脑出血模型大鼠脑组织脑红蛋白的表达

目的:观察脑红蛋白在实验性脑出血模型大鼠脑组织内表达水平的动态变化。方法:实验于2004-10/2005-10在解放军沈阳军区总医院动物实验科和神经中心实验室完成。66只大鼠随机分为3组:正常对照组6只,脑出血组30只和假手术组30只。脑出血组和假手术组再根据动物模型建立后1,6,24,48和72h5个时间点随机分为5个亚组,每个亚组6只大鼠。采用立体定向自体血注入大鼠尾状核建立脑出血模型(假手术组注入生理盐水),用Westernblot和免疫组织化学法检测脑出血后不同时间脑组织内脑红蛋白的表达。结果:脑出血组有3只大鼠术后死亡,有4只大鼠术后模型制备失败,均予以剔除并随机补充,66只大鼠最终纳入分析。Westernblot结果显示脑出血组术后1h血肿周围脑组织内脑红蛋白相对表达水平开始增高(0.45±0.03),48h达到高峰(0.83±0.05),72h开始下降(0.55±0.11),均明显高于假手术组(0.31±0.06,0.31±0.01,0.33±0.04)和正常对照组(0.32±0.07)。免疫组化染色显示在血肿周围脑红蛋白表达比其他脑区明显增多。结论:脑出血后脑内脑红蛋白表达上调,提示脑红蛋白可能对脑出血继发神经损伤起重要的保护作用。     

促红细胞生成素对大鼠脑出血炎症反应的抑制作用及机制*

目的： 研究实验性大鼠脑出血后血肿周围核因子-κB (NF-κB)及其抑制因子κBα(IκBα)的表达,以及促红细胞生成素（EPO）对其干预作用,探讨EPO对出血性脑炎症反应的作用及机制。方法：将126只大鼠随机分为假手术组、脑出血组、EPO干预组。每组各42只,分别为术后第3、6、12、24、48、72小时和第7天亚组,每亚组各6只。采用大鼠尾动脉自体不凝血 50 μl注入尾状核区建立脑出血模型,分别在不同时间点断头取脑,连续切片作NF-κB 及IκBα免疫组化染色;观察各组各时间点NF-κB、 IκBα蛋白的表达并进行分析比较。结果：脑出血第6小时后NF-κB 及IκBα表达增高,第24小时明显增高,第72小时达到高峰,各时间点与假手术组比较差异均有显著性(P＜0.01)。EPO干预后NF-κB表达明显降低,与脑出血组比较有显著性差异(P＜0.01);经EPO干预后IκBα表达显著增多,与脑出血组比较有显著性差异(P＜0.01)。结论：脑出血周围NF-κB及IκBα表达均有增多,EPO通过抑制NF-κB表达、促进IκBα表达抑制炎症反应从而起到神经保护作用。     

大鼠高血压性脑出血血肿量对Caspase-3表达的影响

目的 观察大鼠高血压性脑出血后血肿周围组织Caspase-3的表达,分析其表达与血肿量及出血时间的关系.方法 取成年SD大鼠100只,随机分为对照组、脑出血1组、脑出血2组,采用双侧肾动脉前支部分热凝,立体定位仪下自体血脑内注入法建立大鼠高血压性脑出血模型.用免疫组化方法观察Caspase-3的表达.结果 大鼠高血压性脑出血后6 h Caspase-3开始表达,24 h达高峰,血肿量大的脑出血组(脑出血2组)相应时间点Caspase-3的表达较血肿量小的脑出血组(脑出血1组)明显增高(P<0.05).结论 高血压性脑出血后Caspase-3的表达随血肿量的增加表达也增加,从而加重了脑出血后血肿周围脑组织的凋亡.     

