HIV-1 V2区突变对CD4结合位点中和抗体识别的影响

目的 探讨HIV-1病毒包膜蛋白gp120的V2区突变对其他结构域的中和抗体识别的影响。 方法 使用假病毒构建系统包装野生型和V2区突变型的HIV-1假病毒,分别测试抗CD4结合位点中和抗体和CD4诱导的中和抗体对两种病毒的中和作用。使用双抗体夹心ELISA法测试CD4结合位点中和抗体和CD4诱导的中和抗体对gp120野生型和突变型蛋白的亲合力。结果 CD4结合位点中和抗体和CD4诱导的中和抗体均无法中和野生株JR-FL WT假病毒,但2种中和抗体对V2突变株的中和活性显著提高,在低浓度下即可中和该病毒。野生株和突变株gp120单体与抗CD4结合位点中和抗体的结合力无明显差异,而gp120单体与CD4诱导的中和抗体的结合实验ELISA曲线却明显分离,CD4诱导的中和抗体与突变型JR-FL L175P gp120的结合强度均明显高于它们与野生型JR-FL WT gp120的结合强度。结论 HIV-1 V2区突变可影响中和抗体的抗病毒效果。     

C型凝集素受体树突细胞特异性捕获细胞间黏附分子3非整合素细胞表达模型的构建及功能研究

目的 构建C型凝集素受体树突细胞特异性捕获细胞间黏附分子3非整合素（DC-SIGN）细胞表达模型,为后续进行DC-SIGN蛋白受体功能研究提供基础。 方法 PCR扩增获得DC-SIGN分子的cDNA,克隆入真核表达载体p巨细胞病毒启动子-绿色荧光蛋白重组质粒（PCMV-EGFP）,EGFP位于DC-SIGN N末端,转染人胚肾细胞癌 HEK 293T 细胞后,流式细胞仪检测DC-SIGN重组分子的表达,激光共聚焦显微镜检测DC-SIGN-EGFP融合蛋白的细胞定位情况,并进一步检测转染表达的DC-SIGN受体对过敏原抗原的识别和内吞过程。 结果 构建的荧光融合蛋白重组表达质粒,经PCR及Western印迹证明DC-SIGN表达成功;经流式细胞仪检测转染DC-SIGN融合质粒的HEK293T细胞的DC-SIGN受体表达量增多（约50%）。重组表达质粒转染293T细胞后,激光共聚焦显微镜检测显示,绿色荧光标记的DC-SIGN位于细胞膜上,可结合红色荧光素标记的过敏原抗原Derp2,并可将Derp2内吞入细胞内。 结论 构建的DC-SIGN-EGFP融合蛋白在293T细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,可被DC-SIGN特异性抗体识别并具有摄取过敏原功能,是研究DC-SIGN分子功能的理想细胞模型。     

转谷氨酰胺酶3与树突细胞特异性捕获非整合素的细胞间黏附分子体外结合能力研究

目的 检测树突细胞特异性捕获非整合素的细胞间黏附分子(DC-SIGN)转染的HEK293T细胞和单核细胞来源的树突细胞(MDDC)膜表面DC-SIGN受体对转谷氨酰胺酶3(TG3)的识别和摄取能力.方法 采用脂质体转染的方法将融合有DC-SIGN基因片段及真核表达载体pGCMV-EGFP(增强绿色荧光蛋白)的质粒转染至HEK293T细胞,制备DC-SIGN-EGFP-HEK293T细胞;通过磁珠阴性分选出外周血中CD14+单核细胞,并通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4诱导获得MDDC.利用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测转染的HEK293T细胞及MDDC上DC-SIGN受体对TG3蛋白的识别和摄取,并设立空白对照组(不加入Alexa Fluor-647染料标记的TG3)和阴性对照组(仅加入Alexa Fluor-647染料).结果 TG3与HEK293T和MDDC细胞孵育3h后,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪均显示,TG3可以被HEK293T及MDDC细胞上DC-SIGN受体识别并结合摄取入细胞内,流式细胞仪检测显示TG3与MDDC的结合可被DC-SIGN阻断抗体部分阻断.阴性对照组和空白对照组未见HEK393T或MDDC细胞对TG3的识别和结合.结论 TG3可以作为一种自身抗原被DC-SIGN受体识别、结合,并被介导摄取进入树突细胞.     

