针对表皮生长因子受体基因RNA干扰质粒表达载体的构建

目的:表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶跨膜受体,人类的多种恶性肿瘤的发生与表皮生长因子受体过度表达有关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。在哺乳动物细胞中,RNA干扰是通过与目的基因特异互补的21-23个硷基的小双链RNA来抑制该基因的表达。有研究表明表达小发夹RNA的载体能诱导产生更好的RNA干扰效果。本实验通过向pSIREN-Shuttle质粒插入一段可被转录成小发夹RNA的双链寡核苷酸序列(其中含有于EGFR基因序列相同的19nt序列)重构了RNAi质粒表达载体。通过细胞转染评价该载体对人鼻咽癌细胞株(HNE1)EGFR基因的mRNA表达抑制效果。结果显示HNE1细胞的EGFR基因mRNA被明显抑制。提示shRNA质粒表达载体介导对EGFR基因的RNA干扰可能是鼻咽癌干预治疗的一种有效手段。     

层黏素受体靶向RNA干扰质粒载体的构建

目的 构建层黏素受体RNA干扰质粒,为探讨抑制层黏素受体过表达在胆管癌免疫逃逸中的作用奠定基础.方法 PCR法获得U6启动子序列以及产生siRNA的相应DNA模板序列,将其克隆入pGenesil-3获得RNA干扰载体pGenesil-shLNR.脂质体法将pGenesil-shLNR导入胆管癌细胞QBC939,免疫组化法检测对胆管癌细胞QBC939LNR表达的抑制情况.结果 所构建的载体pGenesil-shLNR能够干扰QBC939细胞中LNR的表达,并且具有新霉素抗性,能够用G-418筛选稳定转化的细胞株.结论 成功构建了抑制胆管癌细胞QBC939表达LNR的RNA干扰质粒载体.     

RNA干扰抑制DLL4基因表达对人血管内皮细胞增殖的影响

背景：Delta—like4（DLL4）是近年新发现的血管生长调控因子,研究表明抑制DLL4可导致过度无效的血管生成。目的：研究RNA干扰抑制DLL4基因表达对人血管内皮细胞增殖的影响。设计、时间及地点：随机分组,对比观察,于2007—07／2008—09在南昌大学医学院和江西省医学生物高技术重点实验室完成。材料：人微血管内皮细胞由上海细胞生物和生物化学研究所提供。方法：设计和化学合成靶向DLL4基因的siRNA序列,lepofectamine^TM2000介导DLL4 siRNA转染人微血管内皮细胞。提取细胞总RNA,进行反转录一聚合酶链反应扩增,琼脂糖电泳检测DLL4mRNA。提取细胞总蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。采用四甲基偶氮唑盐法检测DLL4 siRNA对人微血管内皮细胞增殖的影响,实验分4组：①85nmol／LDLL4 siRNA—duplex组。②85nmol／LDLL4 siRNA-scrambled阴性对照组。⑧lepofectamine组。④未经处理组。主要观察指标：RNA干扰后,人微血管内皮细胞DLL4的转录和蛋白表达及人微血管内皮细胞的增殖。结果：反转录聚合酶链反应和Western blot实验结果显示,人微血管内皮细胞转录DLL4和表达DLL4蛋白;85nmoIILDLL4 siRNA完全抑制人微血管内皮细胞DLL4转录和DLL4蛋白的表达。DLL4sIRNA抑制人微血管内皮细胞DLL4表达的有效浓度为85nmol／L。四甲基偶氮唑盐实验结果显示,85nmol／LDLL4 siRNA-duplex组的细胞增殖率为190．00％,未经处理组的细胞增殖率为110．00％。结论：人微血管内皮细胞表达DLL4,DLL4 siRNA抑制人微血管内皮细胞表达DLL4并促进人微血管内皮细胞增殖,DLL4对人微血管内皮细胞增殖具有抑制作用。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景:已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达.尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究.目的:创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒.设计、时间及地点:基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成.材料:人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所.方法:设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段.构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1-4)并行酶切鉴定分析.然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率.主要观察指标:重组质粒酶切鉴定结果.转染效率.采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达.结果:成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒.重组质粒经酶切鉴定证实构建成功.质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%.短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%.结论:成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用.短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显.     

