用MRI体内观测钥孔嘁血蓝素中耳免疫诱导的内淋巴积水的初步探讨

目的用磁共振成像方法研究中耳免疫反应诱导的动物内淋巴积水.方法将9只豚鼠分为2组,中耳免疫组(4只)和磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)对照组(5只).先用KLH加福氏完全佐剂行四肢趾蹼免疫,2周后将KLH投放至中耳进行局部免疫.另外5只豚鼠中耳放置PBS作为对照组.用gadolinium增强的磁共振成像观察内耳淋巴液的动态变化,用耳蜗电图评估听功能改变.结果在KLH中耳免疫的动物中,2只发生内淋巴积水,3只血迷路屏障通透性增加,2只听力损失大于10dB.结论磁共振成像可以显示KLH中耳免疫反应的耳蜗改变,内淋巴积水和血迷路屏障通透性的增加提示存在着一个"漏的迷路",将有可能为内耳疾病的诊断提供更加精确的依据.     

氨甲喋呤在KLH诱导的豚鼠内耳炎症模型中的作用

目的 探讨使用免疫抑制methotrexate(MTX)直接进行内耳灌注是否可以减轻或抑制免疫反应介导的内耳炎症。方法 选健康Hartley豚鼠35只,随机分为4组,以钥孔戚血蓝素(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)作抗原(0.5mg/0.5ml)经皮下注射进行基础免疫。手术显微镜下进行乳突根治术,暴露耳蜗,选蜗底鼓阶做微孔(直径≤30μm),灌注KLH制作内耳迷路炎模型。实验耳灌注KLH,或MTX,或二者之混合物,对照耳灌注PBS。随机选11只豚鼠进行血清抗KLH抗体的ELISA检测。借助听脑干反应(auditory brainstem response,ABR)和内耳的组织形态学改变观察MTX肌肉注射与内耳灌注对KLH诱导的豚鼠内耳炎症模型的听力保护作用。结果 ABR及内耳组织学均支持KLH诱导的豚鼠内耳迷路炎模型;血清抗KLH抗体ELISA检测显示KLH免疫后血清相应的抗体升高;肌肉注射或内耳局部灌注MTX,均不能阻止或减轻KLH诱导的豚鼠内耳炎症。结论 本研究不支持免疫抑制剂MTX可减轻或阻止豚鼠内耳炎症。     

豚鼠耳蜗内淋巴囊免疫反应后可诱导一氧化氮合酶的表达

在豚鼠耳蜗内淋巴囊注入钥孔血蓝素 (KLH)之后 ,对豚鼠耳蜗内可诱导性一氧化氮合酶 (i NOS或NOS )进行了免疫组织化学研究。所选实验动物为体重约 35 0～ 4 0 0克的豚鼠 12只 ,均被证实耳廓反射阳性 ,并用显微镜观察排除了中耳炎疾患。将动物分成两组 ,实验组注射 KL H,对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。实验组内淋巴囊内注射 KLH后 ,每只动物耳蜗内均发生了形态学变化 ,主要是前庭膜发生了典型的结构变化。注射 KLH1天后发现在豚鼠耳蜗侧壁、螺旋器和螺旋神经节细胞都发生了 i NOS免疫反应 ,并且在耳蜗内均观察到增强的 i NOS表…     

抗淋巴细胞球蛋白在鼠内耳免疫损伤中的作用

目的研究抗淋巴细胞球蛋白(Antilymphocyte Globuli ALG)经内耳给药后能否改善豚鼠内耳免疫反应动物模型的免疫损伤。方法 24只清洁级健康Hartley豚鼠随机分为三组,即试验组、阳性对照组、阴性对照组(n=8),试验组、阳性对照组以钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin KLH)建立右耳免疫反应动物模型,阴性对照组右耳以PBS对照;建模后第3天试验组、阴性对照组予内耳注射兔抗鼠免疫球蛋白,阳性对照组予PBS对照。通过观察听性脑干反应(auditory brainstem response ABR)、外淋巴液抗KLH抗体,了解ALG对内耳异常免疫调节作用。结果造模后3天试验组及阳性对照组听力较阴性对照组有明显下降(p﹤0.05),ALG干预后1周,试验组听力较阳性对照组有明显改善(p﹤0.05),4周后与阴性对照组无明显差异(p﹥0.05);在KLH免疫后外淋巴抗KLH抗体升高,ALG可阻止或减轻抗KLH抗体在内耳的表达(p﹤0.05)。结论 ALG可阻止或减轻内耳异常免疫反应,对梅尼埃病等内耳病症有临床应用前景。     

