10.67、42.17±2.59)明显上升,均P＜0.05);同时,UVA照射组较对照组线粒体去极化增强,凋亡率上升.与UVA组比较,各浓度黄芩苷作用组氧化产物包括活性氧、超氧化物阴离子及一氧化氮含量均有明显下降,线粒体去极化减弱,细胞凋亡率也显著下降,均P＜ 0.01.UVA组凋亡相关蛋白caspase3相对含量为1.2680±0.0091,明显高于对照组(0.3675±0.1115),6.25、12.5和25 mg/L黄芩苷组(0.5588±0.1705、0.5365±0.1718、0.5454±0.2083)较UVA组有显著下调(均P＜0.01).结论 黄芩苷可以减轻UVA诱导的人成纤维细胞氧化损伤和细胞凋亡,其机制可能与清除活性基团、抑制线粒体膜去极化、阻止下游凋亡蛋白caspase3的激活和表达有关.     

人参皂苷和枸杞多糖对UVB诱导培养的成纤维细胞提早衰老的影响

目的 用重复亚毒性剂量UVB辐射培养的皮肤成纤维细胞,观察衰老相关的生物学标志的表达情况,并研究人参皂苷Rb1、Rg1和枸杞多糖对UVB诱导的提早衰老的影响,及对衰老相关的信号分子p16、p21和p53表达的影响。方法 给予培养的皮肤成纤维细胞10次、每次剂量为15 mJ/cm2的UVB辐射。用光镜观察细胞形态学改变,用透射电镜观察细胞超微结构,用β－半乳糖苷酶化学染色法检测衰老细胞,用流式细胞仪检测细胞周期,用RT-PCR检测p16、p21和p53 mRNA的表达水平。结果 三种中药单体对培养的成纤维细胞形态、β－半乳糖苷酶活性、细胞周期和p16、p21和p53 mRNA的表达均没有影响。UVB辐射后,细胞形态和超微结构发生改变;91.5%细胞β－半乳糖苷酶染色阳性;UVB辐射组的G1期细胞数（88.63% ± 4.67%）上升,与对照组（49.18% ± 5.53%）比较差异有统计学意义（P < 0.05）。UVB + 人参皂苷Rb1、UVB ＋ 人参皂苷Rg1、UVB ＋ 枸杞多糖组G1期细胞数分别为71.04% ± 1.64%、70.38% ± 2.58%、80.09% ± 3.46%,与UVB辐射组比较差异均有统计学意义（P均 < 0.05）。与对照组比较,UVB辐射组的p16、p21和p53 mRNA的表达明显增加（P < 0.05）。与UVB辐射组比较,三种中药单体能明显抑制UVB辐射细胞的p16 mRNA的表达（P均 < 0.05）,人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1能明显抑制p21 mRNA的表达（P < 0.05）,人参皂苷Rb1和枸杞多糖能明显抑制p53 mRNA的表达（P < 0.05）。结论 人参皂苷Rb1、Rg1和枸杞多糖对UVB诱导培养的成纤维细胞提早衰老具有抑制作用,对p16、p21和p53 mRNA表达的下调作用是抑制作用的机制之一。     