Nogo受体基因干扰RNA表达载体的构建

目的 构建Nogo受体基因干扰RNA表达载体,为促进中枢神经轴突的再生、探索临床治疗脊髓损伤新途径奠定基础。方法 GeneBank中NgR的序列,应用www.invitrogen.com网站的设计软件设计、合成NgR miRNA的相应Oligo DNA,与BLOCK-iT Poll miR RNAi Expression Vector相连接,转化感受态Eco.li TOP10。结果 限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切、测序鉴定重组载体BLOCK-iT Poll miR RNAi/NgR,显示NgR miRNA相应的Oligo正确克隆入BLOCK-iTPoll miR RNAi Expression Vector。结论 成功构建Nogo受体基因干扰RNA表达载体。     

血管内皮生长因子C靶向RNA干扰重组载体的构建和效应检测

目的:构建针对人血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,并观察其在胃癌细胞中的干扰效果。方法:实验于2006-02/2007-02在河南省分子医学重点学科开放实验室完成。①实验材料:小干扰RNA表达载体pSilencer3.1为美国Ambion公司产品;胃癌细胞SGC7901为河南省分子医学重点学科开放实验室保存;血管内皮生长因子C基因的干扰片断和聚合酶链反应引物(152bp)由上海生工生物公司合成。②实验过程:根据pSilencer3.1-H1载体要求设计靶向血管内皮生长因子C基因的两对小干扰RNA,退火后连接入载体相应位点,构建重组表达质粒。经酶切和测序鉴定后分别转染胃癌细胞株SGC-7901,经G418筛选,获得稳定表达的细胞株。③实验评估:采用反转录-聚合酶链反应和Westernblot法检测血管内皮生长因子CmRNA和蛋白水平的表达。结果:①重组质粒的酶切、核苷酸序列分析结果:经酶切和测序鉴定证实成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体,建立了稳定转染细胞株。②稳定转染的细胞株中血管内皮生长因子CmRNA和蛋白表达:反转录-聚合酶链反应和Western blot显示转染后血管内皮生长因子C表达与对照组相比有不同程度的降低,以pSilencer3.1-neo-VEGF-C1尤为明显,抑制血管内皮生长因子C表达,不影响细胞的生长。结论:成功构建了血管内皮生长因子C小干扰RNA表达载体及稳定转染的胃癌细胞株。     

RNA干扰抑制Fas基因的表达对小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3的影响

摘要：目的：用RNA干扰（RNAi）技术抑制小鼠Fas基因表达,观察其对脑微血管内皮细胞bEnd.3增殖及FADD-FLIP-TRAF-NF-κB信号传导途径的影响, 为后续FasL低剂量兴奋效应研究提供实验基础。 方法：设计合成靶向小鼠Fas基因的小干扰RNA（siRNA）片段,用脂质体包埋转染bEnd.3细胞;CCK-8法检测细胞增殖;RT-PCR检测bEnd.3细胞FasmRNA的表达情况;western blot 检测 Fas、FADD、FLIP、TRAF蛋白表达水平。 结果：CCK-8法检测显示,Fas-siRNA组细胞增殖水平与空白对照组比较,无统计学差异（t=1.805,P＞0.05）;RT-PCR 结果表明,与空白组的Fas mRNA表达水平比较,Fas-228-、Fas-310-、Fas-427-、Fas-891-siRNA组mRNA表达水平降低,差异有统计学意义(F=123.127,P＜0.05);western blot显示,Fas-siRNA组与空白对照组Fas蛋白表达水平比较,差异有统计学意义（t=12.101,P<0.01）;Fas-siRNA组FADD、FLIP、TRAF蛋白相对表达水平与空白对照组比较,表达均下调（t=28.315、17.563、8.903,P<0.05）。 结论：Fas-siRNA能有效封闭Fas基因的表达,抑制Fas下游信号FADD、FLIP、TRAF蛋白表达。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建

背景：DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制。目的：构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒。方法：设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP—U6质粒经BamH I 和 HindIII双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态coliDH5a,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定。结果与结论：经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP．DREAM-shRNA-U6片段大小为473bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316．EGFPDREAM．shRNA-U6重组质粒构建成功。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建

背景:DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制。目的:构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒。方法:设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态E.coli DH5α,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定。结果与结论:经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6片段大小为473bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6重组质粒构建成功。     