豚鼠耳蜗内淋巴囊免疫反应后可诱导一氧化氮合酶的表达

在豚鼠耳蜗内淋巴囊注入钥孔(虫戚)血蓝素(KLH)之后，对豚鼠耳蜗内可诱导性一氧化氮合酶(iNOS或NOSⅡ)进行了免疫组织化学研究。所选实验动物为体重约350～400克的豚鼠12只，均被证实耳廓反射阳性，并用显微镜观察排除了中耳炎疾患。将动物分成两组，实验组注射KLH，对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。实验组内淋巴囊内注射KLH后，每只动物耳……     

自身免疫性感音神经性聋:初步实验研究

为比较由抗-Ⅱ型胶原抗体诱导和抗耳蜗抗体被动转移所产生的耳蜗改变,作者选用体重300～500g 的健康豚鼠30只进行实验。第一组(10只)为抗耳蜗组,肌注抗豚鼠耳蜗的免疫球蛋白;第二组(10只)系抗-Ⅱ型胶原组,肌注纯化鸡Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂的混悬液;第三组(10只)为对照组,在同样实验条件下不加任何免疫刺激。另用体重1.5Kg 的兔子3只致敏及获取抗豚鼠耳蜗的抗体,即向兔子注入豚鼠膜性耳蜗浸出液与弗氏佐剂混悬液,使之免疫化后,分离出血清中的免疫球蛋白。耳蜗功能藉脑干反应测听作评价,组织损     

核因子-κB p65在小鼠耳蜗中的表达

目的探讨核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)在耳蜗的表达情况。方法24只小鼠随机平均分为4组,其中2组分别连续3d和7d于皮下注射卡那霉素(kanamycin,KA),一组鼓室注射脂多糖(lipopolysac-charides LPS),另一组皮下注射等量生理盐水7d作为对照,用多克隆兔抗体NF-κB p65免疫组织化学等染色,观察NF-κB p65在小鼠耳蜗的表达。结果NF-κB p65主要定位在耳蜗的螺旋缘、盖膜、血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节和神经纤维。整个耳蜗各回均可观察到免疫反应,而螺旋韧带、盖膜、螺旋突、螺旋神经节和神经纤维均可观察到较强的NF-κB p65免疫反应,Corti器的免疫反应比上述结构要弱一些。Corti器的内、外毛细胞,内、外柱细胞,Deiter细胞和Claudious细胞均可观察到NF-κB p65的免疫反应,这些免疫反应在内沟细胞、Hensen细胞和Claudious细胞显示较弱,而在螺旋神经节较强,内、外毛细胞核未见免疫反应。省去一抗的对照染色未观察到NF-κB p65的阳性反应。用脂多糖和卡那霉素处理的小鼠耳蜗NF-κB p65的免疫反应与注射正常生理盐水的小鼠耳蜗有显著性差异,而注射脂多糖和卡那霉素3d和7d NF-κB p65的免疫反应无差异。结论注射脂多糖和卡那霉素可使NF-κB p65在耳蜗的表达增强。     

