人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

目的 制备抗原食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体，用于寻找肿瘤的标志物和癌的病理诊断。方法 以食管癌组织核基质为抗原，采用足垫法免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，运用杂交瘤技术建立分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株，制备食管癌细胞抗原片和食管癌冰冻切片，采用免疫组化检测并采用蛋白印迹法分析，鉴定是否为特异性单克隆抗体。结果 获得一细胞株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，１－７／Ｅ能与食管癌细胞和其他１０种癌细胞的核仁反应，不     

LAMP2单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备抗-lamp2单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步鉴定.方法:根据已发表的文献通过人工合成多肽,并将此多肽分别连接KLH和BSA,以peptide-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠,取血清效价大于 1:10000 的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 进行融合,以peptide-BSA包被,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测杂交瘤细胞的上清进行筛选;得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,采用免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别目的蛋白.结果:得到一株能稳定分泌抗-LAMP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,应用免疫组化方法证明新制备的抗-LAMP2单克隆抗体能识别天然的 LAMP2;此单克隆抗体的亚类为.结论:杂交瘤细胞株能稳定分泌目的单克隆抗体;免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别自己天然的目的蛋白,为更好地研究LAMP2的生物学功能奠定了基础.     

抗人胰腺癌单克隆抗体SZ-121的制备和初步鉴定

目的探讨抗人胰腺癌单克隆抗体SZ-121的制备并对其进行初步鉴定。方法用人胰腺癌细胞株Patu8988作为免疫原,利用杂交瘤技术制备抗人胰腺癌单克隆抗体,应用流式细胞术和免疫组化鉴定抗体的特异性。结果成功获得一株能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系SZ-121,该抗体与胰腺癌组织呈阳性反应,与胰腺良性病变组织呈弱阳性反应。结论单抗SZ-121对胰腺癌的早期诊断可能具有一定的潜在价值。     

食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

【目的】制备抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体 ,用于寻找肿瘤的标志物和癌的病理诊断。【方法】以食管癌组织核基质为抗原 ,采用足垫法免疫Balb/c小鼠 ,运用杂交瘤技术建立分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株 ,制备食管癌细胞抗原片和食管癌冰冻切片 ,采用免疫组化检测并采用蛋白印迹法 (Westernblotting)分析 ,鉴定是否为特异性单克隆抗体。【结果】获得一细胞株 (1 7/E)能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株 ,1 7/E能与食管癌细胞和其他 10种癌细胞的核仁反应 ,不与正常食管上皮细胞核仁反应。Westernblotting分析表明 ,1 7/E与食管癌组织核基质 41ku处有一反应带 ,与正常食管组织核基质无反应。【结论】 1 7/E可能是对食管癌等多种肿瘤细胞核仁抗原的特异性单克隆抗体 ,为深入研究肿瘤细胞核仁抗原的生物学特性及肿瘤病理诊断提供了有效的制剂 ,并具开发的潜在价值。     

人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的：建立抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。方法：从人心肌组织中提取纯化人cTnT，免疫BALB／C小鼠，采用杂交瘤技术，间接ELISA法选择能稳定分泌抗cTnT　McAb的杂交瘤细胞株。结果：建立了2株稳定分泌抗cTnT　McAb的杂交瘤细胞株N15C和N16D，其染色体数目为90-106，McAb Ig亚类均为IgG，，间接ELISA法测定McAb腹水效价分别为1：8000和1：32000。免疫印迹结果显示2株McAb均可识别cTnT中Mr为37000的单一区带，不识别人骨骼肌提取物。间接ELISA法测定N15C和N16DMcAb与cT—nT反应的最低浓度分别为47μg/L和23μg／L。相加试验表明2株McAb能识别不同的抗原表位。结论：获得2株能稳定分泌特异性抗人心肌cTnT McAb的杂交瘤细胞株。     