小干扰RNA靶向血管内皮生长因子基因抑制胆囊癌细胞的增殖体内外实验

背景:已有研究发现RNA干扰可通过抑制血管内皮生长因子基因表达抑制肿瘤细胞增殖,但目前关于应用RNA干扰胆囊癌血管内皮生长表达的研究国内外尚无相关报道.目的:构建并筛选靶向血管内皮生长因子的shRNA,观察RNA干扰血管内皮生长因子的效果及对胆囊癌细胞增殖的影响.方法:设计VEGF-shRNA片段,连接到pCYU6/GFPINeo-shRNA质粒载体上.shRNA转染胆囊癌细胞.建立裸鼠胆囊癌模型,随机分成空白组、阴性对照组、实验组(干扰pShRNA-VEGF2),每组6只.瘤内注射shRNA.荧光显微镜观察细胞生长状态,半定量反转录-聚合酶链反应法与实时荧光定量聚合酶链反应检测RNA干扰效果,观察胆囊癌裸鼠模型肿瘤体积变化. 结果与结论:RNA干扰血管内皮生长因子后,胆囊癌细胞细胞变圆,皱缩,部分细胞死亡脱落.ShRNA片段血管内皮生长因子2、血管内皮生长因子1均可抑制VEGF mRNA表达,抑制率可达86%,82%.裸鼠肿瘤模型中实验组肿瘤与对照组、阴性组相比明显变小,且生长缓慢(P<0.05),而对照组和阴性组在肿瘤大小及生长趋势上没有明显的差别.实验构建的hVEGF-shRNA质粒表达载体通过抑制血管内皮生长因子的表达,抑制胆囊癌细胞增殖,从而达到间接治疗肿瘤的目的.     

靶向STAT5的RNAi重组质粒的构建与鉴定

摘要:目的：构建靶向信号转导及转录激活因子5（STAT5）的RNAi重组质粒并进行鉴定。 方法：设计针对STAT5编码区的有短发夹结构的3对DNA序列,克隆到质粒载体Pgenesil-1中构建重组质粒,再对其进行酶切鉴定、DNA 测序分析。脂质体法转染重组质粒至SMMC7721细胞株中,westernblot、RT-PCR检测STAT5基因表达。 结果：酶切鉴定和测序分析提示,靶向STAT5的RNAi重组质粒构建成功,3条靶向STAT5的序列特异性小发夹状RNA（shRNA）可有效抑制SMMC7721细胞STAT5表达,mRNA表达抑制率分别为70.43%、43.02%、45.07%,蛋白质表达抑制率分别为67.45%、37.36%、41.86%(P<0.05)。其中以Pgenesil-1-STAT5A1抑制效应最强。 结论：成功构建靶向STAT5的RNAi重组质粒,为进一步用该重组干扰载体进行体内肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。     

表达E2F1小干扰RNA的逆转录病毒载体的构建

目的:建立一个表达E2F1小干扰RNA的靶向抑制E2F1表达的重组逆转录病毒载体.方法:通过重组DNA技术,将设计好的两条互补寡核苷酸片段退火后与载体连接,利用载体上的BglⅡ和 EcoRⅠ位点进行双酶切初步鉴定,重组载体应产生332bp和6182bp两个片段,选择酶切正确的重组载体进行测序,保证siRNA的方向和序列正确.结果:表达siRNA的重组逆转录病毒载体构建成功.结论:重组逆转录病毒载体的成功构建为下一步基因治疗的研究奠定了基础.     

BMI-1干扰基因重组腺病毒质粒的构建及鉴定

背景：BMI—1的表达对于维持干细胞特别是造血干细胞、神经干细胞、肿瘤干细胞的自我更新能力是不可缺少的。目的：以细菌内同源重组法构建携带BMI-1干扰基因的重组腺病毒载体，制备重组腺病毒pShuttle—H1—AdEasy—1—P1P2／P3P4。设计、时间及地点：开放性实验，于2006-02，2007-08在江苏大学医学技术研究所完成。材料：限制性内切酶由NewEnglandBioLabs提供，腺病毒骨架质粒pAdEasy—1、大肠杆菌BJ5183、Ad293细胞由南京师范大学生科院分子医学生物技术江苏省重点实验室惠赠。方法：采用细菌内同源重组法构建RNA干扰腺病毒载体pShuttle—H1，PmeI线性化质粒，通过同源重组腺病毒骨架蛋白pAdeasy—1，得到重组的腺病毒干扰质粒；经PacI线性化后用脂质体转染方法转染293A细胞，收获腺病毒重组病毒子，以未转入小干扰RNA片段的重组质粒为对照，包装后收集细胞，反复裂解细胞获得腺病毒。主要观察指标：腺病毒质粒重组构建及鉴定情况。结果：经酶切鉴定，已成功构建siRNA的重组腺病毒表达载体pShuttle—H1—AdEasy—1—P1P2/P3P4，获得了重组病毒子。结论：利用新型腺病毒载体pAdeasy—1系统可在短期内制备BMI—1干扰基因的腺病毒表达载体，并制备出重组腺病毒P1P2/P3P4。     