GJB6基因突变体过表达慢病毒载体的构建及其在HaCaT细胞中的表达

目的:明确GJB6目的基因蛋白Cx30在GJB6 3种突变体A88V、G11R和V37E在HaCaT细胞中的表达.方法:构建GJB6基因突变体的慢病毒载体,并转染至HaCaT,应用荧光倒置显微镜检测其表达.结果:突变体中G11R和A88V经过多次转染实验,能够明确观察到HaCaT细胞细胞膜上有Cx30蛋白的荧光表达;而V37E突变型荧光表达极弱或无.结论:3种突变体的Cx30表达量不同,初步推测突变体编码的蛋白质或不能定位于角质形成细胞膜或不能形成功能性的Cx30,从而影响了HaCaT细胞正常的增殖和分化.     

C型凝集素受体Langerin的细胞表达模型构建及功能研究

目的 构建朗格汉斯细胞特异性C型凝集素受体Langerin体外细胞表达模型。 方法 PCR方法获得Langerin分子的cDNA,克隆入真核绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体pEGFP-C1（EGFP位于Langerin的N末端）,转染人肾胚细胞癌 HEK 293T 细胞后,激光共聚焦显微镜检测EGFP-Langerin融合蛋白的细胞表达情况,流式细胞仪检测Langerin受体的表达,并进一步检测转染表达的Langerin受体对尘螨抗原（nDer p 2）的识别和内吞情况。 结果 构建的荧光融合蛋白重组表达质粒转染HEK 293T细胞后,经PCR及Western印迹检测证明Langerin转染及表达成功。重组表达质粒转染HEK293T细胞后,经流式细胞仪检测转染Langerin融合质粒的HEK293T细胞的Langerin受体表达率较转染前增多约43%,经激光共聚焦显微镜检测显示绿色荧光标记的Langerin成功表达,并可与红色荧光素标记的尘螨抗原（nDer p 2）结合,将nDer p 2内吞入细胞内。 结论 构建的EGFP-Langerin融合蛋白在HEK293T细胞内表达后具有细胞表面受体分子的特征性分布,具有结合、内吞过敏原功能。     

慢病毒介导shRNA沉默Nicastrin基因的人永生化角质形成细胞模型构建

目的 构建Nicastrin(NCT)基因的RNA干扰慢病毒表达载体,并在人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础.方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA(shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H 1/GFP+ Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度.将HaCaT细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒).流式细胞仪检测慢病毒转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹检测靶基因的沉默效率,筛选出沉默效果最佳的干扰序列.结果 测序表明,NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测,慢病毒转染效率大于95％.qRT-PCR结果,与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75％.Western印迹结果,与NC组相比,shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7％.结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体,并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型.     

