人乳腺珠蛋白临床应用研究进展

人乳腺珠蛋白(hMAM)是一种分泌型球蛋白,在乳腺癌组织中高表达,具有乳腺组织特异性。hMAM是一种良好的乳腺肿瘤标志物,具有重要的临床应用价值,对乳腺癌早期诊断与鉴别诊断具显著意义,并为乳腺癌的免疫治疗、基因治疗提供广阔的应用前景。     

抗重组人白细胞介素12单克隆抗体的制备及其生物学特性

以纯化的重组人白细胞介素12（rhIL-12）蛋白为抗原,制备具有生物活性的rhIL-12单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行研究鉴定,为肿瘤及免疫相关性疾病的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。方法： 以纯化的rhIL-12p70免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术,用间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及多次克隆化,培养制备杂交瘤细胞系,用clutathione sepharose 4B进行纯化。采用间接ELISA及Western blotting等方法对McAb的Ig亚类（型）腹水效价及特异性进行鉴定。结果：建立了3株持续分泌rhIL-12p70　McAb的杂交瘤细胞株,3株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞,所分泌的抗体为2株IgG1亚类及1株IgG2a亚类,轻链属k型,小鼠腹水效价测定分别为1∶5.9×106、1∶2.9×10⁷、1∶3.6×10⁷,亲和力依次为EM5>EM6>EV9。结论：成功地制备了3株能稳定分泌抗rhIL-12p70的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高。     

重组人白细胞介素10单克隆抗体的制备

目的 制备重组人白细胞介素１０（ｒｈＩＬ－１０）单克隆抗体。方法 应用鼠－鼠 瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,ＥＬＩＳＡ检测朵交瘤细胞培养上清、腹水效价,双向免疫扩散试验进行亚类鉴定,Ｇｉｅｍｓａ染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果获得了２株能分泌抗ｒｈＩＬ－１０单克隆抗体的杂交瘤细胞系（１Ｄ３、２Ａ３）,无血清培养液效价为１：５１２、１：２５６,腹水效价１：１０＾４、１：１０＾４。ＵＪＦ     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.     

抗钙调素单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备及鉴定抗钙调素单克隆抗体。方法 以碳化二亚胺法将钙调素—卵清蛋白偶联物作为免疫原，采用常规免疫方法免疫BALB／C小鼠，杂交瘤技术制备抗牛脑钙调素单克隆抗体。酶联免疫吸附法(ELISA)检测，应用硫酸铵盐析法和离子交换层析法进行抗体纯化。分别采用免疫印迹、免疫酶斑点法鉴定抗钙调素单克隆抗体的性质。结果 脾细胞与骨髓瘤细胞的融合率为85％。阳性克隆率为0．35％，获得两株动物钙调素单克隆抗体，抗体效价为1：1000，对钙调素有较强的专一性。结论 此研究制备出了高特异性、高亲和力及高效价的抗牛脑钙调素单克隆抗体。     

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及其特性研究

本文采用亲和层析法纯化的甲胎蛋白（ＡＦＰ）抗原免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０小鼠骨髓瘤细胞系融合，获三株分泌抗人ＡＦＰ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞系。用ＥＬＩＳＡ阻断试验和夹心ＥＬＩＳＡ试验作特异性鉴定，杂交瘤细胞株染色体的众数为１０４条，三株细胞系ＭｃＡｂ均属小鼠ＩｇＧ１型。经体外连续传代３个月及冻存一年复苏后均能持续分泌抗ＡＦＰ抗体。     

