乙型肝炎病毒前C区G1896A位点变异检测方法的建立及应用

[目的]建立等位基因特异性PCR（AS-PCR）法检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区G1896A位点变异并对部分慢性乙型肝炎标本进行检测。[方法]根据HBV前C区G1896A位点设计只有3＇末端有一个碱基不同的两对等位基因特异性引物，根据PCR结果判断该位点为G或A。[结果]本文测定的两株克隆序列与AS-PCR结果一致；HBeAg阳性慢性乙肝G1896A突变率为50％（15／30），HBeAg阴性组为90％（27／30），两组变异率有显著性差异（X^2=29．382，P=0．000）。[结论]本文建立的方法可用于检测HBV前C区G1896A位点的突变。     

乙型肝炎病毒前C区及基本核心启动子变异检测方法的比较研究

目的 建立错配聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（mPCR-RFLP）检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区A1896、基本核心启动子（BCP）T1762/A1764双变异的方法,与直接测序法比较,评估其应用价值.方法 利用错配PCR的原理扩增HBV前C区长194 bp、C启动子区长184 bp的基因片段,扩增产物分别经限制性内切酶Bsu36I、BclI酶切,琼脂糖凝胶电泳,根据酶切图谱多态性,建立检测HBV前C A1896、BCP T1762/A1764双变异的方法,对127份HBsAg、HBV DNA阳性的HBV感染者血清进行分析,酶切同时测序.2份标本用克隆测序以验证酶切鉴定变异株、野株混合感染的准确性.结果 127份血清中125（98.42%）份能用酶切、121（95.21%）份能用测序分析HBV前CA1896、BCP T1762/A1764状况.酶切与测序均成功的119份血清中,16份为前C区A1896变异株,34份为BCP T1762/A1764双变异株,21份为前C区A1896、BCP T1762/A1764联合变异株,48份为前C区G1896、BCP A1762/G1764野株,酶切与测序的结果完全一致.1份酶切鉴定为前C区A1896、G1896混合感染标本的5个克隆子中,1个为前C区A1896变异株,另外4个为前C区G1896野株;另1份酶切鉴定为单纯前C区A1896变异标本的5个克隆子均为前C区A1896变异株,酶切分析结果与克隆测序结果完全相符.结论 与测序法相比,本方法较简便、特异性强,能区分野毒株、变异株混合感染,适合较大样本分析,可用于流行病学调查及临床筛查.     

乙型肝炎病毒基本核心启动子区A1762T/G1764A突变检测的意义

目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)基本核心启动子区(BCP)A1762T/G1764A联合突变在不同疾病中发生的差异及其与乙肝相关肝癌预后的关系。方法选择慢性乙肝(CHB)患者38例、乙肝肝硬化(LC)患者36例、乙肝相关肝细胞肝癌(HCC)患者74例,用巢式PCR扩增患者血清中HBV BCP区,直接测序法检测HBV BCP区变异,分析A1762T/G1764A突变与HBV复制、HBeAg表达和HBV感染不同阶段的关系,以及与HCC患者预后的关系。结果在148例患者中,A1762T/G1764A突变总体发生率为54.7%,乙肝相关HCC组中A1762T/G1764A突变发生率为79.7%,而CHB、LC患者分别为31.6%、27.8%,HCC组变异的发生率明显高于CHB组(P0.05)和LC组(P0.05);A1762T/G1764A突变组HBV-DNA载量与非突变组比较差异无统计学意义(P0.05);HBeAg阳性组A1762T/G1764A突变发生率为41.4%,HBeAg阴性组为73.5%,HBeAg阴性组变异发生率明显高于HBeAg阳性组(P0.05);HCC患者A1762T/G1764A变异组与非变异组之间无病生存期及总体生存期差异无统计学意义(P0.05)。结论 HBV核心启动子区A1762T/G1764A联合突变与HCC发生具有显著关系,该变异与血清HBV-DNA的复制水平无关,但与血清HBeAg表达水平有关,与乙肝相关HCC预后无显著关系。     