构建变形链球菌psm基因同源重组质粒的实验

背景:为了深入研究磷酸蔗糖变位酶基因psm与变形链球菌S.mutans致龋性之间的关系,需要利用同源重组原理构建psm基因功能丧失菌株,因此构建一个符合同源重组条件的合格质粒载体就成为实验工作的重要前提.目的:构建变形链球菌S.Mutans UA159 psm的两种同源重组质粒.设计、时间及地点:于2005-12/2006-07在北京大学医学部病原微生物实验室完成的单一样本观察实验.＃材料:实验所用口腔链球菌均来自四川大学华西口腔医学院微生物实验室.方法:首先应用Southern Blot对psm基因的保守性进行分析,再将S.Mutans UA159 psm基因内部序列分别克隆至自杀质粒pSF151和pVA981上的多克隆位点,构建重组质粒.主要观察指标:psm基因的保守性及重组质粒pSF151及pVA981的构建结果.结果:psm基因在实验中所列8种S.Mutans中保守存在;经过聚合酶链反应和酶切分析,两个重组质粒所插入片断无误.重组质粒pSF151(空质粒大小为3.5kbp)和pVA981(空质粒大小为7.1kbp)构建成功.结论:两种可以用于转化S.Mutans UA159的重组质粒的构建可用于今后S.Mutans UA159 psm基因功能的研究,且重组质粒大小是否影响转化效率需后续观察.     

小鼠2型金属硫蛋白基因的克隆

目的 构建含有小鼠Ⅱ型金属硫蛋白（MT）基因的真核表达载体,为进行MT抗氧化作用的体内功能实验奠定基础。方法 采用重叠延伸PCR技术设计两对引物,利用引物间的互补序列作为模板合成小鼠Ⅱ型MT基因。结果 将PCR产物经连接反应,连接产物转化JM109,摇菌后提取质粒,质粒的酶切鉴定及最后的测序结果均表明本实验所获得的小鼠Ⅱ型MT基因与GENEBANK中的目标基因序列完全一致。结论 本实验通过重叠PCR技术成功构建了小鼠Ⅱ型MT编码基因,重叠PCR技术是合成目的基因片段的有效的手段。     

RNA interference mediated in human primary cells via recombinant baculoviral vectors.

The success of RNA interference (RNAi) in mammalian cells, mediated by siRNAs or shRNA-generating plasmids, is dependent, to an extent, upon transfection efficiency. This is a particular problem with primary cells, which are often difficult to transfect using cationic lipid vehicles. Effective RNAi in primary cells is thus best achieved with viral vectors, and retro-, adeno-, and lentivirus RNAi systems have been described. However, the use of such human viral vectors is inherently problematic, e.g., Class 2 status and requirement of secondary helper functions. Although insect cells are their natural host, baculoviruses also transduce a range of vertebrate cell lines and primary cells with high efficiency. The inability of baculoviral vectors to replicate in mammalian cells, their Class 1 status, and the simplicity of their construction make baculovirus an attractive alternative gene delivery vector. We have developed a baculoviral-based RNAi system designed to express shRNAs and GFP from U6 and CMV promoters, respectively. Transduction of Saos2, HepG2, Huh7, and primary human hepatic stellate cells with a baculoviral construct expressing shRNAs targeting lamin A/C resulted in effective knockdown of the corresponding mRNA and protein. Development of this baculoviral-based system provides an additional shRNA delivery option for RNAi-based investigations in mammalian cells.     

增强型绿色荧光蛋白RNAi表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向增强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的RNA干扰质粒载体。方法设计并合成针对EGFP编码区的模板寡核苷酸单链,克隆入pSilencerTM 3.1-H1 neo载体中,对重组质粒进行酶切鉴定和DNA序列测定。结果重组质粒经限制性内切酶酶切得到66 bp和4.3 kb条带;重组阳性克隆测序结果与实验设计的模板寡核苷酸序列相符。结论成功构建靶向EGFP的RNA干扰表达载体,为RNA干扰技术在实验室的进一步开展奠定基础。