芹黄素对过氧化氢所致黑素细胞凋亡的作用

目的采用过氧化氢(H2O2)诱导的黑素细胞体外氧化应激模型探讨芹黄素对黑素细胞的抗氧化保护作用。方法采用MTT法测定不同浓度芹黄素预处理前后H2O2对正常人表皮黑素细胞活力的影响,An-nexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞的凋亡情况,DCFH-DA流式细胞术检测细胞活性氧(ROS)的含量。结果 250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞24h,黑素细胞活力降低至(36.42±7.21)%,凋亡率增加至(48.82±12.55)%。0.6μmol/L,2.5μmol/L和10.0μmol/L芹黄素预处理1h后,H2O2所致细胞活力分别增加至(41.53±5.25)%,(45.33±6.28)%和(51.92±5.29)%,凋亡率减少至(42.25±7.69)%,(37.54±8.82)%和(32.25±58.28)%。250μmol/L的H2O2作用于黑素细胞2h后,黑素细胞ROS含量增加至空白对照组的(69.22±8.57)倍。10μmol/L芹黄素预处理1h后H2O2所致黑素细胞ROS含量为空白对照组的(54.48±5.03)倍,低于单用H2O2处理组。结论芹黄素可能通过减少ROS生成和抑制氧化应激对HO所致黑素细胞凋亡具有保护作用,其可能具有开发为治疗白癜风新药的前景。     

黑素细胞中PINK1的表达及在氧化损伤中的作用

目的明确正常人黑素细胞PIG1中PINK1的表达,探讨PINK1在黑素细胞氧化损伤中的作用。方法 (1)采用逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)及免疫印迹法(WB),检测PIG1黑素细胞中PINK1的mRNA及蛋白的表达水平;(2)不同浓度H2_O_2处理PIG1细胞24h,CCK-8法测定细胞增殖活力,确定H_2O_2最适浓度;(3)设计并合成3对PINK1干扰片段(siRNA)转染PIG1细胞,采用RT-qPCR法筛选干扰效率最高的siRNA;(4)实验分组:对照组、Mock组、NC组、转染组。细胞转染48h后,再加入H_2O_2处理24h,观察各组细胞形态,CCK-8法测定细胞增殖活力。结果 (1)在PIG1黑素细胞中检测到PINK1 mRNA及蛋白的表达;(2)黑素细胞增殖活力呈H2O2浓度依赖性降低,0.6mmol/L H_2O_2组降低至(49.02±2.40)%,接近IC50,故以此浓度作用24h建立氧化损伤模型;(3)与Mock组相比,PINK1-siRNA3转染48h干扰效率最高(90%);(4)与对照组相比,PINK1-siRNA3转染组树突回缩及变圆悬浮的细胞明显增多,转染组细胞增殖活力明显降低(P0.01)。结论本研究首次明确了PINK1在正常人黑素细胞中的表达,下调PINK1可加重H_2O_2所致的黑素细胞形态学改变及活力降低,表明PINK1对黑素细胞具有一定的保护性作用。     

尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达与细胞增殖和凋亡的相关性

目的 探讨陷窝蛋白1在尖锐湿疣角质形成细胞中的表达及其与角质形成细胞增殖和凋亡的相关性.方法 免疫组化En Vision法和TUNEL技术检测40例尖锐湿疣皮损组织和10例健康人包皮组织中角质形成细胞陷窝蛋白1、增殖细胞核抗原的表达和细胞凋亡,计算陷窝蛋白1平均吸光度、增殖指数和凋亡指数,比较两组之间的差异,并分析尖锐湿疣组中陷窝蛋白1表达与增殖指数、凋亡指数的相关性.针对陷窝蛋白1基因设计3条siRNA,用脂质体转染法将siRNA导人HaCaT细胞,用荧光定量PCR方法筛选出于扰效果最佳的siRNA,转染HaCaT细胞为实验组,转染非特异序列的细胞为阴性对照组,未转染的细胞为空白对照组.Western印迹和免疫荧光检测转染48 h后陷窝蛋白1的表达水平;MTS法分别测定干扰陷窝蛋白1基因24、48、72 h后HaCaT细胞增殖的变化;流式细胞仪(FCM)检测干扰陷窝蛋白1基因48 h后HaCaT细胞的凋亡情况.结果 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1的表达(0.042±0.021)显著低于正常包皮组织(0.181±0.075),差异有统计学意义(t=5.843,P＜0.001).尖锐湿疣皮损中角质形成细胞的增殖指数(65.63％±19.86％)和凋亡指数(24.12％±10.86％)均显著高于正常包皮组织(23.51％±4.00％,3.13％±1.12％),两组差异有统计学意义(t=12.440、11.970,均P＜ 0.001).尖锐湿疣组陷窝蛋白1表达与增殖指数呈显著负相关(r=-0.798,P＜0.05),与凋亡指数呈显著正相关(r=0.825,P＜ 0.05).荧光定量PCR显示siRNA-2在浓度25 nmol/L下抑制效果最佳.Western印迹和免疫荧光显示,转染siRNA 48 h后,实验组陷窝蛋白1的表达显著低于空白对照组和阴性对照组(P＜0.05).MTS结果显示,实验组细胞24、48和72 h时的A值分别为0.563±0.013、0.628±0.006和0.811±0.018,高于空白对照组(0.541±0.009、0.575±0.012和0.722±0.004)和阴性对照组(0.536±0.006、0.571±0.015和0.719±0.002),差异有统计学意义(均P＜0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).实验组HaCaT细胞凋亡率为(8.90％±0.06％),低于空白对照组(20.59％±0.87％)和阴性对照组(20.64％±0.09％),差异有统计学意义(均P＜ 0.05),空白对照组和阴性对照组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 尖锐湿疣角质形成细胞中陷窝蛋白1表达下降,可能与角质形成细胞增殖加快、细胞凋亡减少有关.     

过氧化氢诱导人黑素细胞氧化应激损伤模型的建立

目的建立不同浓度的H2O2诱导人黑素细胞系PIG1产生氧化应激状态的模型,为进一步研究白癜风氧化应激发病机制奠定基础。方法分别以不同浓度的H2O2处理人黑素细胞系PIG1 24 h,光学显微镜观察黑素细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞内活性氧簇(ROS)水平,CCK-8法检测处理后细胞活性,硫代硫酸巴比妥法检测细胞脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)产生情况。结果随着作用浓度的增加,黑素细胞体积变小,树突数量减少,长度缩短,凋亡及坏死逐渐增加;以0 mmol/L浓度作为对照,0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 mmol/L的H2O2分别处理人黑素细胞系PIG1 24 h后,细胞凋亡率分别为6.8%、11.5%、15.6%、22.7%、38.7%和57.5%;细胞活性随着作用浓度的增加而逐渐降低,细胞内ROS水平及MDA含量随着作用浓度的增加而逐渐升高,1.00 mmol/L浓度处理24 h后开始与对照组相比差异有统计学意义(P0.05)。结论该文摸索出了H2O2引起人黑素细胞氧化应激损伤的最佳实验浓度,并成功建立了人黑素细胞氧化应激损伤模型。     

银杏叶提取物EGb761对氧化应激下白癜风黑素细胞抗氧化作用的影响

目的:明确银杏叶提取物(EGb761)对氧化应激下白癜风黑素细胞抗氧化作用的影响。方法:人正常黑素细胞系PIG1予以H2O2处理建立氧化应激模型,予以不同浓度(50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L、300μg/m L、400μg/m L)EGb761处理,采用MTT法检测PIG1细胞活力,生物化学方法检测脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH),谷胱甘肽过氧化物酶活性及含量,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平。结果:与模型组比较,EGb761组PIG1细胞活力、SOD、GSHPx水平增高,ROS、MDA及LDH的表达水平降低。结论:银杏叶提取物EGb761可保护黑素细胞抵抗氧化应激损伤。     