抗AIB1-N单克隆抗体的制备及鉴定

目的获得有生物活性的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端（amplified in brest cancer 1-Nterminal,AIB1-N）单克隆抗体。方法以谷胱甘肽转硫酶耦联的抗乳腺癌扩增性抗原1氮端蛋白（GST-AIB1-N）为免疫原,免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗AIBl一N单克隆抗体,用间接ELISA和Western-blot鉴定其亚类和抗原结合特异性。结果成功筛选出一株稳定分泌抗AIB2—N单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类为IgG1,经Western-blot鉴定该McAb特异性高,亲和力强。结论成功制备了抗AIB1-N单克隆抗体,为深入研究AIB1的表达及临床应用提供了有力的工具。     

重组人内抑素单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗重组人内抑素(ES)单克隆抗体(McAb)并进行鉴定。方法利用重组人ES为抗原,免疫Balb/c小鼠,应用杂交瘤技术将免疫小鼠的脾细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,间接ELISA法对细胞培养上清进行筛检,对能稳定分泌抗重组人ES的细胞株,进行扩大培养。体内诱生法制备腹水并对其初步鉴定。结果获得3B4、1D10、1G5、2D10,4株能稳定分泌抗重组人ESMcAb的杂交瘤细胞株,并对3B4和1D10两株给予鉴定,其免疫亚型为IgG2a、IgG3。腹水ELISA效价为10-6、10-5。通过蛋白免疫印迹法和免疫组化证明抗体有特异性和敏感性。结论成功制备分泌抗重组人ES的杂交瘤细胞株,为研究人ES的表达及相关领域奠定了基础。     

抗人脑胶质瘤单克隆抗体SZ-39特异性及其识别抗原的初步鉴定

本文以人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44为抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术获得了一株稳定地分泌抗胶质瘤细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞株SZ-39。经ELISA、间接免疫荧光法和ABC免疫组化法分别检测了SZ-39与各种肿瘤和正常细胞、脑瘤和正常人体组织     

兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌（Bb）的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为今后进一步建立该菌的免疫检测技术奠定基础。方法以Bb分离株BLJ05的灭活菌液为免疫原,腹腔免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术制备Bb单克隆抗体（McAb）,用间接ELISA、Western-blot等方法对McAb特性进行鉴定。结果获得两株能稳定分泌抗Bb单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A7D5和D6B2,其小鼠腹水抗体效价分别为1∶409600和1∶102400;且不与兔大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌等兔的常见病原菌反应,特异性强。两株单抗亲和力实验表明A7D5亲和力略高于D6B2。ELISA相加试验表明它们针对相同的抗原表位。结论成功建立了两株能稳定分泌抗兔支气管败血波氏杆菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,效价高、特异性强,为今后建立该菌的免疫检测技术建立奠定了基础。     

重组创伤弧菌溶细胞素单克隆抗体的制备

目的：制备重组创伤弧菌溶细胞素（recombinant Vibrio vulnificus cytolysin,rVVC）鼠源性单克隆抗体,并对其特异性及免疫球蛋白类型进行鉴定,为创伤弧菌溶细胞素（Vibrio vulnificus cytolysin,VVC）致病机制的后续研究及创伤弧菌引起的食品污染中溶细胞毒素快速检测试剂盒的研发奠定基础。方法：IPTG诱导含pET28a（＋）-vvhA的大肠杆菌表达rVVC,将rVVC纯化、复性后经甲醛脱毒作为抗原免疫BALB/c小鼠。SDS-PAGE检测蛋白纯化后效果。采用杂交瘤技术和ELISA法制备并筛选分泌rVVC单克隆抗体的杂交瘤细胞株,有限稀释法对阳性孔克隆化培养。采用免疫双扩法鉴定单克隆抗体类型,ELISA法、免疫双扩法鉴定单克隆抗体的特异性。结果：将纯化复性后的rVVC作为抗原免疫小鼠后,经ELISA检测,血清有效稀释度达1：12800。共获得2株可持续分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为B2C7和E3F4株,其抗体类型均为IgG1,且具有较高特异性,与多种其他细菌蛋白不发生免疫反应。结论：本研究成功免疫BALB/c小鼠,获得B2C7和E3F4两株可持续稳定分泌rVVC鼠源性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,抗体类型为IgG1型。     