腺病毒载体-人神经营养素3基因治疗豚鼠耳蜗神经元损伤

目的在建立卡因酸(kainic acid,KA)致豚鼠耳蜗兴奋性传入神经元损伤动物模型的基础上,观察腺病毒载体携带的人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)基因在豚鼠耳蜗内的表达及对豚鼠耳蜗KA损伤后传入神经元的保护作用。方法20只健康白毛红目豚鼠随机分成3组。第1组(6只):经右耳蜗鼓阶一次性灌注KA(4 mmol/L,10μl),建立耳蜗兴奋性损伤动物模型,7 d后再经右鼓阶灌注腺病毒载体-人神经营养素3基因复合物(pAdeasy-NT3)10μl作为实验组(Ad-NT3组)。第2组(7只):经右耳鼓阶灌注KA(4 mmol/L,10μl)作为实验对照组(KA组)。第3组(7只):不做耳蜗灌注,作为空白对照组(Blank组)。Ad-NT3组和KA组均于KA处理后第20天处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞(传入神经元)的形态变化;空白对照组经相同的存活期后处死,观察Ⅰ型螺旋神经节细胞形态,作为正常对照。结果Ad-NT3组灌注pAdeasy-NT3后第13天,应用免疫组化法可检测到耳蜗内NT-3表达明显,其强度大于KA组;而且Ad-NT 3组耳蜗螺旋神经节细胞减少的数量低于KA组(P<0.001)。结论①豚鼠耳蜗兴奋性损伤后第7天局部应用重组腺病毒pAdeasy-NT3仍可减轻KA对耳蜗螺旋神经节细胞的损伤。②对基因治疗而言,在KA造成螺旋神经节细胞不可逆损伤之前有一段宝贵的治疗时机。     

豚鼠内耳手术对脑干诱发电位测定的影响

目的 探讨豚鼠内耳手术对脑干诱发电位(ABR)测定的影响。方法 Hartley系豚鼠，18只，体重250～300g。全麻后取耳后切口行鼓泡开放，暴露耳蜗。在手术显微镜下经耳蜗微孔(直径30μm)将不同的溶液PBS、钥孔戚血蓝素(Keyhole limpet hemocyanin，KLH)、氮甲喋呤(methotrexate，MTX)及20ml的MTX(10m1)和KLH(10m1)混合制剂分别导人鼓阶。按以下程序测定ABR，即第1天(系统免疫前)，手术前5min(第14天)，手术后5min及1周或2周。结果共测定18只36耳，其中32耳手术前后听力损失为0～5dB，4耳听力损失较为严重，(手术前后测定听力损失超过45dB)，且术后1周或2周未恢复；在听力损失较轻，手术前后测定听力损失小于20dB的另外4耳中，术后1周或2周ABR恢复至正常。结论为正确评估豚鼠ABR，除外手术对ABR测定的影响，内耳开窗术或任何其他有可能损伤耳蜗功能的操作，都应于操作结束后即刻测定ABR。     

高脂血症小鼠模型耳蜗中核因子-κB p65的表达

目的:探讨高脂血症对小鼠耳蜗的影响。方法:20只昆明种小鼠随机平均分为2组,其中1组建立高脂血症模型,另1组作为对照,6周后用多克隆兔抗NF-κB p65免疫组织化学染色,观察NF-κB p65在高脂血症小鼠耳蜗中的表达,并检测小鼠ABR反应阈。结果:在高脂血症小鼠耳蜗中,NF-κB p65主要定位在Corti器、盖膜、血管纹、螺旋韧带、螺旋神经节及其神经纤维,高脂血症小鼠耳蜗NF-κB p65的免疫反应与对照组比较显著增强。高脂血症模型组小鼠ABR反应阈与对照组比较明显增高,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:高脂血症可使小鼠耳蜗NF-κB p65表达增强,ABR反应阈增高,表明高脂血症可引起小鼠听力损害。     