Hsa-mir-634对Vero细胞增殖和凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨hsa-mir-634在Vero细胞中的功能与作用机制。 方法 运用生物信息学方法在线预测hsa-mir-634的潜在靶基因细胞周期蛋白D1（CyclinD1,CCND1）的结合位点,将含有hsa-mir-634结合位点的CCND1的3′UTR片段连入psi-CHECK2载体,构建双荧光报告基因载体。通过定点突变的方法突变hsa-mir-634 和CCND1的结合位点,构建双荧光报告突变基因载体。将构建的重组质粒转染293T细胞,进行双荧光检测;将化学合成的hsa-mir-634模拟物转染Vero细胞,荧光定量PCR和Western印迹法检测hsa-mir-634对内源性CCND1 mRNA水平和蛋白水平表达的影响,MTS法检测hsa-mir-634对Vero细胞增殖能力的影响,流式细胞仪检测hsa-mir-634对Vero细胞凋亡的影响。 结果 用生物信息学方法成功预测到hsa-mir-634与CCND1的结合位点;测序结果显示,野生型及突变型CCND1 3′UTR序列成功连接到psi-CHECK2报告基因载体;双荧光检测结果显示,过表达hsa-mir-634可以抑制荧光素酶的表达。过表达hsa-mir-634后,其靶基因CCND1在mRNA水平上无明显变化,但可以显著影响CCND1蛋白的表达。过表达hsa-mir-634可抑制Vero细胞增殖,这种抑制作用在转染后第4天最为明显。另外,过表达hsa-mir-634可诱导Vero细胞的凋亡,空白细胞组、阴性对照组及hsa-mir-634过表达组晚期凋亡的比例分别为8.03%、7.96%和17.33%。 结论 Hsa-mir-634通过影响CCND1的表达影响Vero细胞的增殖和凋亡。 【关键词】 细胞周期蛋白D1; Vero细胞; 细胞凋亡; 细胞增殖; 疱疹病毒2型,人; Hsa-mir-634     

Dectin-1慢病毒过表达载体的构建与鉴定

目的通过构建Dectin-1慢病毒过表达载体,感染巨噬细胞RAW264.7,建立Dectin-1过表达的巨噬细胞模型。方法根据小鼠Dectin-1基因序列设计引物,经PCR扩增目的基因后克隆至载体pLenti6.3-IRES2-EGFP/V5 DEST(MCS),获得重组质粒pLenti6.3-dectin-1-IRES-EGF。经和包装质粒Mix共同转染293T细胞,收获慢病毒,利用293T细胞大量扩增慢病毒并进行慢病毒的滴度测定,根据MOI值感染巨噬细胞RAW264.7,经荧光显微镜和荧光定量PCR鉴定感染慢病毒组和感染空病毒组中Dectin-1基因的表达。结果 PCR和测序结果证明已成功构建pLenti6.3-dectin-1-IRES-EGFP,成功包装慢病毒,计算慢病毒滴度为3.12×10~9 Tu/mL,成功感染巨噬细胞RAW264.7,荧光显微镜下可见绿色荧光,RT-PCR检测到感染重组慢病毒组Dectin-1表达量是感染空病毒组的1 275倍(P0.01)。结论成功构建Dectin-1基因过表达的巨噬细胞模型,为进一步研究Dectin-1基因在巨噬细胞对抗真菌感染中的作用打下基础。     

C型凝集素受体CD207对表皮葡萄球菌的结合

目的分析C型凝集素受体CD207对表皮葡萄球菌的结合,为深入研究Langerhans细胞对皮肤菌群的识别和应答奠定基础。方法构建含有人CD207基因的表达质粒p EGFP-C1-CD207,瞬时转染HEK293T细胞后流式细胞术和Western blot检测转染细胞CD207的表达;将转染细胞与CTC荧光染色的表皮葡萄球菌共孵育,流式细胞术及激光共聚焦检测表皮葡萄球菌与转染细胞的结合。另外将表皮葡萄球菌与纯化的人CD207分子共孵育,抗CD207抗体染色后流式细胞仪检测表皮葡萄球菌与CD207的结合情况。结果酶切鉴定显示p EGFP-C1-CD207质粒含有目的基因条带;转染HEK293T细胞后,流式细胞术和Western blot均检测到CD207分子的表达;流式细胞术及激光共聚焦结果显示转染表达CD207的HEK293T细胞能够结合表皮葡萄球菌、表皮葡萄球菌能够结合纯化的CD207分子。结论人CD207分子能够有效结合表皮葡萄球菌,提示Langerhans细胞能够通过CD207分子识别表皮葡萄球菌,可能介导了对皮肤菌群的免疫应答。     

