人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

人乳头瘤病毒11型E6的原核表达

目的　构建、克隆人乳头瘤病毒 11型 (HPV11)E6蛋白基因 ,并进行表达、纯化和鉴定。方法　用PCR法 ,从尖锐湿疣 (CA)标本中扩增出HPV 11型E6蛋白基因 ,与 pET3 2a载体连接成重组表达质粒pET3 2a/E6;重组质粒转入BL2 1大肠杆菌 ,经诱导表达硫氧还蛋白E6融合蛋白 (Trx E6) ;该蛋白经 3SNTAResin纯化柱纯化 ,SDS PAGE和WesternBlotting检测鉴定。 结果　经酶切及序列分析鉴定 ,重组质粒 pET3 2a/E6成功构建 ,诱导后高表达Trx E6融合蛋白 ,WesternBlotting鉴定证实表达蛋白分子量为 3 60 0 0D的Trx E6融合蛋白。结论　获得高表达、高纯度的HPV11E6蛋白 ,为该蛋白的功能及免疫学分析及CA的疫苗研究打下了基础。     

人乳头瘤病毒6b型E7基因的克隆和表达

目的　克隆人乳头瘤病毒 6b型E7(humanpapillomavirus 6bE7)基因 ,构建原核表达载体 ,并进行蛋白表达和纯化。方法　将HPV 6bE7基因经PCR扩增和亚克隆 ,与GST原核表达载体pGEX 4T 2重组 ,转化E .coliP2 3 92 菌表达蛋白 ,经GlutathioneSepharose 4B亲和层析纯化GST HPV 6bE7融合蛋白。结果　限制性酶切和DNA测序表明 ,HPV 6bE7DNA正确克隆于 pGEX 4T 2多克隆位点。经IPTG诱导表达的GST HPV 6bE7融合蛋白主要存在于可溶性上清。经亲和层析 ,每升诱导菌回收 8.4mg融合蛋白 ,10 %SDS PAGE分析融合蛋白表观分子量约 3 7kDa。结论　成功构建了HPV 6bE7基因原核表达载体 ,并大量表达和纯化了GST HPV 6bE7融合蛋白     

人乳头瘤病毒6b型早期蛋白E6和E7基因的克隆及表达

目的:从尖锐湿疣(CA)标本中克隆出人乳头瘤病毒6b型(HPV-6b)早期蛋白E6、E7基因,并进行序列分析比对及原核表达,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研究奠定基础。方法:用PCR法,从CA标本中扩增HPV-6的E6、E7基因,构建pUCHPV-6E6、pUCHPV-6E7两个重组体,酶切鉴定及测序分析比对。经双酶切与表达载体pGEX-5X-1定向连接,构建pGEX-5X-l重组表达质粒,转入BL21大肠杆菌,IPTG诱导GST融合蛋白表达及Westernblot鉴定。结果:克隆出HPV-6b早期蛋白E6、E7基因,成功构建pUCmHPV-6bE6、pUCmHPV-6bE7重组质粒,克隆获得HPV-6bE6、E7基因与GenBank标准株序列完全相同,经双酶切定向克隆,成功构建重组表达质粒pGEX-5X-lHPV-6bE6和pGEX-5X-lHPV-6bE7,转入BL21大肠杆菌,高效表达GST融合蛋白。结论:本研究克隆出的HPV-6bE6、E7基因与标准株相同,HPV-6bE6、E7GST融合蛋白获得高效表达,为HPV-6bE6、E7基因表达产物的纯化、体外活性以及E6、E7为靶位的基因疫苗研究奠定基础。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析

目的 探究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T(Treg)细胞浸润的相关性及临床意义。方法 选取成都医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月84例行手术治疗的宫颈癌患者的癌组织作为宫颈癌组,选取同一医院同期手术治疗的42例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的宫颈组织作为CIN组,另选取42例因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者的正常宫颈组织作为正常组。对比分析三组组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量、Treg细胞浸润的情况。结果 宫颈癌组HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺T细胞比例均高于CIN组、正常组,CIN组上述指标均高于正常组(P<0.05);宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量与Treg细胞占CD4⁺T细胞比例呈正相关(P<0.05);HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺...     

温热对HPV-6/11型早期基因E6和E7表达的影响

目的 探讨不同温热条件对HPV感染皮损中E6/E7基因表达的影响.方法 采用PCR法确定6例尖锐湿疣标本HPV型别.利用37℃,42℃,45℃不同的温热条件处理置于培养液中的离体尖锐湿疣皮损,采用实时定量PCR法检测HPV-6/11型早期基因E6/E7 mRNA的表达水平.结果 6例标本中.各有1例分别感染HPV-6、HPV-11,4例同时感染HPV-6和HPV-11.E6、E7 mRNA的表达水平均随温度升高而逐渐减少.HPV-6 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.61±0.17).45℃(0.27±0.15);HPV-6 E7 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.56±0.21),45℃(0.16±0.11);HPV-11 E6 mRNA的相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.60±0.22).45℃(0.16±0.08);HPV-11 E7 mRNA相对表达量分别为37℃(1.00±0.00),42℃(0.55±0.15).45℃(0.24±0.06).组间比较差异有统计学意义(P<0.01.结论 温热对HPV-6/11型E6和E7基因表达的抑制作用可能是感染消退的机制之一.     

