应用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶的活性

目的:利用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶,并分析其活性。方法:实验于2004-05/11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。将编码大鼠胰岛素降解酶的cDNA插入质粒pGEX-4T-1并转化大肠杆菌BL21,使其表达谷胱甘肽巯基转移酶为标签的融合蛋白质。凝血酶定点分解融合蛋白,用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲合层析方法纯化基因重组胰岛素降解酶。重组胰岛素降解酶的活性应用高压液相色谱进行判断。结果:①胰岛素降解酶cDNA编码区片段的亚克隆:重组质粒亚克隆的cDNA片段为3060bp,编码1019个氨基酸。②胰岛素降解酶在原核细胞的表达与纯化:重组质粒pGEX-rIDE在原核细胞中表达为可溶性组分,培养菌液可收获目的基因重组酶约0.5mg/L,纯化的胰岛素降解酶在SDS-PAGE上表现为单一条带,其表观相对分子质量为110000,与野生型酶相同。③基因重组蛋白质对胰岛素的降解作用:牛胰岛素与基因重组蛋白质的洗脱峰分别出现在34.5和38.3min,将纯化的重组蛋白与胰岛素在37℃下共同孵育后,胰岛素含量明显减少。孵育的最初20min质量变化明显,其峰面积值减少了约50%,但其余时间降解不明显。该蛋白质对14-3-3蛋白的两个亚型没有降解作用。结论:基因重组rIDE具有天然酶的活性,但该活性在孵育20min后胰岛素降解延缓,可能是胰岛素的降解产物反馈抑制了rIDE活性,与酶的自身调节有关。本实验制备了具有生物学活性的基因重组型大鼠胰岛素降解酶,为进一步制备抗胰岛素降解酶单克隆抗体以及探讨胰岛素降解酶与2型糖尿病发生之间的关系打下了基础。     

应用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶的活性

目的：利用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶,并分析其活性.方法：实验于2004-05/11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成.将编码大鼠胰岛素降解酶的cDNA插入质粒pGEX-4T-1并转化大肠杆菌BL21,使其表达谷胱甘肽巯基转移酶为标签的融合蛋白质.凝血酶定点分解融合蛋白,用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲合层析方法纯化基因重组胰岛素降解酶.重组胰岛素降解酶的活性应用高压液相色谱进行判断.结果：[1]胰岛素降解酶cDNA编码区片段的亚克隆：重组质粒亚克隆的cDNA片段为3 060 bp,编码1 019个氨基酸.[2]胰岛素降解酶在原核细胞的表达与纯化：重组质粒pGEX-rIDE在原核细胞中表达为可溶性组分,培养菌液可收获目的基因重组酶约0.5 mg/L,纯化的胰岛素降解酶在SDS-PAGE上表现为单一条带,其表观相对分子质量为110 000,与野生型酶相同.[3]基因重组蛋白质对胰岛素的降解作用：牛胰岛素与基因重组蛋白质的洗脱峰分别出现在34.5和38.3 min,将纯化的重组蛋白与胰岛素在37℃下共同孵育后,胰岛素含量明显减少.孵育的最初20 min质量变化明显,其峰面积值减少了约50%,但其余时间降解不明显.该蛋白质对14-3-3蛋白的两个亚型没有降解作用.结论：基因重组rIDE具有天然酶的活性,但该活性在孵育20 min后胰岛素降解延缓,可能是胰岛素的降解产物反馈抑制了rIDE活性,与酶的自身调节有关.本实验制备了具有生物学活性的基因重组型大鼠胰岛素降解酶,为进一步制备抗胰岛素降解酶单克隆抗体以及探讨胰岛素降解酶与2型糖尿病发生之间的关系打下了基础.     