当归补血汤对感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后细胞凋亡的影响

目的 探讨感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后干细胞凋亡的时程特点及当归补血汤的抗凋亡作用.方法 分离胚胎大鼠Cord器的耳蜗干细胞进行细胞培养,在相差显微镜下观察细胞形态及生长状况,用Nestin免疫荧光法进行耳蜗干细胞鉴定.建立感音神经性聋大鼠模型,将其分为耳蜗干细胞移植组(45只)、当归补血汤干预组(45只)及对照组(35只),分别将耳蜗干细胞悬液、含有当归补血汤的耳蜗干细胞悬液和生理盐水移植入三组大鼠耳蜗鼓阶,于移植后1、3、5、10、15天采用原位末端标记法结合流式细胞仪及免疫荧光方法 对三组动物干细胞凋亡情况进行定量分析.结果移植后1、3、5、10、15天耳蜗干细胞移植组的耳蜗干细胞凋亡率分别为27.84%、49.37%、44.78%、39.37%、34.82%,当归补血汤干预组分别为18.35%、26.92%、23.18%、21.38%、18.19%,细胞凋亡在移植后3～5天达到高峰;当归补血汤干预组各时间点凋亡率均明显低于耳蜗干细胞移植组(P<0.05).结论 感音神经性聋大鼠耳蜗干细胞移植后3～5天是干细胞凋亡的高峰期;当归补血汤具有抗移植耳蜗干细胞凋亡的作用.     

正常及慢性水杨酸钠作用后大鼠耳蜗总RNA的提取和产量

目的 探讨提取正常及慢性水杨酸钠作用的大鼠耳蜗总RNA的方法并测算其产量，为进一步研究提供实验数据。方法 22只健康Wistar大鼠随机分为两组，实验组12只进行2周的水杨酸钠肌肉注射，对照组10只不作处理。联用TRIzol和RNeary法分别抽取两组大鼠耳蜗的总RNA，用分光光度法和电泳测总RNA的产量和质量。结果 l0只正常组大鼠耳蜗得到总RNA7．82μg，12只长期水杨酸钠作用后的大鼠耳蜗得到总RNA4．82μg，两组平均产量不同，A260／A280值分别为2．05和2．08，提示RNA纯度高，电泳结果提示总RNA无降解。结论 两种方法合用提取总RNA的质量高，可满足后续实验要求。长期水杨酸钠作用后大鼠的耳蜗总RNA较正常大鼠耳蜗总RNA产量上有改变，进一步的研究可利用基因表达谱技术研究具体基因变化。     

不同听力检测方法甘油试验的结果比较

目的比较纯音测听甘油试验、耳蜗电图甘油试验、畸变产物耳声发射(DPOAE)甘油试验对梅尼埃病的诊断价值。方法选择63例梅尼埃病和63例非梅尼埃病眩晕患者,分为A、B、C三组,每组包括21例梅尼埃病患者和21例非梅尼埃病眩晕患者,在服用甘油前和服用甘油后1、2、3h分别观察三组患者纯音测听(A组)、耳蜗电图(B组)和DPOAE(C组)的变化,比较三组间甘油试验阳性率。结果 A组梅尼埃病患者纯音测听甘油试验阳性率最高为38.10%(18/21),B组耳蜗电图甘油试验阳性率最高为52.38%(11/21),C组DPOAE甘油试验阳性率最高为57.14%(12/21)。结论耳蜗电图和DPOAE的甘油试验较纯音测听的甘油试验更为准确,能在一定程度上提高对梅尼埃病的诊断率。     

地塞米松对尼莫地平致豚鼠血迷路屏障损伤的影响

目的研究地塞米松对豚鼠内耳缺血再灌注后应用尼莫地平致血迷路屏障损伤的影响。方法随机将豚鼠分为4组:地塞米松预处理再灌注应用尼莫地平组(A组)、再灌注应用尼莫地平及地塞米松组(B组)、再灌注应用尼莫地平组(C组)、再灌注对照组(D组)。采用小脑前下动脉FeCl3诱导血栓形成制备耳蜗缺血豚鼠模型,缺血1小时后再经股静脉给予尿激酶溶解血栓制备再灌注模型。实验过程中采用激光多普勒血流测量仪监测耳蜗血流量,实验前后测量豚鼠听性脑干反应Ⅲ波反应阈值。分别在股静脉推注伊文思蓝(Evaan'sBlue,EB)2小时后采用荧光定量检测其血迷路屏障通透性变化。结果耳蜗发生再灌注后应用尼莫地平组与再灌注对照组,EB通过血迷路屏障的量分别为每只(0.963±0.261)μg和(0.620±0.148)μg,t检验P<0.05,地塞米松预处理再灌注应用尼莫地平组与再灌注应用尼莫地平及地塞米松组,EB通过血迷路屏障的量分别为每只(0.619±0.212)μg和(0.859±0.228)μg。结论内耳缺血早期使用地塞米松,能减轻血迷路屏障再灌注后尼莫地平引起的急性高灌注所致继发损伤。     