人乳头瘤病毒6型E7与结核杆菌热休克蛋白70融合基因的构建及原核表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白(HSP)70与人乳头瘤病毒(HPV)6型E7抗原的融合基因,在大肠杆菌中进行表达和纯化。方法：利用PCR方法扩增结核杆菌HSP70基因,插入原核表达载体pGEX-4T-1;经测序后,再通过PCR方法扩增HPV6型E7基因片段．测序后插入HSP70基因的5’端,构建HPV6E7与结核杆菌HSP70的N端融合基因原核表达质粒pGEX—E7-HSP70：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,进行诱导表达和分离纯化。结果：成功地构建了pGEX—E7-HSP70原核表达质粒：在含有该质粒的大肠杆菌DH5α中,经异丙醇-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达相对分子质量约为108000的蛋白;经谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达系统纯化,得到E7与结核杆菌HSP70的可溶性融合蛋白。结论：成功获得HPV6型E7与结核杆菌HSP70的融合蛋白,为研究该融合蛋白疫苗在尖锐湿疣治疗中的作用奠定了基础。     

人乳头瘤病毒11型E6基因与人IFN-α2b融合基因原核表达质粒的构建与鉴定

目的构建HPV11E6与人IFNα2b融合基因表达载体,为进一步原核表达奠定基础。方法在IFNα2b的起始密码子之前加入ccatggct,同时以编码(GGSGS)3的45个碱基序列取代其终止密码子,将改造后的人IFNα2b基因人工合成,然后将其装入质粒pET32a的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间;PCR扩增HPV11E6基因片段。将含有IFNα2b基因片段的质粒pET32a和含有BamHⅠ,EcoRⅠ酶切位点的HPV11E6同时用BamHⅠ,EcoRⅠ酶切,将酶切产物纯化回收后做连接反应,连接产物常规转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,随机挑选阳性克隆并提取质粒酶切鉴定,同时将挑选的阳性克隆菌液送公司测序。结果测序结果表明成功的将HPV11E6和人IFNα2b通过连接肽(GGSGS)3连接并装入pET32a的NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间,且基因序列与设计完全一致。结论HPV11E6与人IFNα2b融合基因表达载体的成功构建,为进一步原核表达奠定了基础。     

尖锐湿疣患者人乳头瘤病毒11型L1基因的克隆及序列分析

目的克隆和分析HPV11的晚期表达基因序列L1及其编码的氨基酸序列,为HPV感染的检测和基因工程疫苗研制提供基础。方法采用PCR技术扩增了1例尖锐湿疣患者疣组织中HPV 11 L1基因,并对其进行了克隆及全序列分析。结果本例尖锐湿疣临床标本HPV 11 L1基因与GenBank收录的原型(收录号:M14119)比较有8个碱基变异。结论 中国地区尖锐湿疣HPV 11 L1基因存在着变异。     

男性尖锐湿疣患者疣体和手指人乳头瘤病毒6/11型DNA的检测

目的：确定男性尖锐湿疣患者疣体和手指人乳头瘤病毒6/11型的感染。方法：采用PCR荧光法对46例男性尖锐湿疣患者疣体和手指进行HPV6/11型核酸定性、定量检测,同时以20名无尖锐湿疣的男性手指作对照。结果：尖锐湿疣患者39例疣体(39/46＝84.78％)阳性,手指25例(25/46＝54.35％)阳性。无尖锐湿疣患者的手指仅2人阳性,差异有显著性意义( P<0.05)。 HPV6/11型疣体病毒载量为6.60×107±3.77×108,病毒载量与病程长短无相关性;尖锐湿疣患者的手指病毒载量为5.72×103±1.75×104,低于疣体的病毒载量(P<0.05)。结论：男性尖锐湿疣患者的手指携带HPV6/11型,其在尖锐湿疣的传播意义有待研究。     

Mapping of cytotoxic T lymphocytes epitopes in E7 antigen of human papillomavirus type 11