重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵

背景:胰岛素样生长因子1是人体内重要的细胞调控因子,已用于治疗糖尿病等多种疾病,工程菌发酵生产工艺研究是胰岛素样生长因子1实现产业化从而扩大临床应用的关键因素.目的:探讨表达重组人胰岛素样生长因子1工程菌的高密度发酵与表达条件.设计、时间及地点:酶基因工程实验,于2007-05/2008-05在浙江树人大学生物技术实验室完成.材料:重组人胰岛素样生长因子1大肠杆菌表达菌株E. coil BL21(DE3)/pET22a-IGF-1由浙江树人大学生物技术实验室保存.高密度发酵补料培养基为:葡萄糖300 g/L,蛋白胨40 g/L,酵母粉10 g/L,Na2HPO4280 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 120 mmol/L,MgSO4 10 mmol/L,氨苄青霉素100 mg/L.方法:菌株活化后,进行摇瓶发酵试验,分别改变培养基种类、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导时间等参数,优化摇瓶发酵条件.依据摇瓶发酵优化条件,采用自控5 L发酵罐进行分批补料发酵试验.培养分分批培养和分批补料2个阶段.采用pH反馈流加的方式补料,在对数生长中后期开始诱导,加入异丙基硫代半乳糖苷至设计终浓度,培养4-6 h.主要观察指标:重组人胰岛素样生长因子1工程菌的发酵与产物表达情况.菌体浓度与菌体干重测定,目的蛋白表达量的测定,发酵液葡萄糖浓度的测定.结果:以2×YT+5 g/L葡萄糖为发酵培养基.经0.8 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷诱导5 h,通过控制溶解氧以及pH反馈补料方式,实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每升发酵液收获干菌体50.1 g/L,重组人胰岛素样生长因子1含量达5.25 g/L.结论:实验成功建立了重组人胰岛素样生长因子1工程菌优化的高密度发酵工艺,为重组人胰岛素样生长因子1的卜游纯化和工业化生产奠定了基础.     

脑钠肽重组蛋白的表达及生物学活性的研究

目的 比较脑钠肽(BNP)连接在不同载体中表达的BNP成熟肽蛋白和BNP前体蛋白的生物学活性差别.方法 采用分子生物学技术构建重组质粒PGEX-20T-BNP32,PGEX-20T-BNP108,B11-BNP32和B11-BNP108,分别对其进行PCR、双酶切和测序鉴定,然后将已测序鉴定的包含四种重组质粒的工程菌,转化至大肠埃希菌BL21菌中表达BNP成熟肽蛋白和BNP前体蛋白,并用ELISA法检测4种蛋白的生物学活性作用.结果 在大肠埃希菌中表达的成熟肽蛋白BNP32和前体蛋白BNP108经过纯化、复性后具有生物学活性.结论 PGEX-20T-BNP32表达的成熟肽蛋白BNP32的生物学活性最强,为下一步单抗制备的优势蛋白.     

重组exendin-4类似物EW的制备及其体内降糖活性分析

目的:探讨重组exendin-4类似物EW的基因工程制备方法及纯化后的体内降糖活性.方法:设计引物并以PCR法扩增EW基因,其N-端具有胰蛋白酶的酶切位点,C-端具有终止密码子,通过串联的方式在大肠杆菌JM109中高效表达.包涵体纯化后,通过胰蛋白酶对融合蛋白进行酶解,继而纯化,获得重组EW.测定腹腔内注射EW、exendin-4及0.9％氯化钠溶液后C57BL/6小鼠体内血糖情况.结果:将串联8个EW拷贝后的8EW基因在大肠杆菌中表达,获得的包涵体经过增溶保护后以胰蛋白酶酶切获得EW,重组EW的收率为200～250 mg/L发酵液.纯化冷冻干燥后的EW在C57BL/6小鼠体内降糖活性与exendin-4相当.结论:基因工程制备的EW是一种很有前景的抗糖尿病药物.     

化脓性链球菌凝集试验分型悬液的制备

A族化脓性链球菌分型有几种方法,包括以T 抗原为依据的凝集试验及利用M蛋白的沉淀反应等.作玻片凝集试验,制各稳定均匀的链球菌悬液常有困难.作者将在含胰蛋白酶肉汤中生长的细菌,与肉汤培养后再加胰蛋白酶培养的(标准法培养的)细菌作了T分型比较.作者用的胰蛋白酶是将10%的胰蛋白酶溶液置pH7.8的0.1M/L磷酸盐缓冲液中,过滤除菌后贮存于-20℃.测定胰蛋白酶的水解蛋白活性是将其     