血管紧张素原基因M235T多态性与老年脑梗死的相关性研究

目的 探讨血管紧张素原（angiotensinogen AGT）基因M235T分子变异与中国人脑梗死（cerebralinfarction CI）之间的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）及限制性片段长度多态性分析（RFLP）法对75例CI、48例健康对照进行了AGT基因M235T多态性检测。结果 CI组AGT基因T235等位基因频率为0．78，235TT基因型频率为0．64，与对照组（分别为0．604和0．375）比较差异具有显著性（x^2=8.82P=0．003；x^2=8、27 P=0．004）。校正了CI的几种危险因素（血总胆固醇、血糖及年龄）后，235TT基因型仍可使CI发生的危险性增加（分别为OR=3．289，P=0．036；OR=2．49，P=0．023）。结论 AGT基因235TT型可能是中国人群CI发病的独立危险因素。     

乙型肝炎病毒基因的巢式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分型及初步应用

目的 用改进的乙型肝炎病毒(HBV)巢式聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)的基因分型方法初探广州地区HBV基因型分布状态。方法 设计巢式PCR扩增前S基因，经限制性内切酶AvaⅡ和DpnⅡ酶切鉴别HBV A—G基因型；并对140份乙型肝炎患者血清进行基因分型，其中随机挑选3份进行克隆测序，并对20份患者血清进行巢式PCR—RFLP重复分型试验，以验证此分型技术的稳定性和特异性。同时采用PCR和巢式PCR对92份乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阴性血清进行HBV DNA阳性率检测比较。结果 基因分型与测序结果一致；基因分型重复试验符合率100％；92份HBeAg阴性血清经PCR和巢式PCR扩增HBV DNA的阳性率分别为20．7％和68．5％。140份乙型肝炎患者血清中HBV基因型以C型(94份)和B型(42份)为主，偶见A型(4份)。结论 巢式PCR—RFLP HBV基因分型方法具有良好的敏感性、特异性、稳定性，且操作简便，适用于临床和流行病学调查研究。     

PCR-RFLP检测载脂蛋白CⅢ基因T-455C多态性方法的建立及应用

目的：建立聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）检测栽脂蛋白CⅢ（apoCⅢ）T-455C多态性的方法,探讨南通汉族人群中apoCⅢ多态性与高三酰甘油血症（HTG）的相关性。方法：用PCR扩增apoCⅢ基因启动子区包含T-455C多态性在内的DNA片段,扩增产物用限制性内切酶BseG Ⅰ酶切后电泳,分析apoCⅢ基因型,同时采用生化方法检测研究对象的血脂和载脂蛋白水平。结果：检测到3种基因型,分别为-455TF、-455TC和-455CC。HTG患者组和健康对照组apoCⅢ-455C等位基因频率（50．44％比33．11％）和apoCⅢ-455CC基因型频率（26．55％比12．16％）均有显著差异（P〈0．01）;C等位基因携带者患HTG的风险是非携带者的2．06倍（95％CI：1．31～3．24）;-455C等位基因携带者有较高的三酰甘油（TG）和apoCⅢ蛋白水平（P〈0．05）。结论：PCR-RFLP是一种快速、敏感的分析apoCⅢ基因启动子区T-455C多态性的方法;apoCⅢ-455C等位基因与HTG的发生相关。     

建立酶切图谱法从日本历年本土基因型麻疹病毒株中鉴别中国输入株H1基因型麻疹病毒

目的本文主要研究建立一种酶切图谱法从日本历年本土C1、D3、D5基因型麻疹病毒中鉴别中国输入株H1基因型麻疹病毒,即逆转录多聚酶链式反应—限制性片段长度多态性分析方法(RTPCRRFLP)。方法对C1、D3、D5及H1基因型麻疹病毒H基因全长的序列进行分析,寻找能够从日本本土株中鉴别出输入株H1基因型麻疹病毒的限制性内切酶酶切位点,建立RTPCRRFLP方法。同时,我们又应用多株已经过序列分析确定为C1、D3、D5、H1基因型的麻疹病毒用该RTPCRRFLP方法进行验证。结果应用该RTPCRRFLP方法所得结果与序列分析方法结果一致。结论该RTPCRRFLP方法是一种简单、快速又实用的从日本本土株中筛查H1基因型输入株的方法。     