人GJB6基因Tet-on HaCaT细胞稳定株的构建与鉴定

目的 以Tet-on慢病毒为载体建立稳定表达GJB6基因及其突变体的HaCaT细胞株,为后续研究有汗性外胚层发育不良的发病机制奠定实验基础。 方法 利用PCR技术扩增人GJB6基因野生型与突变型（A88V）基因,重组Tet-on慢病毒质粒,经基因测序及酶切技术对其鉴定,再将重组慢病毒转染入HaCaT细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定表达编码缝隙连接蛋白Cx30的GJB6基因的细胞株。细胞株加四环素诱导后,通过RT-PCR检测GJB6基因的mRNA表达量,同时通过Western印迹检测Cx30与FLAG标签肽的表达,从而对稳定表达GJB6基因的HaCaT细胞株进行鉴定。用CCK8法检测GJB6基因野生型与突变型经四环素诱导表达后对细胞增殖的影响。 结果 经酶切、测序鉴定,重组慢病毒质粒构建成功。RT-PCR检测到稳定转染的HaCaT细胞中GJB6基因mRNA表达量明显增加,感染野生型Tet-on慢病毒的HaCaT细胞组（WT组）加四环素GJB6基因表达丰度是WT组不加四环素的113.369倍（P < 0.05）,感染突变型（A88V）Tet-on慢病毒的HaCaT细胞组（MU组）加四环素GJB6基因表达丰度是MU组不加四环素的3.249倍（P < 0.05）;Western印迹可检测到经四环素处理的WT组和MU组稳定表达Cx30与FLAG,而未经四环素处理的细胞和感染阴性对照病毒的HaCaT细胞组（NC组）未检测到Cx30与FLAG目的条带。NC组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48 h时的A值差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）;WT组加与不加入四环素在4、8、12、24、36 h时的A值差异均有统计学意义（P < 0.05）;MU组加与不加入四环素在4、8、12、24、36、48 h时的A值差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 成功构建出稳定表达GJB6基因野生型及其突变体A88V的HaCaT细胞株。     

Interaction of human epidermal Langerhans cells with HIV-1 viral envelope proteins (gp 120 and gp 160s) involves a receptor-mediated endocytosis independent of the CD4 T4A epitope.

The CD4 molecule is known to be the preferential receptor for the HIV-1 envelope glycoprotein. Epidermal Langerhans cells are dendritic cells which express several surface antigens, among them CD4 antigens. To clarify the exact role of CD4 molecules in Langerhans cell infection induced by HIV-1, we investigated the possible involvement of the interactions between HIV-1 gp 120 or HIV-1 gp 160s (soluble gp 160) and Langerhans cell surface. We also assessed the expression of CD4 molecules on Langerhans cell membranes dissociated by means of trypsin from their neighbouring keratinocytes. The cellular phenotype was monitored using flow cytometry and quantitative immunoelectron microscopy. We reported that human Langerhans cells can bind the viral envelope proteins (gp 120 or gp 160s), and that this binding does not depend on CD4 protein expression. This binding is not blocked by anti-CD4 monoclonal antibodies. We show that a proportion of gp 120/gp 160s-receptor complexes enters Langerhans cells by a process identified as a receptor-mediated endocytosis. The amount of surface bound gp 120/gp 160s is not consistent with the amount of CD4 antigens present on Langerhans cell membranes. Gp 120/gp 160s binding sites on Langerhans cell suspensions appeared to be trypsin resistant, while CD4 antigens (at least the epitopes known to bind the HIV-1) are trypsin sensitive. A burst of gp 120 receptor expression was detected on 1-day cultured Langerhans cells while CD4 antigens disappeared. These findings lead to the most logical conclusion that binding of gp 120/gp 160s is due to the presence of a Langerhans cell surface molecule different from CD4 antigens.     