One of the critical steps in the progression to condyloma acuminatum (CA) is the establishment of a persistent human papillomavirus (HPV) infection, majority of HPV type 6 and 11. Cytotoxic T lymphocytes (CTL), which can be induced by the epitope-based peptides in vitro, are thought to be able to recognize and destroy virus-infected cells. In order to screen and identify HLA-A*0201 restricted HPV-11E7 CTL epitopes, five epitope peptides and tetramers were selected including HPV-11E7 7–15 (TLKDIVLDL), 15–23 (LQPPDPVGL), 47–55 (PLTQHYQIL), 81–89 (DLLLGTLNI) and 82–90 (LLLGTLNIV). Human monocyte-derived dendritic cells (DCs) from HLA-A*0201 healthy individuals were pulsed with these peptides to assess the expression of CD83, CD86, HLA-DR and the secretion of IL-12. The ability of peptide-loaded mature DCs to activate autologous T cells was evaluated by analyzing the frequency of specific tetramer⁺ CD8⁺ T cells using flow cytometry, and the level of IFN-γ secretion by ELISA. The ability of the epitope-specific CTLs to kill the target cells was also analysed. It was found that the immature DCs could be fully activated by all the five HPV-11E7 peptides and peptide-loaded mature DCs were able to stimulate the epitope-specific T cells in vitro. There was an increased frequency of CD8⁺ T cells specific for the E7 7–15 epitope when compared to other four predicted epitopes of HPV-11E7 (P < 0.05). The epitope-specific CTLs for E7 7–15 induced the strongest cytotoxicity to HPV-11E7 expressing cell line at an E:T ratio of 50:1 (P < 0.05). Taken together, these findings demonstrate that E7 7–15 (TLKDIVLDL) is an HLA-A*0201-restricted CTL epitope of HPV type 11. We propose that this epitope could be more helpful in the characterization of HPV control mechanism and be useful for the development of immunotherapeutic approaches for low-risk HPV infectious diseases such as CA. The abstract was accepted by 23rd HPV International Conference and by the American Academy of Dermatology Academy 2007.     

人乳头瘤病毒6b亚型L1重组质粒的构建及免疫原性分析

目的：构建人乳头瘤病毒(HPV)6b亚型L1的重组质粒．并了解其对小鼠的免疫原性。方法：将HPV6b的L1基因插入真核表达载体pcDNA3.1中，构建L1的重组质粒；答定后转染COS-7细胞，并用免疫印迹法进行表达分析；18只BALB/巾雌性小鼠用作重组质粒的免疫原性检测。结果：重组质粒可被内切酶EcoRI和BamHI切开，测序发现插入片段与L1基因一致；转染24h后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹出现了阳性条带；经PcDNA3.1-HPV6b L1免疫的小鼠可测到L1抗体(滴度为1：100)，IL-4水平明显升高。结论：HPV6b L1的重组质粒构建成功，能在真核细胞内表达，并能有效激发小鼠产生体液免疫和细胞免疫。     

人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

【摘要】 目的 构建人乳头状瘤病毒（HPV）16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞（KC）,为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法 两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞（HFK）,利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因,连续培养30代以上,筛选出永生化KC,分为3组：①空白对照组：传代2次的原代HFK;②实验组：传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7,感染细胞记录为A0代,感染后以传代次数记录（A1、A2……）;③阳性对照组：HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达,CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果 成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后,空白对照组细胞无荧光表达,连续传代后出现衰老表现,实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化,且荧光表达率为100%。与空白对照组相比,实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高（t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66;P值分别 < 0.001、 < 0.001、 = 0.001、 = 0.005）;与空白对照组相比,实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高（t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22;P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014）。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达,而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示,实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组（t值分别为6.49、7.55、9.43;P值分别为0.003、0.002、0.001）,而A1的增殖水平与空白对照组比较,差异无统计学意义（t = 2.40,P = 0.074）。Transwell Insert侵袭实验显示,A30不能穿过基底膜,SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤,组织学亦显示无肿瘤形成,裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论 通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞,可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。     

Human papillomavirus type 6/11 identified in an epidermoid cyst of the scrotum

To date, epidermoid cysts associated with human papillomavirus (HPV) infection have been described mainly in palmoplantar locations, and have involved HPV types 60 and 57. In contrast, HPV‐6/11 is a major cause of condyloma acuminatum. Here, we report the case of a healthy 31‐year‐old man who presented to our clinic with a 1‐month history of a 1‐cm, reddish‐brown, cystic scrotal tumor with a punctum. The lesion was studied histologically, immunohistochemically and by DNA–DNAin situ hybridization. Histology revealed an epidermoid cyst with vacuolated keratinocytes with shrunken nuclei (koilocytes) in the cyst wall. Immunostaining was positive for HPV antigens and in situ hybridization revealed HPV‐6/11 DNA in the koilocytes. This is the first report of an HPV‐6/11‐associated epidermoid cyst in the anogenital skin of an immunocompetent individual.     

Nonavalent human papillomavirus vaccination as alternative treatment for genital warts

Genital warts caused by the human papillomavirus (HPV) are the most common sexually transmitted disease and have a negative impact on quality of life. Of the more than 200 different types of HPV, low‐risk types 6 and 11 are mainly responsible for the development of condyloma acuminata. Despite a large arsenal of local therapies such as numerous topical agents, CO₂ laser ablation, and surgical removal, genital warts tend to be recalcitrant. HPV vaccination is mainly used as a preventive strategy to prevent genital warts, cervical cancer, and other anogenital cancers. However, in a few cases, HPV vaccination has been shown to be a good treatment alternative for patients with recalcitrant skin warts. Here we report five cases of recalcitrant genital warts that responded well to treatment with the nonavalent HPV vaccine. HPV vaccines could be beneficial as a noninvasive treatment alternative for recalcitrant genital warts.