水通道蛋白3通过调控hnRNPQ/p53延缓皮肤成纤维细胞光老化的作用及机制研究

【摘要】 目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）在皮肤光老化过程中的作用及机制。方法 将正常人皮肤成纤维细胞（NHDF）分为NHDF组（未转染）、AQP3 cDNA组（转染AQP3 cDNA）、AQP3 siRNA组（转染AQP3 siRNA）、核内不均一核糖核蛋白Q（hnRNPQ）cDNA组（转染hnRNPQ cDNA）、hnRNPQ siRNA组（转染hnRNPQ siRNA）、AQP3-hnRNPQ cDNA组（转染AQP3 cDNA和hnRNPQ cDNA）、AQP3-hnRNPQ siRNA组（转染AQP3和hnRNPQ siRNA）、cDNA空载体组（转染cDNA空载体）、siRNA空载体组（转染siRNA空载体）。用长波紫外线（UVA,10 J·cm-2·d-1）连续照射已经转染或未转染的NHDF 3 d来建立细胞衰老模型,同时以未接受UVA照射的NHDF作为对照。用细胞计数法评估各实验组细胞增殖活性,衰老相关-β半乳糖苷酶染色试剂盒对各实验组进行染色来评估HDF的衰老水平,用荧光素酶报告基因技术检测p53转录调控活性,用Western印迹分析NHDF中AQP3、hnRNPQ及衰老相关蛋白p53、p21的表达水平。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用ANOVA检验。结果 用UVA连续照射各组NHDF 3 d后,NHDF中p53、p21的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率明显高于未照射的对照组（P＜0.05）,但是AQP3的表达水平和照射后第5、6、7天细胞增殖活性明显低于对照组（P＜0.05）。在接受UVA连续照射3 d后,AQP3 siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型较siRNA空载体组明显加重,两组间p53、p21、hnRNPQ的表达水平和β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性、细胞增殖活性差异均有统计学意义（均P＜0.05）,进一步沉默hnRNPQ能够逆转上述反应。与siRNA空载体组相比,hnRNPQ siRNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显减轻,两组间p53、p21表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性差异均有统计学意义（均P＜0.05）。在接受UVA连续照射3 d后,cDNA空载体组中p53、p21、hnRNPQ的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为0.56 ± 0.08、0.70 ± 0.07、0.92 ± 0.03、（81.53 ± 7.62）%、7.16 ± 0.25、（2.15 ± 0.23） × 106/ml,而AQP3 cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显轻于cDNA空载体组,其上述指标分别为0.25 ± 0.06、0.23 ± 0.06、0.82 ± 0.09、（31.23 ± 6.54）%、2.52 ± 0.36、（2.93 ± 0.33） × 106/ml,两组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）,进一步过表达hnRNPQ能够逆转上述效应。在接受UVA连续照射3 d后,hnRNPQ cDNA组中p53、p21的表达水平、β半乳糖苷酶阳性细胞百分率、p53转录调控活性和细胞增殖活性分别为1.41 ± 0.09、1.42 ± 0.06、（91.06 ± 4.24）%、12.35 ± 0.88、（1.23 ± 0.41） × 106/ml,与cDNA空载体组相比,hnRNPQ cDNA组中UVA诱导的NHDF的衰老相关表型明显加重,两组比较,上述指标差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论 AQP3可能通过调控hnRNPQ下调p53的表达来减缓UVA诱导的NHDF衰老。     

EGCG对中波紫外线诱导HaCaT细胞p53基因和蛋白表达的实验研究

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对中波紫外线(UVB)照射诱导永生化角质形成细胞株-HaCaT细胞的p53 mRNA和p53蛋白表达的影响。方法:以一定剂量UVB照射HaCaT细胞,并以200μg/mL EGCG处理照射后的HaCaT细胞,分别用RT-PCR法和Western blot方法检测各处理条件下p53 mRNA和/或p53蛋白的表达水平。结果:30 mJ/cm2的UVB照射后HaCaT细胞的p53 mR-NA和p53蛋白表达逐渐增加,4 h达到峰值,4 h后随照射剂量增加而增加,24 h后有所恢复;加入EGCG可下调UVB诱导的表达作用。结论:UVB照射对HaCaT细胞p53 mRNA和p53蛋白的诱导表达有时效性与量效性,EGCG可下调UVB照射的这种诱导作用。     

白藜芦醇对UVA照射人角质形成细胞株的保护作用及机制探讨

目的 研究白藜芦醇对UVA照射后人角质形成细胞的保护作用及其机制。方法 5 J/cm2 UVA照射人角质形成细胞株HaCaT细胞后,立即予以0.01、0.1 mmol/L白藜芦醇干预,噻唑蓝比色法检测细胞增殖活性,半定量RT-PCR和Western印迹方法检测细胞诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白的表达,电镜观察细胞形态学方面的改变。结果 UVA照射组HaCaT细胞的增殖活性（A490为0.542 ± 0.004）较未照射对照组（A490为0.889 ± 0.083）明显下降,iNOS mRNA和蛋白的表达水平（1.532 ± 0.041和1.331 ± 0.046）较未照射对照组显著增加,电镜下可见典型的凋亡细胞。HaCaT细胞经UVA照射加0.01、0.1 mmol/L白藜芦醇处理后,细胞的增殖活性升高,A490为分别为0.753 ± 0.435和0.892 ± 0.173,iNOS mRNA和蛋白的表达水平分别为0.853 ± 0.038/0.809 ± 0.018和0.392 ± 0.033/0.412 ± 0.026,与单独UVA照射组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05）,而且0.1 mmol/L白藜芦醇组作用效果更明显。另外,电镜观察UVA + 白藜芦醇组未见凋亡细胞及明显的细胞坏死征象。结论 白藜芦醇对UVA照射损伤的HaCaT细胞有保护作用,其机制可能与白藜芦醇抑制UVA诱导的iNOS表达有关。     