原代人黑素细胞Wnt5A基因沉默的研究

目的 优化Wnt5A特异性siRNA转染原代人黑素细胞的实验条件,建立沉默Wnt5A基因的模型.方法 培养原代人黑素细胞,将不同浓度(0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L)的阳性参照基因GAPDH特异性siRNA通过脂质体法介导转染原代人黑素细胞,实时荧光定量PCR(qPCR)筛选转染效率最高的siRNA浓度;合成3条Wnt5A-siRNA(Wnt5A-siRNA-793、Wnt5A-siRNA-943、Wnt5A-siRNA-1743),分别转染原代人表皮黑素细胞,qPCR法选择干扰特异性最佳的Wnt5A-siRNA;用最佳Wnt5A-siRNA转染原代人黑素细胞,分别于培养24、48、72 h提取总mRNA及总蛋白,通过qPCR及Western印迹法确定转染效率最高的时间点.结果 0、20.0、33.3、40.0、60.0 nmol/L GAPDH-siRNA转染原代人黑素细胞后,GAPDH mRNA相对表达量分别为1.009±0.161、0.086±0.010、0.140±0.016、0.285±0.095、0.012±0.007,组间比较,差异有统计学意义(F=69.469,P＜0.05).60 nmol/L siRNA组GAPDH表达低于其他各组(均P＜0.05),干扰效率最佳;各Wnt5A-siRNA组及空白组Wnt5AmRNA相对表达量分别为0.331±0.010、2.229±0.029、0.078±0.006、1.000±0.024,差异有统计学意义(F=7 006.094,P＜0.05).Wnt5A-siRNA-1743组目标分子表达量低于其他3组(均P＜0.05),干扰效率最佳.Wnt5A-siRNA-1743转染原代人表皮黑素细胞后24、48、72 h及空白组Wnt5A mRNA相对表达量分别为0.396±0.002、0.026±0.008、0.131±0.079、1.025±0.276,组间比较,差异有统计学意义(F=29.215,P＜0.05),干扰后48 h低于干扰后24、72 h及空白组(均P＜0.05);Wnt5A蛋白相对表达量分别为112.798±0.218、77.765±0.415、30.540±0.219、130.025±0.158,组间比较,差异有统计学意义(F=79 122.889,P＜0.05),干扰后72 h低于干扰后24、48 h及空白组(均P＜0.05).结论 成功建立siRNA沉默人黑素细胞Wnt5A基因的模型.     

α-硫辛酸对黑素细胞氧化应激下的保护作用及抑制自噬机制的研究

目的:探讨α-硫辛酸(α-LA)对体外培养的人黑素细胞氧化损伤的保护作用。方法:以不同浓度的α-LA(100、200及400μmol/L)预处理正常人黑素细胞12 h,再加入500μmol/L H_2O_2处理6 h。采用CCK-8试剂盒检测黑素细胞活力,流式细胞仪分析细胞内活性氧(ROS)含量、钙离子水平及细胞周期,线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)分析线粒体膜电位,图像分析软件测量树突回缩速率,透射电镜观察超微结构以及western blot检测LC3和p62蛋白表达情况。结果:正常情况下α-LA能显著提高黑素细胞的活力,同时还能明显降低氧化应激时黑素细胞内ROS水平,减轻细胞内超微结构的损伤,阻止线粒体去极化及细胞内钙离子的累积,延缓树突的回缩,促进增殖及降低过度激活的自噬水平(P0.05)。结论:α-LA不仅能在正常情况下显著提高黑素细胞的活力,而且可明显降低氧化应激下黑素细胞过度激活的自噬水平,对黑素细胞起保护作用。     