抗人精子单克隆抗体的制备及特性研究

用杂交瘤技术制备了两株分泌抗人精子单克隆抗体的细胞株，经酶联免疫吸附试验证明两株细胞株所分泌的单克隆抗体均能与人精子产生特异反应，并有明显的精子凝集和制动作用     

抗人Hb单克隆抗体的制备与鉴定

用超声波快速乳化人Ｈｂ，作为抗原免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取其脾细胞与Ｓｐ２／０骨髓瘤细胞经离心ＰＥＧ法融合，微波ＥＬＩＳＡ筛选阳性克隆，获得三株分泌针对人Ｈｂ不同抗原位点的单克隆抗体杂交瘤细胞系。分别命名为Ｈｂ２６４、Ｈｂ２１０和Ｈｂ２３８。其中Ｈｂ２６４能特异识别人Ｈｂ的β链而不与动物Ｈｂ交叉反应；解离常数Ｋｂ为１．６×１０￣（－８）ｍｏｌ／Ｌ，ＩｇＧ＿（２ａ）。Ｈｂ２１０能结合人Ｈｂ的α链，可被猪Ｈｂ抑制，但亲合力低１００倍；Ｋｄ（人Ｈｂ）为２．８×１０￣（－８）ｍｏｌ／Ｌ；Ｋｄ（猪Ｈｂ）为３．０×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ；ＩｇＧ＿（２ｂ）。Ｈｂ２３８是两个脾细胞与一个Ｓｐ２／０细胞融合而成的三体瘤（ｔｒｉｏｍａ）；染色体１３２条；Ｈｂ２３８单克隆抗体可同人Ｈｂ的α和β链结合，Ｋｄ（人Ｈｂ）为８．９×１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ；ＩｇＧ＿（２ａ）；经分析鉴定，Ｈｂ２３８是针对人Ｈｂα和β链的双特异性抗体。本方法对免疫学隐血检测、法医学鉴定和双特异抗体的研制有一定意义。     

分泌抗人原发性肝癌单克隆抗体杂交瘤的制备及专一性分析

研制抗人原发性肝癌特异性单抗，为肝癌的导向诊断与治疗奠定基础。用人ＰＨＣ细胞系ＨｅｐＧ２免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，聚其脾细胞与同源骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，经间接免疫荧光染色加流式细胞仪筛选及专一性鉴定，单抗经ＰｒｏｔｅｉｎＡ法纯化。用ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度测定。     

抗幽门螺杆菌单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)全菌的单克隆抗体并对其特异性进行初步鉴定。方法用培养的幽门螺杆菌超声破菌后的上清和沉淀为抗原分别免疫BALB／c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体并测定抗体免疫球蛋白亚类、效价及亲和力,用重组表达的Hp Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白鉴定抗体。结果共获得34株抗Hp的单克隆抗体,其中抗上清31株和抗沉淀3株,34株抗体中针对Lpp20、HspA、urease A、CagA、urease B、catalase蛋白的抗体分别为3、2、4、1、5、2株,目前已鉴定的部分单克隆抗体的亚类均为IgGl,细胞培养上清的效价为1:16-1:32,腹水效价为1:32000～1:64000,抗体亲和常数介于1×10-10mol／L-5．2×10-12mol／L。结论获得特异性针对幽门螺杆菌的单克隆抗体,为幽门螺杆菌的诊断和疫苗研究奠定基础。     

抗人蛋白酶激活受体3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定抗人蛋白酶激活受体3(PAR3)单克隆抗体(mAb).方法:以人PAR3为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗PAR3 mAb.采用捕获ELISA法鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术、免疫组织化学染色法、斑点杂交技术鉴定mAb的特异性.结果:获得2株可稳定分泌抗人PAR3 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM.斑点杂交技术分析表明,其mAb能与PAR3抗原有效结合.免疫组织化学染色表明,mAb与肺组织中的巨噬细胞、结肠组织中的淋巴细胞及疑似肥大细胞、扁桃体和包皮组织中的淋巴细胞的反应呈阳性.流式细胞仪分析及激光共聚焦显微镜观察显示,2株mAb与人肺腺癌A549细胞胞内及膜上的PAR3均呈阳性反应.结论:成功地制备抗PAR3 mAb,为变态反应性和炎症性疾病的研究提供了有用的试剂.     

