Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

免疫固定电泳检测M蛋白

免疫固定电泳(Immunofixation)是免疫电泳的简化形式,它由蛋白的电泳相和特异抗血清沉淀蛋白的固定相组成。即以区带电泳分离蛋白以后,立即将抗血清或浸有抗血清的薄膜条直接放到预计出现异常蛋白的位置上面,使其产生抗原-抗体复合物的沉淀反应,是一种检测特殊蛋白的简单、经济、快速的操作方法。此操作首先由Alper等提出,以后经chang等、Ritchie等多     

M蛋白的临床意义及检测原则

<正> M蛋白是B淋巴细胞或浆细胞单克隆增殖,产生大量在类别、亚类型、亚型、基因型和独特型相同的均一免疫球蛋白,这种蛋白质的氨基酸排列顺序、空间构象、电泳特征皆相同。M蛋白表现在血液中而成M蛋白血症。临床上分为恶性M蛋白血症和意义不明两大类。恶性M蛋白血症见于:多发性骨瘤、巨球蛋白血症、重链病、半分子病和不完全骨瘤蛋白病;意义不明     

P^16蛋白在肺癌中的表达及其意义

目的 探讨P^16基因与肺癌发生、发展的关系。方法 采用免疫组化技术检测肺癌组织中P^16蛋白的存在情况。分析P^16基因的失活情况。结果 32例肺癌组织中P^16蛋白表达的缺失率达到40．6％，明显高于正常对照组（P＜0．05）。结论 P^16蛋白的缺失表达与肺癌的发生、发展密切相关，抑癌基因P^16的遗传改变是导致肺癌发生、发展的重要生物学因素之一。     

弓形虫棒状体蛋白7真核表达载体的构建及其免疫保护作用

目的 构建弓形虫棒状体蛋白7(ROP7)基因的真核重组表达载体,观察其对小鼠的免疫保护作用.方法 根据GenBank发表的弓形虫ROP7序列设计合成一对引物,通过PCR扩增ROP7基因,将其插入真核表达载体pEGFP-C1中构建重组质粒pEGFP-C1/ROP7(pROP7).用重组质粒转染HEK293T细胞并验证其在细胞内的表达.将36只雌性BALB/c小鼠随机分为3组:磷酸缓冲盐溶液(PBS)对照组、pEGFP-C1对照组和pROP7实验组.然后用PBS、pEGFP-C1和pROP7分别免疫相应组别的小鼠.采用ELISA检测小鼠血清特异IgG水平,观察弓形虫感染小鼠后的存活时间并评价其免疫保护力.结果 PCR扩增出1 728 bp的目的基因片段,真核表达载体构建成功,且能在HEK293T细胞中表达.目的基因的相应蛋白可被羊抗弓形虫多克隆抗体识别.重组质粒免疫的小鼠产生了较高水平的血清抗体.虫体攻击试验中,pROP7实验组小鼠的生存时间较对照组小鼠延长(P< 0.05).结论 本研究构建的真核表达质粒在对抗弓形虫感染时具有一定的免疫保护作用,为弓形虫基因疫苗的研制提供了参考.     

M蛋白的鉴定及实验分析

M蛋白（骨髓瘤蛋白）细胞大量增殖产生的具有相同氨基酸顺序和蛋白质结构的免疫球蛋白（Ig）分子或其片段，临床上常见于多发性骨髓瘤（MM）、原发性巨球蛋白血症、重链病、原发性淀粉样变性、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症等淋巴细胞或浆细胞克隆增殖性疾病。M蛋白是单克隆免疫球蛋白的缩写，也称副蛋白、骨髓瘤蛋白、M成分。对此病只有采取较好实验室方法与正确实验分析相结合，才能为临床提供可靠依据。     

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

目的:HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的"金标准"。因此本实验构建gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。方法:选定HIV-1 gp160基因中三个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这三个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western Blot测定融合蛋白的抗原特异性。结果:构建的HIV-1 gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。结论:应用western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1 gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达HIV-1 gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。     

大肠癌组织p16蛋白的表达及其意义

研究抑癌基因ｐ１６与大肠癌发生发展的关系,方法：采用免疫组织化学ＡＢＣ法检测了３１例结肠癌,２２例直肠癌,２８例正常大肠组织中抑癌基因ｐ１６的表达情况。结果：正常大肠组织和大肠癌组织中ｐ１６蛋白的阳性率分别为７５％和３５．７％;ｐ１６蛋白表达随着肿瘤组发程度降低而减弱,阳性表达率有显著性差异。     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

SARS冠状病毒M蛋白B细胞抗原表位的原核表达与抗原活性检测

目的从SARS冠状病毒M蛋白的线性重叠肽链文库中筛选出5个B细胞抗原表位,通过构建原核表达载体,表达抗原表位融合蛋白,并检测其抗原活性.方法应用大肠杆菌高频密码子设计引物,通过PCR方法合成编码SARS冠状病毒M蛋白5个抗原表位(MKY1、MKY2、MKY3、MKY4和MKY5)的DNA片段,经克隆和测序分析,亚克隆至表达载体pET-CKS,转化大肠杆菌BL21;阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析;大量诱导表达抗原表位融合蛋白,亲和层析予以纯化;Western检测SARS病人阳性血清对融合蛋白的识别.结果成功构建SARS冠状病毒M蛋白抗原表位的表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,融合蛋白表达量达到细菌总蛋白30%,经亲和层析纯化,融合蛋白可被SARS病人抗血清识别.结论原核表达的抗原表位融合蛋白具有良好的抗原活性,为下一步进行SARS冠状病毒诊断试剂盒的开发研究奠定基础.     