L-型钙通道阻滞药尼福地平对耳蜗功能的影响

目的　探讨L -型钙通道阻滞药尼福地平对豚鼠耳蜗功能的影响。方法　 4 6只健康杂色豚鼠随机分为四组 ,分别全耳蜗灌注含 0 .15、0 .5、3μmol L尼福地平的人工外淋巴液及不含尼福地平的人工外淋巴液 (对照组 ) ,灌流前及灌流 12 0min后圆窗记录耳蜗微音电位 (cochlearmicrophonics ,CM)和耳蜗听神经复合动作电位 (com poundactionpotential,CAP)。比较各组相同时间点的CM振幅和CAP阈值。结果　人工外淋巴液组 (对照组 )灌流后CAP阈值无改变 (P >0 .0 5 ) ,其余组灌流后CAP阈值均升高 (P <0 .0 5 ) ,并随浓度增加阈移增大。灌流后各组CM振幅与 10 0dB声强度时CM振幅比较的相对振幅均下降 ,随浓度增加CM振幅下降更明显。 6只灌流 3μmol L尼福地平的豚鼠 30min后CAP阈值升高 ,CM振幅下降 ,改为单纯人工外淋巴液灌流 90min后 ,CAP阈值及CM振幅有部分恢复。结论　尼福地平对耳蜗功能有抑制作用且有剂量依赖性和部分可逆性 ,间接证明耳蜗毛细胞上存在L-型Ca2 + 通道     

耳蜗死区与言语分辨率相关性研究

目的本研究采用阈值均衡噪声检测法探索感音神经性聋患者中耳蜗死区的存在情况,并通过言语测听分析患者在言语分辨能力上是否有差异。方法采用阈值均衡噪声检测法及言语测听检测62例(93耳)感音神经性聋患者,对其进行耳蜗死区与言语分辨率相关性分析。结果62例(93耳)患者中,无耳蜗死区组(NDR)47耳,有耳蜗死区46耳,其中有一个或两个频率存在耳蜗死区组(SDR)有27耳,有3个或3个以上频率存在耳蜗死区组(LDR)有19耳;NDR组、SDR组和LDR组各测试频率平均纯音听阈分别为65.74±11.07d B、64.70±7.03d B、75.57±15.04d B。NDR组、SDR组、LDR组平均言语分辨率(WRS)分别为91.98±3.42%,88.93±2.79%,62.21±10.39%,经统计学检验,三组之间两两比较差异均有统计学意义。结论存在多个耳蜗死区组的纯音听阈较无耳蜗死区组升高,且该组言语分辨率明显低于无耳蜗死区组,推测耳蜗死区是影响言语分辨能力的一个重要因素。     

丁酸钠对庆大霉素耳聋保护的体内研究

目的通过动物实验验证组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠是否可以保护耳蜗毛细胞免受庆大霉素引起的耳毒性损害。方法 10只听力正常豚鼠被用于本实验。向每只动物右耳的圆窗龛放置小块明胶海绵(0.3mm3)并注入10μl丁酸钠(100mg/ml)溶液,左耳圆窗龛内置放的明胶海绵则注入10μl人工外淋巴液作为对照。手术后第三天开始按照每公斤体重200mg的剂量每天一次性对豚鼠肌肉注射庆大霉素,连续用药5天。在停药后第3天检测听性脑干诱发电位,常规制备全耳蜗基底膜铺片结合鬼笔环肽染色,对全耳蜗毛细胞进行计数并制备全耳蜗毛细胞图。结果圆窗龛置放丁酸钠溶液组的听性脑干诱发电位阈值比圆窗龛置放外淋巴液组低,两组资料相比有显著性统计学差异(P<0.01),圆窗龛置放丁酸钠溶液组的耳蜗毛细胞缺失程度比圆窗龛置放外淋巴液组轻。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对庆大霉素导致的豚鼠耳聋和耳蜗损害具有一定的保护作用。     