42 ℃热处理在UVB诱导黑素细胞氧化损伤中的作用

【摘要】 目的 探讨热处理在UVB诱导的人黑素细胞氧化应激损伤中的作用。 方法 体外培养原代人表皮黑素细胞,将纯化的MC分为4个处理组：对照组（37 ℃正常培养）、热处理组（42 ℃孵育1 h）、UVB处理组（100 mJ/cm2 UVB照射）、联合处理组（42 ℃孵育1 h后给予100 mJ/cm2 UVB照射）,各组连续处理3 d。MTT法检测细胞活率,生物化学法检测超氧化物歧化酶活力和丙二醛浓度,流式细胞仪检测细胞内活性氧和细胞凋亡率。 结果 对照组细胞活率、细胞凋亡率、超氧化物歧化酶活力、丙二醛浓度、活性氧荧光强度分别为：（100 ± 6.14）%、（4.66 ± 0.58）%、（53.39 ± 8.23） U/gprot、（1.09 ± 0.32） mmol/gprot、1070.85 ± 42.07。UVB照射可以明显提高MC凋亡率［（24.14 ± 2.90）%］、丙二醛［（1.65 ± 0.33） mmol/gprot］和细胞内活性氧（1416.45 ± 79.12）水平,降低细胞活率［（50.23 ± 5.36）%］和超氧化物歧化酶活力［（31.98 ± 11.89） U/gprot］,而热处理可以显著降低UVB诱导的凋亡［（14.9 ± 1.49）%］,降低丙二醛［（1.10 ± 0.26 ） mmol/gprot］、活性氧（1033.30 ± 68.41）的含量,同时恢复细胞的活率［（74.12 ± 6.17）%）］和超氧化物歧化酶活力［（51.63 ± 6.55）U/gprot］。 结论 热处理对UVB诱导的黑素细胞的氧化应激损伤具有保护作用。     

咖啡酸衍生物WSY6对黑素细胞氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的 探讨咖啡酸衍生物WSY6对过氧化氢（H2O2）诱导的黑素细胞氧化损伤的保护作用和潜在分子机制。方法 体外培养原代人表皮黑素细胞,分为对照组（不做任何处理）、H2O2组（1 mmol/L H2O2处理）和6.25、12.5、25 μmol/LWSY6组（分别用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6预处理1 h后再用1 mmol/L H2O2处理1 h）。继续培养24 h后,用MTS法测定黑素细胞存活率,乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测LDH释放量。部分黑素细胞分为抑制剂组（用p38抑制剂预处理1 h,再用1 mmol/L H2O2处理1 h）和H2O2组（直接用1 mmol/L H2O2处理1 h）,处理完成后继续培养24 h,用试剂盒检测LDH的释放量。部分黑素细胞用25 μmol/L WSY6预处理1、2、4 h后,再用H2O2处理1 h,流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）水平;部分黑素细胞用6.25、12.5、25 μmol/L WSY6处理1 h后,再用H2O2处理1 h,Western印迹法检测细胞色素C（cyto?c）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase?3）、caspase?9和磷酸化丝裂原活化的蛋白激酶（p?p38 MAPK）、细胞外调节蛋白激酶（p?ERK）及c?Jun氨基末端激酶（p?JNK）的表达。结果 与对照组相比,H2O2组黑素细胞存活率明显降低（29.22% ± 1.31%,P < 0.05）,细胞内LDH释放量增加（47.19% ± 4.85%,P < 0.05）,ROS水平明显升高（18.37 ± 1.59,P < 0.05）,caspase?3和caspase?9的表达亦均升高。与H2O2组相比,6.25、12.5、25 μmol/L WSY6组细胞存活率明显增加（52.48% ± 1.17%、60.21% ± 0.25%、78.32% ± 1.73%,P < 0.05）,LDH释放量明显下降（21.99% ± 0.22%、15.38% ± 0.45%、13.18% ± 0.38%,均P < 0.05）,25 μmol/L WSY6处理1、2、4 h组细胞内ROS显著下降（7.59 ± 1.00、6.22 ± 0.52、5.15 ± 0.48,均P < 0.05）。同时p38抑制剂组黑素细胞LDH释放量较H2O2组显著下降（P < 0.05）。Western印迹法显示,WSY6预处理后,与H2O2组相比,caspase?3和caspase?9表达明显降低,p?p38表达下降,但p?ERK和p?JNK表达无明显变化;同时WSY6组p38 MAPK下游产物p?p53表达也下降,且WSY6浓度越高,下降越明显。结论 WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤有显著的保护作用,可能通过p38 MAPK途径发挥作用。     