中国北京市区健康人群白细胞介素6基因启动子区基因的多态性及与亚裔和高加索人群的比较

目的：动脉硬化、老年痴呆、糖尿病、骨质疏松等均有循环中炎症介质持续升高的表现。观察北京市区健康人循环中炎症介质白细胞介素6启动子区基因多态性与循环中白细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原的关系，并评价白细胞介素6基因多态性的种族差异。方法：采用随机整群抽样的方法于2003—03／2004—03筛选中国北京地区30岁以上自我评价健康的汉族居民662人，男365人，女297人。通过身体检查及血液学及血生化学检测，了解调查对象健康状况；测定入选人群白细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原；检测白细胞介素6启动子区174(G／C)，597(G／A)。572(G／C)基因多态性，观察其与循环中炎症指标白细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原的关系。结果：按意向处理分析，进人结果分析662人。①人选健康成人662人．174位均为GG型，未发现GC和CC型；597位GG型占99．24％，仅有5人为GA型，未发现CC型；572位存在GG。CC，GC3种基因型。G和C等位基因频率分别为0．22和0．78，基因型和等位基因频率均无性别差异。②G等位基因(GG+GC型)携带者循环中自细胞介素6、超敏C反应蛋白和纤维蛋白原水平明显高于cc基因型[(2．91&;#177;2．21)ng／L,(2．43&;#177;2．31)mg／L，(3．05&;#177;0．71)g／L；(2．44&;#177;1．47)ng／L．(1．41&;#177;1．57)mg／L，(2．70&;#177;0．64)g／L,P=0．03，0．01，0．01]。③中国北京地区汉族人群白细胞介素6启动子区174(G／C)，597(G／A)、572(G／C)的基因型分布与日本、韩国亚裔人群相似(174位和597位几乎均为GG型．572位G等位基因频率分别为0．28，0．23，0．25，P&;gt;0．05)。而明显不同于德国、瑞典高加索人群(174位存在GG。GC，CC，597位存在GG，GA．AA3种基因型。572位G等位基因频率分别为0．95，0．93，P&;lt;0．01)。结论：白细胞介素6启动子区174(G／C)，597(G／A)，572(G／C)基因多态性存在种族差异，亚裔人群不存在174(G／C)，597(G／A)基因多态性，572位基因型频率也明显不同于高加索人群。572(G／C)位存在基因多态性并影响循环中白细胞介素6的表达从而影响机体炎症状态。G等位基因为少见基因，其携带者白细胞介素6和超敏C反应蛋白水平明显高于CC型个体。     

中国汉族健康群体多巴胺D1受体-48A／G基因多态性分布

目的：了解中国汉族健康群体多巴胺D1受体-48A／G基因的多态性。方法：随机收集2004—03／07武汉大学人民医院门诊体检中心健康汉族人188名，其中男112名，女76名。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法，分析限制性酶切位点-48A／G的多态分布。结果：188名健康人的测试结果进入分析。①多巴胺D1受体-48A／G基因型在中国汉族健康人群中的分布特点；以AA纯合子型最多见（0．71），AG杂合子型次之（0．28），GG纯合子型最为罕见（0．01）；等位基因频率的分布以A等位基因最多见（0．85），其次为G等位基因（0．15）。在男女性别之间，基因型频率（x^2=1.582，P〉0．05）相等位基因频率（x^2=0.606，P〉0．05）分布差异无显著性。②不同种族间多巴胺D1受体-48A／G基因型分布的比较；中国汉族健康群体多巴胺D1受体-48A／G等位基因的分布与高加索、德国及日本人群相比差异有显著性（P〈0．01）；在基因型的分布上，与日本人群也存在显著性差异（P〈0.01）。结论：中国汉族健康群体多巴胺D1受体-48A／G以AA纯合子基因型最多，等位基因频率的分布以A等位基因最多；在男女性间的基因型频率和等位基因频率分布无差异。中国汉族健康群体与高加索、德国及日本报道的人群多巴胺D1受体-48A／G等位基因分布和基因型的分布不同     

乙型肝炎病毒前C区1896、基本C区启动子区1762／1764变异对拉米夫定抗病毒疗效的影响及其临床意义

目的研究乙型肝炎病毒（HBV）前C区G1896A变异和基本C区启动子（BCP）区A1762T／G1764A双变异对拉米夫定（LAM）抗病毒疗效的影响及其临床意义。方法收集上海及其周边地区34例慢性乙型肝炎患者,单用LAM或LAM＋聚乙二醇干扰素α-2a进行抗病毒治疗共48周,应用TrugeneHBVgenotyping试剂盒测定分析治疗前（0周）、治疗过程中（24周）、治疗结束时（48周）及随访结束时（72周）RT区YMDD变异;采用HBV基因多态性检测芯片试剂盒测定前C区1896、BCP区1762／1764位点的变异情况。结果在治疗前有9例患者检测出前C区G1896A变异,均为HBVe抗原（HBeAg）阴性慢性乙型肝炎患者;9例前C区G1896A变异患者中7例治疗应答（77．8％,7／9）,BCP区A1762T／G1764A变异在治疗应答者与无应答者中差异无统计学意义;3例患者分别在治疗24和48周时检测到YMDD变异,对治疗均无应答。结论慢性乙型肝炎患者治疗前血清HBVDNA变异状态可能影响LAM抗病毒治疗应答及YMDD耐药变异株的复制能力。     