狼蛛毒素在胆红素诱导的耳神经毒性中作用的实验研究

目的 观察狼蛛毒素(psalmotoxin-1)对胆红素诱导的耳蜗组织毒性作用.方法 新生3 d的SD大鼠,断头解剖获得耳蜗基底膜离体培养24 h,将耳蜗组织随机分5个组,对照组、50μmol/L胆红素组、100μmol/L胆红素组、100 ng/ml psalmotoxin-1组和100μmol/L胆红素+100 n...     

内耳免疫反应中细胞凋亡及Caspase-3动态表达的研究

目的:研究内耳免疫反应过程中是否存在细胞凋亡,以及细胞凋亡是否与Caspase3信号转导有关。方法:选用雌性白色豚鼠45只,随机分为实验组29只,对照组16只,以钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)全身免疫后,实验组以相同抗原进行内耳免疫,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS),分别在内耳免疫术后1、3、5、7d和14d后处死动物,于免疫前及处死前行双侧听性脑干反应(ABR)测试。取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测内耳凋亡细胞,免疫组织化学检测内耳Caspase3的表达。结果:实验组豚鼠内耳免疫前、后反应阈比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01);对照组给药前、后比较反应阈无明显变化。实验组豚鼠内耳均存在TUNEL染色阳性细胞,并且TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征,而对照组仅在支持细胞、血管纹和螺旋神经节细胞中发现极少数TUNEL染色阳性细胞。Caspase3免疫组织化学染色实验组内耳从内耳免疫后5d开始出现阳性表达,而对照组表达阴性。结论:内耳免疫反应可以诱导细胞凋亡的发生;内耳免疫反应诱导细胞凋亡的发生中有Caspase3的激活。     

内耳注射药物建立新生鼠耳聋动物模型

目的通过纳升级微量注射泵内耳注射给药的实验方法,建立新生鼠耳聋动物模型。方法 42只出生第二天新生鼠,分别以注射速度分组:单纯穿刺组(对照组,6只,仅穿刺耳蜗底回侧壁,不注射液体)、蒸馏水1组(H2O 20组,4只,20nl/min)、蒸馏水2组(H2O 60组,3只,60nl/min)及药物浓度分组(新霉素各组给药速度为60nl/min):新霉素1组(Neo1组,4只,1μmol/ml)、新霉素2组(Neo10组,4只,10μmol/ml)、新霉素3组Neo 50组,5只,50μmol/ml)、新霉素4组(Neo 100组,8只,100μmol/ml)及新霉素5组(Neo 50 1组,8只,50μmol/ml)。各组均采用耳蜗底回微创打孔技术,利用纳升级微量注射泵按上述各组用药、剂量及给药速度进行内耳药物注射。术后1天(Neo 50 1组)及3天(其余各组)采用基底膜免疫荧光染色观察内耳毛细胞及支持细胞的形态改变。结果术后新生鼠存活好,伤口恢复优良。耳蜗毛细胞机械性损伤与注射速度呈正相关,术后3天,H2O 20组和H2O 60组注射区域内、外毛细胞略减少,差异无统计学意义(P>0.05)。毛细胞损伤与新霉素浓度呈正相关,与对照组比较,术后3天Neo1组的外毛细胞数量及Neo10、50、100组内、外毛细胞数量均明显减少(P<0.05)。与H2O 60组比较,术后3天Neo50及Neo100组内、外毛细胞数量均明显减少(P<0.05)。新霉素50μmol/ml注射后1天(Neo 50 1组)与3天(Neo 50组)内、外毛细胞数量差异无统计学意义(P>0.05)。新霉素50μmol/ml注射后3天免疫荧光染色示支持细胞形态良好。结论利用纳升级微量注射泵给药方式注射50μmol/ml新霉素200纳升至内耳,可建立新生鼠耳聋动物模型,具有毛细胞死亡率高,致聋效果显著的优点;而支持细胞保留较好,且动物存活率高。