p21小干扰RNA对低浓度过氧化氢诱导的黑素细胞提前衰老和黑素传递的影响

目的:探讨小干扰RNA(siRNA)抑制p21表达对低浓度过氧化氢(H_2O_2)诱导的黑素细胞提前衰老的影响,以及黑素细胞提前衰老与黑素传递功能间的关系。方法:p21 siRNA序列转染黑素细胞,采用荧光显微镜、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及western blot检测抑制效率。将正常人黑素细胞分为对照组(阴性siRNA转染处理)、p21 siRNA组(p21 siRNA转染处理)、阴性siRNA+H_2O_2组(阴性siRNA转染24 h后加入400μmol/L H_2O_2处理)及p21 siRNA+H_2O_2组(p21 siRNA转染24 h后加入400μmol/L H_2O_2处理)。采用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;EdU细胞增殖检测细胞增殖能力;western blot检测各组p21和树突调节蛋白[RhoA、Rac1及细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)]表达;免疫荧光检测细胞骨架蛋白和黑素小体分布。结果:p21siRNA转染黑素细胞后明显抑制p21 mRNA和蛋白表达(P0.05)。与阴性siRNA+H_2O_2组比较,p21 siRNA+H_2O_2组β-半乳糖苷酶染色阳性率降低、细胞增殖能力增加及p21蛋白表达降低(P0.05)。与对照组比较,阴性siRNA+H_2O_2组树突负性调节因子Rho A蛋白表达升高,而正性调节因子Rac1及Cdc42蛋白表达均降低,且细胞骨架蛋白及黑素小体荧光强度均降低(P0.05)。经p21siRNA预处理后,p21 siRNA+H_2O_2组较阴性siRNA+H_2O_2组Rho A蛋白表达降低,Rac1和Cdc42蛋白表达均增高,且细胞骨架蛋白及黑素小体荧光强度均增高(P0.05)。结论:低浓度H_2O_2诱导提前衰老的黑素细胞存在黑素传递功能障碍,p21 siRNA可改善低浓度H_2O_2诱导的黑素细胞提前衰老以及受损的黑素传递功能。     

维生素C溶液在H2O2诱导体外培养黑素细胞氧化损伤中的影响

目的：探讨维生素C对体外培养的人黑素细胞增殖活性的影响并评估维生素C对H2O2诱导的人黑素细胞氧化损伤的影响。方法通过CCK8法取最佳浓度的维生素C溶液和半数致死浓度的H2O2溶液应用于实验。将黑素细胞分为对照组、维生素C组、H2O2组、联合处理组4组,经过48 h处理后,分别用CCK8法和流式细胞仪检测4组细胞活率及凋亡率;将除维生素C组以外其他3组细胞,分别用生物化学法检测超氧化物歧化酶活力和丙二醛浓度,荧光染色法检测细胞内的活性氧。结果最佳浓度的维生素C溶液为1000μmol/L,半数致死浓度的H2O2溶液300μmol/L。对照组细胞活率、细胞凋亡率、超氧化物歧化酶活力、丙二醛浓度、活性氧荧光强度分别为（100±4.99）％、（6.90±0.87）％、（54.71±4.75）U/mgprot、（263.39±20.17）nmol/mgprot、342.16±27.36。H2O2溶液可以明显提高黑素细胞凋亡率[（16.47±1.07）％]、超氧化物歧化酶活性[（103.62±10.44）U/mgprot]、丙二醛[（493.70±31.36）nmol/mgprot]和细胞内活性氧（782.48±36.25）水平,降低细胞活率[（39.07±2.94）％],而维生素C溶液可以显著降低H2O2溶液诱导的凋亡[（11.83±0.95）％],降低超氧化物歧化酶活性[（76.73±5.20）U/mgprot]、丙二醛[（371.82±23.05）nmol/mgprot]、活性氧（475.64±52.18）的含量,同时恢复细胞的活率[（74.31±5.53）％）]。结论1000μmol/L维生素C溶液不仅能促进人黑素细胞的增殖,对H2O2诱导的黑素细胞氧化应激损伤具有保护作用。     