人乳腺珠蛋白基因亚型的原核表达及纯化

目的：克隆人乳珠蛋白（hMAM）编码全长cDNA，原核表达并纯化蛋白产物，为后期研制乳腺癌早期诊断试剂盒奠定基础。方法：自乳腺癌组织及乳腺癌细胞株MD-MB453提取总RNA，通过RT-PCR克隆hMAMcD-NA，构建pQF40-hMAM表达质粒，在大肠杆菌M15中表达，利用镍．亚硝胺乙酸组氨酸（Ni-NTA-His）亲和层析法对重组蛋白进行纯化。结果：乳腺癌组织和乳腺癌细胞株中发现两种hMAM cDNA亚型，即hMAM和hMAM（Isoform），长度分别为279和270bp，两者相差9个连续碱基，其翻译产物相差3个连续氨基酸残基；表达的融合蛋白以不溶性包涵体形式存在，纯化后得到纯度为97％的目的蛋白。结论：获得hMAM cDNA并发现一个新的hMAM突变体；融合蛋白的表达及纯化成功。     

Preparation and initial application of a monoclonal antibody specific for a newly discovered conserved linear epitope of rabies virus nucleoprotein

Objective To prepare monoclonal antibodies against a newly discovered and conserved linear epitope of Rabies virus nucleoprotein and to use them in a rabies diagnostic test.Methods Synthetic peptide containing the epitope was used as immunogen to prepare hybridoma cell lines by classical hybridoma technology.Anti-peptide monoclonal antibodies produced in ascites of inoculated Balb/c mice were labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) after purification and used in fluorescent antibody test (FAT). Results Two positive hybridoma cell lines,RVNP-mAb1-CL and RVNP-mAb2-CL,were obtained.RVNPmAb1-CL produced a higher concentration of monoclonal antibody RVNP-mAb1 in Balb/c ascites.FITC-labeled RVNP-mAb1 showed correct results on certain Rabies virus-positive canine brain tissue samples and cells of a small subclone of baby hamster kidney 21 cell line (BSR).Conclusion FITC-labeled RVNP-mAb1 has potential application for laboratory diagnosis of rabies.     

间日疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

目的研制间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)单克隆抗体,并对抗体特性进行了初步鉴定。方法用纯化的重组PvLDH蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,测定其免疫球蛋白亚类及效价,结合ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果共获得5株稳定分泌抗PvLDH重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别为6D1、6D2、5A10、5C7、4A8。5株单抗培养上清的ELISA效价为1∶512～1∶1024,腹水效价为1∶12800～1∶25600,其中5C7、6D1经Western-blot鉴定能与天然的恶性疟原虫和间日疟原虫的LDH发生特异性反应。结论本研究方法成功制备并获得了针对PvLDH的单克隆抗体,为进一步研究疟疾诊断试剂奠定了基础。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHp）单克隆抗体（McAb）,并对其特异性进行鉴定,用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,筛选出分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westen blotting试验分析其特导性。结果,制备出2A5和 1H10两株能稳定分泌抗LDHp　McAb的杂交瘤细胞株,两株单抗均为IgG2b,2A5和1H10培养上清的ELISA效价分别为1:512和1:256,腹水效价分别为1:25600和1:12800,两株单抗与间日疟、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应,能识别恶性疟原虫的33Kda虫源蛋白。证明制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