酵母菌烯醇化酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备并鉴定抗酵母菌烯醇化酶单克隆抗体杂交瘤细胞株.方法用面包酵母烯醇化酶做抗原,用细胞融合技术制备单克隆抗体,并采用ELISA法对单克隆抗体进行筛选和鉴定.结果建立了2株持续分泌抗面包酵母烯醇化酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株.其中3G5-F3-F5小鼠腹水单克隆抗体的最高稀释度达1:12 800;单克隆抗体的重链属IgG1亚类,轻链属K型;Western Blotting证实单抗能与面包酵母的烯醇化酶抗原(4.8×104)特异性地结合.结论本研究建立了抗酵母菌烯醇化酶杂交瘤细胞株单克隆抗体,为快速诊断系统性念珠菌感染打下了实验基础并创造了条件.     

抗人肺表面活性物质相关蛋白A单克隆抗体的制备及其特性的鉴定

目的制备抗人肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)单克隆抗体并对其特性进行鉴定。方法以自行制备的SP-A蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,建立分泌抗人SP-A单抗的杂交瘤细胞株,诱发小鼠产生单抗腹水,用(NH4)2SO4盐析纯化腹水,用间接ELISA法测定单抗效价,用Western blotting测定抗体特异性。结果建立了3株能持续分泌抗SP-A单抗的杂交瘤细胞株,其中2B6杂交瘤细胞株抗体效价最高,其染色体数目均大于100条。间接ELISA法测定腹水和细胞培养上清效价,分别为1∶50 000和1∶10 000。用Western blotting在SP-A蛋白泳道上相对分子质量31 000左右位置出现明显的一条染色条带。结论自行制备的抗人SP-A单抗,其具有特异性强、效价高的特点。     

抗马尔尼菲青霉单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备和鉴定抗马尔尼菲青霉单克隆抗体(mAb)。方法用基因重组马尔尼菲青霉甘露糖蛋白1(MP1)抗原免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法和免疫印迹进行筛选和鉴定。结果筛选出4株稳定分泌抗马尔尼菲青霉mAb杂交瘤细胞株,IgG亚类鉴定均为IgG1,抗体亲和常数分别为8.2×10-9、4.7×10-9、6.5×10-9和2.7×10-9,免疫印迹证实马尔尼菲青霉mAb特异性识别MP1。结论4个杂交瘤细胞株特异性好、亲和力高,为马尔尼菲青霉病的快速诊断奠定了基础。     

抗人脑源性神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗人脑源性神经营养因子(BDNF)单克隆抗体。方法利用BDNF纯品与酸处理后的沙门氏菌菌体(抗原∶菌体为1∶5)混合免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb。结果获得3株抗BDNF的单克隆抗体,分别命名为B1、B2和4D1,mAb的Ig亚类均为IgG1。ELISA间接法测定腹水mAb效价为1×10-6~1×10-5,各单抗相对亲和力结果为B2>B1>4D1。结论成功研制出抗人BDNF单克隆抗体,为进一步研究BDNF在体内组织的表达及分布提供了一种工具,并为基因工程制备BDNF提供了检测方法。     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

抗人凋亡相关蛋白TFAR19的单克隆抗体制备及鉴定

目的：研制鼠抗人凋亡相关蛋白ＴＦＡＲ１９的单克隆抗体,以进一步探讨ＴＦＡＲ１９蛋白的结构与功能。方法：以纯化的重组人ＴＦＡＲ１９蛋白为抗原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,将ＴＦＡＲ１９蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行细胞融合,经克隆筛选获得鼠抗人ＴＦＡＲ１９蛋白单抗的杂交瘤细胞株,以间接ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析等方法进行单克隆抗体的鉴定。结果：获得了３株稳定分泌抗人ＴＦＡＲ１９单克隆抗体的杂交瘤细胞株（Ｃ１,Ｃ１０,２Ｃ１２）,其分泌的单抗效价高,特异性好,亲和力不一,免疫球蛋白亚类均为ＩｇＧ１。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析证明ＴＦＡＲ１９蛋白在调亡细胞中高表达。结论：所获单抗能特异识别原核及真核细胞表达的ＴＦＡＲ１９蛋白,为进一步探讨ＴＦＡＲ１９蛋白的生物学效应提供了条件。