马尾松针提取物通过核因子E2相关因子2-抗氧化反应元件通路对人毛乳头细胞氧化应激损伤保护作用的研究

【摘要】 目的 探讨马尾松针提取物（PMNE）对人毛乳头细胞（HDPC）抗氧化应激的保护作用及机制。方法 以HDPC为研究对象,分别采用0（对照组）、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mmol/L H2O2处理HDPC,建立体外HDPC氧化应激的最佳条件;在HDPC中转染核因子E2相关因子2（Nrf2）干扰片段siRNA1、siRNA2、siRNA3或过表达质粒pCMV6-XL5-Nrf2,实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测Nrf2 mRNA及蛋白的表达;H2O2条件下检测转染后各组细胞活性及凋亡率。常规培养HDPC并分组处理,对照组：正常培养,不予其他处理;双氢睾酮组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮;原花青素组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮和6.00 μg/ml原花青素B2处理;不同浓度PMNE组：加入0.03 μg/ml双氢睾酮培养液,同时分别给予1、5、25、100 μg/ml PMNE处理;分别检测各组细胞活性及凋亡率、细胞内活性氧（ROS）相对荧光强度和丙二醛（MDA）含量,Nrf2、醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素加氧酶1（HO-1）、Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）、转化生长因子（TGF）-β1、Sma和Mad相关蛋白2/3（Smad2/3）、p-Smad2/3的表达水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果 HDPC细胞活力为75% ~ 85%时,选择0.4 mmol/L H2O2作为体外HDPC氧化应激最适处理浓度。Nrf2-siRNA1、Nrf2-siRNA2、Nrf2-siRNA3组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著低于空白组和对照组（均P < 0.05）,细胞凋亡率（12.50% ± 0.05%、26.07% ± 0.05%、58.44% ± 1.03%）均显著高于空白组（10.38% ± 0.64%）和对照组（13.05% ± 0.12%）,均P < 0.05。Nrf2-siRNA2组的Nrf2蛋白表达量最低,选择Nrf2-siRNA2为最佳干扰片段进行后续实验。Nrf2过表达组Nrf2 mRNA和蛋白表达均显著高于空白组和对照组（均P < 0.05）,其细胞凋亡率明显低于空白组和对照组（均P < 0.05）。0.4 mmol/L H2O2处理条件下,Nrf2过表达组细胞凋亡率显著低于过表达空载组（t = 3.66,P < 0.001）,细胞活性高于过表达空载组（t = 40.40,P < 0.001）;Nrf2-siRNA2组细胞凋亡率显著高于对照组（t = 13.13,P < 0.001）,而细胞活性显著低于对照组（t = 67.37,P < 0.001）。PMNE处理实验中,原花青素组和不同浓度PMNE组细胞活性均显著高于双氢睾酮组（均P < 0.01）,而细胞凋亡率显著低于双氢睾酮组（均P < 0.01）;原花青素和不同浓度PMNE均能显著抑制双氢睾酮诱导的HDPC细胞内ROS和MDA的过度表达（均P < 0.01）;原花青素组和5、25、100 μg/ml PMNE组Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达显著高于双氢睾酮组（均P < 0.05）,原花青素组和25、100 μg/ml PMNE组Keap1、TGF-β1蛋白表达及Smad2/3磷酸化水平显著低于双氢睾酮组（均P < 0.05）。结论 Nrf2在抵抗HDPC的氧化应激损伤中起重要作用,PMNE可能通过激活Nrf2抗氧化反应元件通路而对HDPC产生明显的保护作用。     