应用PCR-RFLP技术检测阿德福韦耐药相关性HBV变异

目的建立一种简便、快速、实用的检测阿德福韦(ADV)耐药相关性HBV变异(rtA181V/T/S和rtN236T变异)的方法。方法根据GenBank收录的HBV基因全序设计套式-PCR引物,使野毒株的PCR产物上游末端引入BglI的酶切位点,使rt236变异株的PCR产物下游末端引入BseDI(SecI)的酶切位点,建立PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)方法。用此方法分别检测含rt181变异株、rt236变异株及野毒株质粒和3例ADV耐药慢性乙型肝炎患者血清标本。将变异株和野毒株配成不同比例,再用此方法检测,以了解该方法的敏感性。结果本研究建立的PCR—RFLP方法可同时检测rt181变异和rt236变异;用此方法检测血清标本,结果与测序及克隆分析一致;此方法可检测出标本中10%的变异株。结论应用PCR- RFLP方法可同时检测rtA181V/T/S和rtN236T变异,具有较高的敏感性,可用于ADV耐药变异的早期诊断。     

上海地区部分乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型分析

目的研究上海地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布情况。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)检测136例HBV DNA阳性的上海籍HBV感染者的基因型。结果136例HBV DNA阳性的HBV感染者中基因型B 43例,占31.6%,基因型C 92例,占67.6%,基因型D仅有1例,未发现基因型A、E、F。结论上海地区存在HBV基因B、C、D型,基因型A、E、F是否存在仍需扩大样本作进一步深入研究。     

聚合酶链反应限制性片段长度多态性检测载脂蛋白E基因型

目的建立一种简便、准确、实用的人载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）基因型的检测方法。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增ａｐｏＥ基因含编码１１２位和１５８位氨基酸的基因序列，扩增产物用限制性内切酶ＨｈａⅠ酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，观察酶切位点的限制性片段长度多态性（ＲＦＩＰ）图谱。结果运用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法检测了１１３名健康人ａｐｏＥ基因型，频率分别为ε３／３６９．０％，ε３／２１６．８％，ε４／３１１．５％，ε４／２１．８％，ε４／４０．９％；ε２、ε３和ε４等位基因频率分别是９．３％、８３．２％和７．５％。结论该方法简单、快速、准确，对人体无害，适合于一般实验室开展及大规模人群调查     

汉族正常人群与血栓性疾病患者vWF裂解酶C1423T基因多态性调查

目的　研究我国汉族人群中血管性血友病因子裂解酶 (vWF cp)基因C14 2 3T多态性的分布频率及其与血栓性疾病的相关性。方法　应用PCR技术结合酶切分析、聚丙烯酰胺凝胶电泳研究来自我国三个不同地区 4 0 0名汉族人vWF cp中C14 2 3T多态性的分布特点。同时 ,根据病例对照研究 ,比较了健康对照和血栓性疾病患者中该多态性的分布频率。结果　我国汉族人群中C14 2 3T的基因频率分别为 98.5 %和 1.5 % ,总理论杂合率为 2 .96 % ,不同地区人群杂合率不同 ,但未发现 14 2 3T T纯合子。该多态性的基因型与基因频率在健康对照和血栓性疾病患者中相似。结论　vWF cp基因C14 2 3T多态性在我国汉族人群中频率较低 ,尽管它影响vWF cp的酶活性。     

人β3-肾上腺素能受体基因第64位密码子突变频率的检测

目的建立一种简便、准确、实用的人β３－肾上腺素能受体基因第６４位密码子突变频率的检测方法。方法应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增β３－肾上腺素能受体基因含编码６４位氨基酸的基因序列，扩增产物用限制性内切酶ＢｓｔＯＩ酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，观察酶切位点的限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）图谱。结果运用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法检测了１７４名汉族人β３－肾上腺素能受体基因第６４位密码子点突变，其中野生型纯合子频率为６９．５％，杂合子频率为２７．６％，突变型纯合子频率为２．９％。突变等位基因频率为０．１７。结论该方法简便、快速、准确，适合于一般实验室检测及大规模的人群调查。     