miRNA-1246靶向MAPK14在长波紫外线诱导人成纤维细胞光老化中机制的研究

【摘要】 目的 探讨长波紫外线（UVA）诱导人成纤维细胞（HSF）光老化中miRNA-1246的表达及上调miR-1246表达对靶基因MAPK14及细胞老化的影响。方法 HSF分离自苏州大学附属儿童医院收集的健康儿童包皮环切术后皮肤标本,每日以10 J/cm2 UVA照射HSF,在初次照射及照射3、7、14 d采用实时定量PCR检测miR-1246的表达。将HSF细胞分为空白对照组、UVA组、miR-1246组、UVA + miR-1246组,通过慢病毒转染上调miR-1246的表达和照射UVA 14 d后,收集各组细胞,采用MTT检测细胞增殖活性,β半乳糖苷酶染色检测细胞老化,RT-PCR和Western印迹检测MAPK14、基质金属蛋白酶1（MMP-1）的表达。多组间均数的比较用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 在照射7 d、14 d时,UVA组HSF的miR-1246相对表达水平（4.69 ± 0.85、3.59 ± 0.45）均低于空白对照组（8.42 ± 0.75、7.61 ± 0.49）,差异均有统计学意义（t = 29.84、31.93,均P < 0.01）。上调miR-1246的表达和照射UVA后,MTT结果显示,空白对照组、UVA组、miR-1246组、UVA + miR-1246组细胞增殖活性（0.82 ± 0.03、0.23 ± 0.02、0.81 ± 0.02、0.61 ± 0.02）差异有统计学意义（F = 34.90,P < 0.05）,UVA组低于空白对照组（t = 28.14,P < 0.01）,UVA + miR-1246组低于miR-1246组（t = 10.61,P < 0.01）,高于UVA组（t = 20.30,P < 0.01）。β半乳糖苷酶染色检测显示,4组老化细胞阳性率（3.93% ± 1.11%、81.29% ± 2.53%、5.50% ± 1.15%、54.13% ± 2.09%）差异有统计学意义（F = 16.14,P < 0.05）,其中UVA组高于空白对照组（t = 48.46,P < 0.01）,而UVA + miR-1246组高于miR-1246组（t = 35.31,P < 0.01）,低于UVA组（t = 14.32,P < 0.01）。RT-PCR和Western 印迹均显示,4组细胞MAPK14、MMP-1的mRNA、蛋白相对水平差异均有统计学意义（均P < 0.05）,其中UVA组高于空白对照组（P < 0.05）,UVA + miR-1246组高于miR-1246组（P < 0.05）,低于UVA组（P < 0.05）。结论 UVA照射诱导的HSF光老化中,miR-1246的表达受到抑制,上调miR-1246的表达可抑制其靶基因MAPK14及老化相关蛋白MMP-1的表达,起到抗细胞光老化的作用。     

miR-26a靶向EZH2在长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中的作用机制研究

目的:探讨长波紫外线诱导人皮肤成纤维细胞光老化中miRNA-26a的表达情况,以及上调或下调miR-26a表达对全基因组甲基化水平、靶基因组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2（EZH2）及细胞老化的影响。方法:以10 J/cm 2 UVA照射人皮肤成纤维细胞,分别在第0、3、7天提取RNA,实时定量反转录PCR（...     