氧化应激下黑素细胞自噬相关基因差异表达分析

目的 探讨过氧化氢(H2O2)对黑素细胞自噬的影响及可能的调节机制.方法 取对数生长期健康人黑素细胞,分为空白对照组(不予任何处理)、阳性对照组(100 nmol/L西罗莫司处理)和实验组(体积分数为10-7～10-3的H2O2处理),处理4h后,使用CCK8法、流式细胞仪分别检测各组黑素细胞活性及凋亡率.吖啶橙染色检测自噬小泡,透射电镜下观察自噬小体,Western印迹检测自噬特异性蛋白Beclin 1、微管相关蛋白轻链3B(LC3B).最后采用包含84个自噬相关基因的RT2 Profiler PCR Array筛选自噬相关的差异表达基因.结果 黑素细胞分别经10-3、5×104、10-4、5×10-5、10-5、5×10-6、10-6H2O2处理后,细胞增殖活性及凋亡率与空白对照组相比差异均有统计学意义(F值分别为286.95、301.23,均P＜0.05),且随H2O2体积分数升高,增殖活性降低,凋亡率升高.除5×l0-6 H2O2组分别与10 5、10-6 H2O2组间相比细胞凋亡率差异无统计学意义外,上述各H2O2组间两两比较,黑素细胞增殖活性及凋亡率差异均有统计学意义(P＜0.05).吖啶橙染色及电镜观察发现,10-5 H2O2、10-6 H2O2和西罗莫司处理的黑素细胞中有自噬小体形成.Western印迹显示,10-5H2O2、10-6H2O2和西罗莫司组黑素细胞Beclin 1表达量和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比率均较空白对照组显著升高(P＜0.05).RT2 Profiler PCR Array结果显示,与空白对照组相比,10-5 H2O2组、10-6H2O2组和西罗莫司组中ATG12、ATG3、ULK1、PIK3CG、PTEN、PIK3C3表达均显著上调,EIF2AK3表达显著下调;10-5 H2O2组和西罗莫司组mTOR表达显著下调,ULK2表达显著上调;10-6H2O2组mTOR表达未发生明显改变,AMPK、JNK1表达显著上调.结论 体积分数为10-5和10-6的H2O2均能有效诱导黑素细胞自噬,可能与影响相关信号分子表达相关.     

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3对黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗刺激小鼠淋巴细胞的影响

目的 探讨体外T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3（TIM-3）对与小鼠黑素瘤B16F10细胞共培养的酪氨酸相关蛋白-2（TRP-2180-188）抗原肽刺激小鼠淋巴细胞的影响。 方法 构建TIM-3重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2,分别转染重组质粒及空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2至人上皮293T细胞,继续培养48 h,制备含TIM-3、免疫球蛋白（Ig-tail）的上清液。TRP-2180-188肽疫苗免疫C57BL/6小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,用TRP-2180-188抗原肽和白细胞介素（IL）-2刺激培养5 d,以未刺激细胞作为对照组。构建B16F10细胞与上述TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系,分为空白对照组（加293T细胞培养48 h上清液）、TIM-3组（加含TIM-3上清液）、阴性对照组（加含Ig-tail上清液）。CCK-8法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测共培养体系中干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子（TNF）-α浓度,流式细胞仪检测共培养体系中CD8+T淋巴细胞。 结果 酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入真核表达载体中,检测到转染重组质粒pFUSE-TIM-3-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有TIM-3表达,转染空质粒pFUSE-mIgG2Aae1-Fc2的293T细胞上清液中有Ig-tail的表达。CCK-8法检测显示24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组淋巴细胞增殖活力分别为（100.00 ± 10.42）%、（108.70 ± 9.90）%、（78.06 ± 6.37）%,48 h时分别为（100.00 ± 6.24）%、（168.00 ± 2.98）%、（42.93 ± 5.93）%;24 h、48 h时TIM-3组淋巴细胞活力低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。TIM-3组48 h相比24 h淋巴细胞增殖倍数低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时,空白对照组、阴性对照组、TIM-3组IFN-γ浓度分别为（216.44 ± 7.85）、（223.67 ± 7.79）、（192.96 ± 5.05） ng/L,48 h时分别为（230.06 ± 4.23）、（167.24 ± 3.33）、（54.95 ± 0.57） ng/L。24 h、48 h时,TIM-3组IFN-γ浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h、48 h时,TIM-3组TNF-α浓度低于空白对照组和阴性对照组（均P ＜ 0.05）。24 h时空白对照组、阴性对照组、TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数分别为0.421%、2.22%、3.30%,48 h时分别为0.577%、0.691%、4.06%。24 h、48 h时TIM-3组CD8+T淋巴细胞中位数高于空白对照组和阴性对对照组。 结论 TIM-3在体外能够抑制B16F10细胞与TRP-2180-188抗原肽刺激淋巴细胞共培养体系中淋巴细胞增殖和分泌IFN-γ、TNF-α,提高CD8+T淋巴细胞。     