Gi蛋白真核表达载体的构建及表达检测

目的:克隆抑制腺苷酸环化酶G蛋白(Gi蛋白)3个亚基α、β和γ基因,构建pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,完成其在真核细胞中的表达检测.方法:培养肝癌细胞HepG2,提取总RNA后反转录成cDNA,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增α、β和γ的编码基因,在α亚基两端添加酶切位点,在β和γ亚基两端分别添加酶切位点和连接肽,经酶切和连接得到Giα1和Giβ1-γ2,再将Giα1和Giβ1-γ2基因分别构建到荧光蛋白报告载体pEYFP-N1和pECFP-C1中,利用脂质体法将真核表达载体转染到肝癌细胞中,激光共聚焦显微镜观察分析其表达活性.结果:PCR扩增获得Gi蛋白α、β和γ亚基的编码基因,在两端添加酶切位点和连接肽后获得的Giα1和Giβ1-γ2基因,成功构建了pEYFP-N-Giα1和pECFP-C-Giβ1-γ2真核表达载体,并在肝癌细胞中实现其真核细胞表达.结论:成功构建Gi蛋白的真核表达载体,并鉴定其在活细胞中具有表达活性.     

基于基因免疫的抗HBV M蛋白单克隆抗体的制

目的 以基因免疫制备抗乙型肝炎病毒M蛋白的单克隆抗体。方法 构建表达M蛋白的重组质粒pcDNA3-PreS2／S，免疫雌性BALB／c小鼠，以杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果 目的基因片段PreS2／S(875bp)正确插入质粒pcDNA3，重组质粒转染细胞上清、基因注射肌肉、脾脏局部均可检测到M蛋白表达。免疫小鼠后以杂交瘤技术获得了一株分泌抗HBVM蛋白的杂交瘤细胞株2D3。结论 证实了基因免疫可用于制备抗乙型肝炎病毒M蛋白单克隆抗体。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建

目的：构建含绿色荧光蛋白（GFP）基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体。方法：将人疱疹病毒8型（HHV－8）K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点，构建重组质粒pCR-K12；PCR扩增GFP基因，将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中，获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果：重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果，此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论：重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功，为研究K12的生物学活性及春作用机制打下基础。     

GFP-hDaxx融合蛋白在真核细胞中的表达与鉴定

目的：构建GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP/hDAXX，并在HeLa细胞中表达，为进一步研究hDaxx在细胞凋亡、病毒感染中的作用提供实验基础。方法:用T4DNA连接酶将hDaxx亚克隆入载体pEGFP，筛选阳性克隆。将质粒pEGFP／hDaxx转染HeLa细胞，Western-Blotting鉴定表达产物，荧光显微镜观察GFP-hDaxx融合蛋白在细胞内的定位。结果：成功构建了GFP-hDaxx融合蛋白真核表达载体pEGFP／hDaxx，GFP-hDaxx融合蛋白成功表达并定位HeLa细胞核。结论:GFP-hDaxx融合蛋白成功地在真核细胞表达并定位于细胞核。     

SARS冠状病毒M基因在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性初步研究

【目的】在大肠杆菌中表达SARS冠状病毒包膜(M)蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,并对其进行血清学鉴定。【方法】克隆编码SARS冠状病毒M蛋白的基因,并在原核系统中表达GST-M融合蛋白,用Westernblot和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析GST-M融合蛋白。【结果】10份SARS患者恢复期血清均能识别M-GST融合蛋白,并在Mr=52000附近出现特异性结合带;而10份正常人血清不与M-GST融合蛋白起反应。【结论】本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白,它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应,为研究SARS冠状病毒感染宿主细胞的过程和制备重组疫苗提供了条件。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）X基因的真核表达载体，为探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系提供实验依据。方法用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对pcDNA3．1（＋）载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并对其进行双酶切和测序鉴定，构建HBVX基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx。用梭华-Sofast^TM基因转染试剂将其质粒转染THP-1巨噬细胞，细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后做Western blotting，鉴定目的蛋白。结果双酶切pcDNA3．1（＋）-HBx后，琼脂糖电泳可分别见到大小约为5．4kb和465bp片断，说明X亚克隆入pcDNA3．1（＋），经序列测定其含有完整的X基因片段；Western blotting结果显示pcDNA3．1（＋）-HBx能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx，并能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。