构建乙型肝炎病毒基因参照品判断基因分型的探讨

目的利用乙型肝炎病毒（HBV）基因参照品判断HBV基因分型。方法自行制备HBV—S区基因参照品A、B、C、D型并测序及比较同源性，利用限制性内切酶MboI、EarI酶切参照品和样品扩增产物，从而确定样品基因型。利用该方法对克拉玛依地区272例HBV—DNA阳性血清基因分型。结果测序证实，HBV基因参照品与39例GenBank序列同源性均在96％以上。272例样品成功分型241例（88．6％）。检出B、C、D型，未检测到A型。抽检12例测序同源性大于96％。结论依据基因参照品核酸碱基片段大小判断分型，简明直观，适用于大样本的筛检及临床应用。     

简便HBV基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立

目的 建立简便HBV基因型S基因PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分型方法(以下简称“简便PCR-RFLP法”),并评价其临床应用价值.方法 临床诊断研究.查阅并比较GenBank中128株HBV(基因型A～D型)S基因片段(S区nt253-687),设计限制性内切酶Hinf Ⅰ、Ear Ⅰ、Apo Ⅰ鉴别A～D基因型分型方法,并评价简便PCR-RFLP法检测HBV DNA的最低检测下限、重复性;然后,用该方法检测50例慢性乙型重型肝炎患者的HBV基因型,同时用直接测序法验证简便PCR-RFLP法检测HBV基因型的一致性.结果 建立了简便PCR-RFLP法HBV基因分型的方案,通过限制性内切酶Hinf Ⅰ一次酶切就可分出我国流行的B型、C型、D型等毒株及B/C混合型.随机抽取3份标本,不同稀释浓度下,用简便PCR-RFLP法重复检测HBV基因型,分型结果均与原血清完全一致,且最低检测下限约为7 ～9 IU/ml.经Hinf Ⅰ酶一步酶切后,用简便PCR-RFLP法从50例患者标本中,检出B型23份、C型10份;经直接测序法验证,从PCR产物中检出B型23份、C型10份,2种方法检测B、C型基因结果完全一致(Kappa=1.00,P=0.001),简便PCR-RFLP法检出B/C混合型9份,优于PCR产物直接测序法(0份,x2=18.00,P=0.001).Hinf Ⅰ酶一步酶切后分出的ABD型8份,进一步酶切及应用PCR产物直接测序法检测均为B型变异株.结论 建立的简便PCR-RFLP法对HBV基因分型有较高的灵敏度和重复性,且在检出混合基因型方面具有优势,更为简便.     

鲁南地区HBV基因型和HBV核心启动子双点突变与肝硬化、肝癌的关系

目的研究鲁南地区肝细胞癌(HCC)、肝硬化(LC)患者与乙型肝炎病毒(HBV)基因型及基本C区启动子(BCP)基因区A1762T/G1764A双位点变异之间的关系,探讨其相关性。方法按慢性HBV感染者111例的不同临床分型,对其中HCC、LC和慢性乙型肝炎(CHB)患者各37例,采用实时荧光定量PCR法及PCR微板核酸杂交ELLSA技术进行HBV基因定量、分型检测;采用HBV基因多态性芯片检测BCP区A1762T/G1764A双位点变异;对不同性别、年龄、病毒基因型分布、临床分型患者进行HBV基因分型、BCP区双突变,以及不同HBV基因型BCP双突变的比较。结果在CHB、LC、HCC患者中,HBeAg阴性者分别为24.3%、75.7%和83.8%;HCC患者HBeAg阴性率较CHB患者明显升高(P<0.05)。男、女性别HBV均以C基因型占优势,分别为57.3%和54.5%,性别间无统计学差异(P>0.05);年龄<30岁组HBV以B基因型(40.3%)、C基因型(51.7%)占优势,≥30岁组以C基因型(67.2%)占优势,<30岁组B基因型构成比高于≥30岁组(29.6%,P<0.05);HCC、LC患者中HBV以C基因型为主,分别占73.0%和75.6%。BCP双突变率在HCC、LC分别为64.9%和56.8%;HBVC基因型多发生BCP双突变,占63.6%(42/66)。结论鲁南地区HBV基因型以C型和B型为主,其中LC、HCC患者基因型以C型占优势,HCC患者BCP双突变率显著高于CHB患者,在慢性HBV感染者中HBVC基因型多发生BCP双突变。