抗重组人白细胞介素12单克隆抗体的制备及其生物学特性

以纯化的重组人白细胞介素12（rhIL-12）蛋白为抗原,制备具有生物活性的rhIL-12单克隆抗体（McAb）,并对其特性进行研究鉴定,为肿瘤及免疫相关性疾病的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。方法： 以纯化的rhIL-12p70免疫BALB/C小鼠,采用杂交瘤技术,用间接ELISA法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞及多次克隆化,培养制备杂交瘤细胞系,用clutathione sepharose 4B进行纯化。采用间接ELISA及Western blotting等方法对McAb的Ig亚类（型）腹水效价及特异性进行鉴定。结果：建立了3株持续分泌rhIL-12p70　McAb的杂交瘤细胞株,3株细胞染色体数目均为100条左右,证实为杂交瘤细胞,所分泌的抗体为2株IgG1亚类及1株IgG2a亚类,轻链属k型,小鼠腹水效价测定分别为1∶5.9×106、1∶2.9×10⁷、1∶3.6×10⁷,亲和力依次为EM5>EM6>EV9。结论：成功地制备了3株能稳定分泌抗rhIL-12p70的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高。     

抗人双特异性蛋白磷酸化酶Dusp23单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高亲和力、高特异性的抗人双特异性磷酸化酶23(Dusp23)单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定,为Dusp23功能的研究奠定基础。方法以纯化的原核表达Dusp23为免疫原,免疫BALB/c小鼠,待免疫小鼠血清效价满足融合需要,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化建立可稳定分泌抗Dusp23单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将细胞株打入BALB/c小鼠腹腔制备腹水,用ProteinG亲合层析柱纯化所得腹水获得纯化抗体,ELISA及Western-blot检测抗体的效价和亲和力,并用亚型鉴定试纸条鉴定单克隆抗体的亚型。利用纯化后的两株单克隆抗体对临床收集的肝癌组织标本进行免疫组化分析。结果筛选到2株(N012和N013)可以稳定分泌人双特异性磷酸化酶23(Dusp23)单克隆抗体的细胞株,并对其进行纯化和鉴定,两株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1:5120和1:2560,腹水效价分别为1:25600和1:12800,以肝癌细胞HepG2和重组Dusp23蛋白为抗原,利用纯化后的两株抗体Western-blot鉴定结果均在预期位置出现阳性条带。两株杂交瘤细胞分泌抗体的亚型鉴定N012和N013均为Ig...     

抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.     

人类肿瘤相关蛋白hyrdC的原核表达、抗体制备及其在胃癌中的初步检测

目的:制备原核表达的hyrdC纯化蛋白及相应单克隆抗体,并以该抗体初步检测胃癌中hyrdC蛋白的表达.方法:用RT-PCR方法获取人hyrdC基因序列,插入原核表达载体pET32a构建重组质粒,纯化得到TRX-hyrdC融合蛋白,将其作为抗原免疫BALB/c小鼠,按常规方法制备抗hyrdC单克隆抗体,以ELISA、Western印迹法筛选及鉴定;采用免疫组织化学法(SP法)比较胃癌组织及瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平的差异.结果:测序结果显示克隆的hyrdC ORF与GenBank中登录的序列一致.所获TRX-hyrdC融合蛋白相对分子质量与理论计算值相符,获得2株分泌抗hyrdC单克隆抗体的细胞株;Western印迹法显示该抗体能特异性地结合人hyrdC蛋白;SP法测定显示,hyrdC蛋白在胃癌组织中表达明显高于正常胃组织(P＜0.001).结论:成功制备了抗hyrdC单克隆抗体;SP法测定胃癌组织与瘤旁正常组织中hyrdC抗体水平有显著差异.     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的研究及其应用

本文简要报道本室近年来在抗单纯疱疹病毒单克隆抗体研究方面的结果。①应用淋巴细胞杂交瘤技术,建立了18株稳定分泌抗单纯疱疹病毒单克降抗体的杂交瘤细胞系。②探讨了不同株单克隆抗体介导体外中和作用和动物体内保护作用的机制。③建立了应用单克隆抗体检测病毒抗原的方法。④应用型特异性和型共同性单克隆抗体对临床病毒分离株进行了病毒分型和抗原性分析。⑤应用单克隆抗体纯化了病毒的结构蛋白并对其特性做了鉴定。