黑果枸杞多糖对中波紫外线诱导HaCaT细胞光损伤的保护作用

目的 探讨黑果枸杞多糖对HaCaT细胞光损伤的预防作用及机制.方法 采用超声辅助水提法提取柴达木黑果枸杞中的多糖成分.体外培养的HaCaT细胞分为3组,对照组:正常培养,不做其他处理;中波紫外线(UVB)组:30 mJ/cm2 UVB照射;实验组:30 mJ/cm2 UVB照射前6h加入2 g/L黑果枸杞多糖溶液.照射1h后继续培养12h,倒置显微镜观察细胞形态,MTS法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞凋亡率,酶标法检测细胞丙二醛和谷胱甘肽过氧化物酶含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力,ELISA法检测上清液和细胞中白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平.结果 与对照组相比,UVB组细胞形态模糊不清,出现死亡漂浮现象;实验组细胞肿胀,但形态尚清楚.MTS结果显示,3组间细胞增殖吸光度值差异有统计学意义(F=48.88,P＜0.01),其中UVB组(1.72±0.12)显著低于对照组(2.34±0.11),实验组(2.11±0.10)又显著高于UVB组,差异均有统计学意义(P＜0.05).UVB组细胞凋亡率(82.41％±2.49％)显著高于对照组(3.98％±0.19％)和实验组(22.79％±0.97％),实验组细胞凋亡率明显高于对照组,各组间比较差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).UVB组与对照组比较,丙二醛含量明显上升,SOD活性、谷胱甘肽过氧化物酶含量、CAT活性明显下降(均P＜0.05).同时,UVB组较对照组上清液中IL-1和TNF-oα含量及细胞中TNF-α含量均明显升高(均P＜0.05),但细胞中IL-1差异无统计学意义(P＞0.05).结论 黑果枸杞多糖对HaCaT细胞的光损伤有保护作用,其保护机制可能与减少细胞炎症物质的合成和口分泌及减少自由基有关.     

CDK2基因沉默联合达卡巴嗪对B16-F1黑素瘤的生长抑制作用

目的 探讨CDK2基因沉默后对达卡巴嗪(DTIC)治疗B16-F1黑素瘤抑瘤效应的影响.方法 实验设对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组,MTT法检测各组细胞生长抑制情况,计算药物相互作用指数(CDI值),AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况.建立C57 BL/6小鼠B16-F1细胞移植瘤模型,分组实验,持续观察18d,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤生长抑制率,TUNEL检测肿瘤组织细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组在72h的细胞相对存活率分别为(40.6±2.8)％、(45.2±3.7)％、(28.7±2.1)％,细胞凋亡率分别为(25.1±3.3)％、(15.6±2.2)％和(45.6±3.5)％,细胞相对存活率显著降低(F=458.04,P＜ 0.05)而细胞凋亡率显著升高(F=115.46,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组比DTIC组的细胞相对存活率显著降低(P＜0.01),而细胞凋亡率显著升高(P＜0.01);两药相互作用指数(CDI值)＜0.7.治疗第6天,对照组、CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤体积分别为(185.44±68.97) mm3、(83.91±14.33)mm3、(123.70±20.85) mm3、(34.54±10.72) mm3.从治疗的第6天开始,与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组及CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显降低(F=11.819,P＜0.05),而CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长速度明显低于DTIC组(P=0.04);与对照组相比,CDK2-shRNA组、DTIC组、CDK2-shRNA+ DTIC组的肿瘤生长抑制率分别为52.2％、41.2％、86.4％,组织细胞凋亡指数分别为(32.93±3.72)％、(21.62±3.54)％、(63.29±4.74)％,组织细胞凋亡指数显著升高(F=222.25,P＜0.05),其中CDK2-shRNA+ DTIC组的组织细胞凋亡指数显著高于DTIC组(P＜0.01).结论 沉默CDK2基因的表达可以增加DTIC对黑素瘤的生长抑制作用,二者体外有协同效应,通过增加肿瘤细胞的凋亡是其机制之一.