黄芩苷对中波紫外线诱导后BALB/c小鼠表皮光产物形成的干预作用

目的 观察中波紫外线（UVB）诱导BALB/c小鼠皮肤表皮细胞光产物的形成和清除情况,以及黄芩苷的干预作用。方法 将黄芩苷（1 mg/cm2）连续3 d外用于BALB/c小鼠表皮24 h后,采用免疫组织化学法及免疫印迹法检测180 mJ/cm2 UVB辐射后1 h、24 h和48 h小鼠表皮内环丁烷嘧啶二聚体（CPD）的产生和清除情况。结果 CPD仅在接受UVB辐射的小鼠皮肤内出现。相对于UVB辐射后1 h光产物的平均值,UVB辐射组1 h、24 h和48 h,CPD的信号强度分别为（100 ± 5.22）％、（75.34 ± 8.22）％和（42.11 ± 3.24）％;经过黄芩苷处理后的小鼠接受UVB辐射后1 h、24 h和48 h,CPD的信号强度分别为（81.45 ± 5.22）%、（32.14 ± 6.33）%和（5.21 ± 3.15）%;而丙酮处理后的小鼠接受UVB辐射后1 h、24 h和48 h,CPD的信号强度分别为（106 ± 8.21）%、（70.23 ± 4.13）%和（41.22 ± 4.21）%。结论 外用黄芩苷能抑制UVB辐射诱导光产物的形成,并在48 h内加速光产物的清除。黄芩苷是一种有效的紫外线防护剂。     

紫外线对HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1的影响

目的 探讨HaCaT细胞中瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)的光控作用及其机制.方法 培养的HaCaT细胞分为225 mJ/cm2 UVA刺激组和25 mJ/cm2UVB刺激组,UVA刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组(UVA-TRPA1对照组)、视黄醛+UVA+肉桂醛组(UVA-TRPA1激动组)、视黄醛+UVA+樟脑组(UVA-TRPA1抑制组);UVB刺激组分为空白对照组(仅有HaCaT细胞)、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组(UVB-TRPA1对照组)、视黄醛+ UVB+肉桂醛组(UVB-TRPA1激动组)、视黄醛+UVB+樟脑组(UVB-TRPA1抑制组).qPCR、Western印迹检测HaCaT细胞中TRPA1的表达.流式细胞仪检测各组HaCaT细胞钙离子内流的变化.结果 qPCR和Western印迹显示,HaCaT细胞中有TRPA1 mRNA及蛋白的表达.UVA作用后空白对照组、视黄醛组、UVA组、视黄醛+UVA组荧光强度分别为155.06±7.62、148.37±18.77、166.92±3.71、331.333±40.563,组间差异有统计学意义(F=44.509,P＜0.01).UVB作用后空白对照组、视黄醛组、UVB组、视黄醛+UVB组荧光强度分别为150.20±1.73、171.66±56.23、147.56±6.60、250.44±9.13,组间差异有统计学意义(F=85.261,P＜ 0.01),视黄醛+UVA/UVB组荧光强度均高于空白对照组(q值分别为18.442、6.052,P＜0.01).TRPA1激动剂和拮抗剂可调节UVA、UVB所引起的钙离子内流的变化(P＜ 0.001),在UVA、UVB作用下,TRPA1激动剂组荧光强度均高于对照组(q值分别为14.934、32.770,P＜0.001),TRPA1抑制剂组荧光强度均低于对照组(q值分别为7.986、14.596,P＜0.001).结论 TRPA1在皮肤HaCaT细胞中有表达,UVA或UVB可通过TRPA1调控HaCaT细胞的钙离子内流.     

沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤的影响

【摘要】 目的 探讨沉默miRNA-23a对UVB照射所致成纤维细胞慢性光损伤的影响。 方法 将成纤维细胞分为空白对照组、UVB光损伤组、miRNA-23a 沉默组、UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组。SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）化学染色测定老化程度,流式细胞仪检测细胞周期,实时PCR法检测p53、p16、p21 mRNA的表达,免疫印迹法检测p53、p16、p21的蛋白表达量。 结果 UVB光损伤组与UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组的SA-β-Gal细胞蓝染阳性率分别为（94.60 ± 2.58）%、（48.18 ± 3.70）%,两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。G1期阻滞率分别为（85.06 ± 1.52）%、（57.48 ± 2.01）%,两组间差异有统计学意义（P < 0.05）。UVB光损伤 + miRNA-23a沉默组的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达量与UVB光损伤组相比,差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞衰老有抑制作用,而miRNA-23a对下游衰老相关信号分子的抑制可能是其机制之一。     