白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1 319P的原核表达和鉴定

摘要：目的:制备白念珠菌烯醇化酶N端基因重组肽段ENO1-319P并检测其抗原性。 方法:选择与人烯醇化酶蛋白α-ENO同源性低的白念珠菌烯醇化酶肽段ENO1-319P,将其编码DNA序列克隆到表达载体pET28a(+),并在大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导带有His标签的重组肽段的表达。用SDS-PAGE电泳分析,TALON金属亲和层析柱纯化重组蛋白,其抗原性用侵袭性白念珠菌感染（ICAI）患者血清进行western blot评估。 结果:成功表达并纯化了目的肽段,该蛋白可与ICAI患者血清发生特异性反应。 结论:获得了白念珠菌烯醇化酶N端肽段ENO1-319P的基因表达工程菌株,为将此重组肽段用于制备特异性更高的抗体打下基础。     

脑钠肽前体及氨基末端脑钠肽前体基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中表达脑钠肽前体(proBNP)及氨基末端前体蛋白(NT-proBNP)。方法采用分子生物学技术构建重组质粒PGEX-20T-proBNP和PGEX-20T-NT-proBNP,分别对其进行PCR、双酶切和测序鉴定,然后将已测序鉴定的包含两种重组质粒的工程菌,转化至大肠杆菌BL21菌中表达脑钠肽前体及氨基末端前体蛋白,并用Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。结果在大肠杆菌中成功的表达脑钠肽前体及氨基末端前体蛋白,两种蛋白均以可溶性形式表达,更有利于保存其生物学活性。结论两种蛋白的成功表达将有利于后续的单抗制备及检测试剂盒的开发奠定基础。     

生物信息学分析CysC特异性肽段及质谱验证

目的用生物信息学技术分析半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)的特异性肽段及其性质,并用质谱技术验证预测结果。方法用在线软件工具分析胰蛋白酶水解Cys C产生的肽段和同源性,预测特异性肽段质谱扫描离子化碎片信息;对人工合成的特异性多肽样品进行母离子扫描和子离子扫描,人重组Cys C和血清样品经胰蛋白酶水解后分析质谱,比较分析结果与预测结果。结果选择T3(ALDFAVGEYNK)肽段作为Cys C的特异性肽段,用串联质谱对T3样品[M+2H]~(2+)进行子离子扫描,几乎可发现Skyline软件预测的所有b离子和y离子。人重组Cys C和血清样品经胰蛋白酶水解出的肽段与T3*在同一时间出峰。结论用生物信息学技术快速准确地筛选出了Cys C特异性肽段并准确预测该肽段质谱扫描离子化碎片。     

新型生物材料聚丁二酸丁二醇酯体外水解性能

背景: 聚丁二酸丁二醇酯类聚酯是一种新型脂肪族聚酯,因其具有良好的生物降解性、优异的力学性能和成型加工性而倍受青睐,是一种潜在的组织工程支架材料和缓释药物载体材料.目的: 验证新型可降解脂肪族聚酯聚丁二酸丁二醇酯的体外降解行为.设计、时间及地点: 单一样本观察,于2007-06/11在中科院理化所工程塑料国家工程研究中心完成.材料: 聚丁二酸丁二醇酯由丁二酸和丁二醇通过熔融缩聚制备,粗产品用氯仿溶解后乙醇沉淀提纯,60℃真空干燥48h后备用.方法: 用平板硫化机将样品压制成100μm薄膜,然后裁成1cm×1cm的小片.在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中进行体外水解实验.主要观察指标: 分析聚丁二酸丁二醇酯的质量、分子量、pH值和表面形态的变化.结果: ①聚丁二酸丁二醇酯薄膜在磷酸缓冲溶液中发生降解,降解基本分为两个阶段.0～9周为降解停滞阶段,质量基本保持不变,9～15周加速降解阶段,15周的质量保持率为46%.降解实验中分子量的直线下降,没有停滞阶段.②降解过程中产生的酸性物质导致缓冲溶液pH值有一定的升高,介于6.0～8.0之间.③聚丁二酸丁二醇酯薄膜表面首先变得粗糙,出现很多小裂纹.降解12周后,样品的表面均出现裂缝,随着降解时间的裂缝的数量增加、缝隙变大,降解15周后,样品的裂缝进一步加大,变多,与典型的本体降解特征一致.结论: 聚丁二酸丁二醇酯在模拟体液的磷酸缓冲溶液中可以发生降解,降解行为分为停滞阶段和加速降解阶段,降解中产生酸性物质.