一例火棉胶样婴儿 TGM1基因变异的致病性研究

目的:探讨1个先天性常染色体隐性遗传性鱼鳞病家系的遗传学病因。方法:对1例火棉胶样婴儿进行全外显子组测序,Sanger测序验证基因变异位点。应用PolyPhen-2、PROVEAN和Mutation Taster软件以及蛋白同源建模方法预测基因变异的性质;实时荧光定量PCR和Western印迹法分析变异对等位基因mRN...     

P24 antigen detection, viral isolation, DNA-PCR and in vitro antibody production for the diagnosis of HIV-1 latent infection in heterosexual women at high risk for HIV-1 infection.

INTRODUCTION--The report of the existence of at-risk seronegative subjects, latently infected with HIV-1 and producing "in vitro" HIV-1 specific antibodies, prompted the authors to evaluate extensively twenty-five heterosexual HIV-1 seronegative women at high risk for HIV-1 infection. MATERIAL AND METHODS--The capability of peripheral blood mononuclear cells from such subjects to produce "in vitro" HIV-1 specific antibodies after pokeweed-mitogen stimulation, was studied. Silent HIV-1 infection was investigated by HIV-1 DNA PCR, viral isolation and serum p24 Ag detection at entry and after 6 and 12 months. RESULTS--Three seroconversions took place within 12 months, but no HIV-1 infections were found in the absence of detectable serum anti HIV-1 antibodies, even in subjects who apparently produced such antibodies in vitro. The antibodies produced in vitro by the seronegative women studied appeared of narrow specificity, reacting mainly with gp 160/120 envelope glycoproteins. CONCLUSIONS--A strong concordance was found between the serological status and the other markers for HIV-1 infection, suggesting that the phenomenon of HIV-1 "latent infection" is a very rare event, if it occurs at all. Seronegative women sexually exposed to the virus may produce in vitro anti HIV-1 antibodies of narrow specificity in the absence of other signs of infection and this phenomenon might be related to an anamnestic response to the virus.     

BP180NC16A-IgG1Fc融合蛋白真核表达体系构建

目的构建BP180NC16A-IgG1Fc融合蛋白的真核表达体系。方法①以逆转录PCR(reverse transcrip-tion-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法从表皮组织提取总RNA中扩增编码人BP180NC16A的cDNA,与包含编码人免疫球蛋白IgG1Fc段恒定区基因的质粒pFUSE-hIgG1e4-Fc2融合,形成重组pFUSE-hIgG1e4-Fc2-BP180NC16A质粒。②重组质粒转染真核HEK293T细胞,48h后收集细胞培养上清。③通过免疫印迹的方法鉴定转染细胞上清中分泌的BP180NC16A-IgG1Fc融合蛋白。结果构建了pFUSE-hIgG1e4-Fc2-BP180NC16A真核表达质粒并在HEK293T细胞成功表达BP180NC16A-IgG1Fc融合蛋白。结论 BP180NC16A-IgG1Fc融合蛋白能够成功真核表达。     

HIV-1 env基因序列分析及其与长期感染不进展现象相关性研究

目的研究HIV-1长期感染不进展现象与HIV-1 env基因变异的关系。方法用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)对21例感染HIV-1毒株7年以上者外周血单一核细胞(PBMCs)的核酸样本进行扩增,获得HIV-1膜蛋白(env)基因的核酸片段,对其C2-V3及邻区350-450个核苷酸序列进行测定和分析,所得结果与HIV-1该亚型国际标准株进行比较,分析共享序列及突变序列,制作系统树,计算离散率。结果离散率和系统树分析21个毒株均为HIV-1 B亚型,毒株间基因离散率在2%左右,高于前期研究结果;未见V3环顶端四肽特征性GPGR和GRGQ,也未见前期研究曾经发现的脯氨酸向异亮氨酸的变异现象。结论HIV-1长期感染者体内毒株env基因无规律性突变。