Ginsenoside Rg1 protects human fibroblasts against psoralen- and UVA-induced premature senescence through a telomeric mechanism

This study was aimed to investigate the protective effects of ginsenoside Rg1 on 8-methoxypsoralen(8-MOP)/Ultraviolet A (UVA)-induced premature senescence in human fibroblasts, and the underlying mechanism. We established a stress-induced premature senescence model by 8-MOP/UVA irradiation. The aging condition was determined by histochemical staining of senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal). Relative telomere length was calculated by the ratio of the amount of telomere DNA versus single copy DNA by real-time polymerase chain reaction, and protein levels of p-P53, p21^WAF−1 and p16^INK−4a were estimated by Western blotting. Compared with the 8-MOP/UVA treatment group, we found that the irradiated fibroblasts pretreated with ginsenoside Rg1 demonstrated a decrease in the expression of SA-β-gal, a downregulation in the level of senescence-associated proteins, and a deceleration in telomere shortening. Taken together, these results suggest that ginsenoside Rg1 significantly antagonizes premature senescence induced by 8-MOP/UVA in fibroblasts.     

绞股蓝皂苷对光损伤BALB/c小鼠皮肤p53、p21蛋白表达的影响

目的 探讨绞股蓝皂苷（GP）抗光损伤的作用机制。方法 80只雌性BALB/c小鼠随机分为8组,每组10只,分别为：空白对照组（未加任何处理）、UVB模型组、GP组Ⅰ（先涂GP后照UVB）、GP组Ⅱ（先照UVB后涂GP）、维生素E组Ⅰ（先涂维生素E乳膏后照UVB）、维生素E组Ⅱ（先照UVB后涂维生素E乳膏）、基质组Ⅰ（先涂基质后照UVB）、基质组Ⅱ（先照UVB后涂基质）。中波紫外线（UVB）照射BALB/c小鼠建立光损伤模型,根据以上分组对光损伤小鼠皮肤进行干预。运用蛋白Western印迹法检测各组小鼠表皮中p53蛋白、p21蛋白的表达。结果 BALB/c小鼠表皮p53蛋白的表达：空白组p53蛋白（0.11 ± 0.08）与UVB模型组（0.22 ± 0.12）相比低表达,GP组Ⅰ（0.44 ± 0.23）高于空白组（P < 0.01）,GP组Ⅱ（0.48 ± 0.24）高于空白组（P < 0.01）及UVB模型组（P < 0.05）,维生素E组Ⅰ（0.49 ± 0.29）及维生素E组Ⅱ（0.50 ± 0.27）均与GP组作用相似。小鼠表皮p21蛋白的表达各组间差异无统计学意义。结论 1.5% GP乳膏抗光损伤的作用机制之一可能与上调表皮细胞中p53蛋白表达量有关。     

阿维A对缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖和缺氧诱导因子1α及血管内皮生长因子表达的影响

目的 通过阿维A作用于缺氧培养的HaCaT细胞,初步探讨阿维A治疗银屑病的可能机制.方法 将浓度为10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞,用CCK-8法检测缺氧培养12、24、36h对HaCaT细胞体外增殖的影响.反转录PCR和Western印迹检测不同浓度阿维A对缺氧培养24 h的HaCaT细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白及mRNA表达的影响.结果 阿维A 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L作用24 h,HaCaT细胞体外增殖抑制率分别为(13.31±1.15)％、(21.86±5.31)％、(32.05±2.99)％、(37.28±3.21)％,且随着缺氧培养时间延长和阿维A浓度增加,对HaCaT细胞体外增殖的抑制作用逐渐增强.当阿维A浓度为10-5mol/L时,HIF-1α蛋白的表达由1.196±0.088降至0.319±0.180(P＜ 0.05),而HIF-1α mRNA表达水平无明显下降;VEGF mRNA的表达由1.108±0.073降至0.442±0.090(P＜ 0.05),VEGF蛋白的表达则由1.174±0.186降至0.216±0.066(P＜ 0.05).结论 阿维A可抑制缺氧培养的HaCaT细胞体外增殖,并在蛋白水平下调HIF-1α及VEGF的表达,在mRNA水平下调VEGF的表达.