局部亚低温对实验性脑出血后 脑水肿及脑组织核转录因子-κB表达的影响

目的观察局部亚低温治疗对大鼠脑出血后脑水肿及血肿周围脑组织核转录因子-κB(NF-κB)表达的影响。 方法雄性Wistar大鼠144只分成常温组和亚低温组,每组72只,每组又分成相应的对照组、脑出血6 h组、脑出血24 h组、脑出血48 h组、脑出血72 h组和脑出血1周组,共6个亚组,每个亚组12只。采用自体不凝血注入大鼠尾状核制备脑出血模型（常温对照组和亚低温对照组手术方法同其余10个亚组,但不注血）。亚低温各亚组造模成功后采用亚低温治疗4 h,且维持脑温在（33.0±0.5）℃;常温组保持体温在37 ℃,常规饲养。应用干湿重法检测脑水肿程度,同时采用免疫组化和免疫印迹方法检测血肿周围NF-κB的表达强度。 结果脑出血后48 h,常温组和亚低温组大鼠的脑水肿程度和NF-κB表达均达高峰,其中脑水肿程度差异有统计学意义(P<0.05)。亚低温组中的脑出血24 h组、脑出血48 h组、脑出血72 h组和脑出血1周组的NF-κB阳性细胞表达水平和免疫印迹的蛋白表达强度显著低于常温组相应亚组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论NF-κB高表达是致脑水肿的关键物质,亚低温治疗能明显抑制血肿周围NF-κB的过度表达及脑水肿。     

脑出血模型大鼠脑组织脑红蛋白的表达

目的：观察脑红蛋白在实验性脑出血模型大鼠脑组织内表达水平的动态变化。方法：实验于2004-10／2005—10在解放军沈阳军区总医院动物实验科和神经中心实验室完成。66只大鼠随机分为3组：正常对照组6只，脑出血组30只和假手术组30只。脑出血组和假手术组再根据动物模型建立后1，6，24，48和72h 5个时间点随机分为5个亚组，每个亚组6只大鼠。采用立体定向自体血注入大鼠尾状核建立脑出血模型（假手术组注入生理盐水），用Weatern blot和免疫组织化学法检测脑出血后不同时间脑组织内脑红蛋白的表达。结果：脑出血组有3只大鼠术后死亡。有4只大鼠术后模型制备失败，均予以剔除并随机补充，66只大鼠最终纳入分析。Western blot结果显示脑出血组术后lh血肿周围脑组织内脑红蛋白相对表达水平开始增高（0．45&;#177;0．03）A8h达到高峰（0．83&;#177;0．05），72h开始下降（0.55&;#177;0．11），均明显高于假手术组（0.31&;#177;0．06，0.31&;#177;0.01，0．33&;#177;0．04）和正常对照组（032&;#177;0．07）。免疫组化染色显示在血肿周围脑红蛋白表达比其他脑区明显增多。结论：脑出血后脑内脑红蛋白表达上调，提示脑红蛋白可能对脑出血继发神经损伤起重要的保护作用。     

实验性脑出血灶周Caspase-3和Bcl-2的表达及意义

目的 观察脑出血后不同时间出血灶周凋亡细胞、Caspase-3、Bcl-2的表达.方法 健康雄性Wistar大鼠48只随机分成假手术组和脑出血组,大鼠尾壳核区注入自体非抗凝动脉血建立脑出血模型,采用TUNEL法检测凋亡细胞,免疫组织化学方法观察术后不同时间点Caspase-3和Bcl-2的动态变化.结果 脑出血组大鼠出血灶周凋亡细胞及Caspase-3、Bcl-2的表达较假手术组显著增强（p〈0.01）.结论 脑出血后血肿周围神经细胞损伤有凋亡机制参与,且与Caspase-3和Bcl-2蛋白表达有关.     

脑出血大鼠急性期血浆及脑匀浆神经肽Y活性的变化

目的　观察大鼠脑出血急性期血浆及脑匀浆中神经肽 Y (NPY)活性的动态变化 ,探讨 NPY在脑出血脑损害中的作用。方法　 Wistar大鼠 70只 ,随机抽签法分为脑出血组及假手术对照组 ,每组各 35只 ;每组再按出血前及出血后 0 .5、6、12、2 4、4 8和 72 h分为 7个亚组 ,每亚组 5只。分别于各时间点测定血浆和血肿周边脑组织 NPY含量 ,并观察血肿病灶区的组织形态学病理改变。结果　脑出血后 6 h血浆和血肿周边脑组织 NPY的含量开始同步升高 ,并于 2 4 h达峰值 ,4 8h开始回落 ,但至 72 h时 NPY的含量仍显著高于出血前 (P<0 .0 5或 P<0 .0 1)。光镜和电镜下脑组织也发生相应的病理损害。结论　 NPY可能参与了脑出血的病理生理过程。     

安宫牛黄丸对大鼠脑出血后水通道蛋白-4表达的影响

目的:探讨安宫牛黄丸对大鼠脑出血(intracerebral hemorrhage)后脑水肿及脑组织水通道蛋白-4(aquaporin-4,AQP-4)表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为正常对照(CON)组、假手术(SHAM)组、脑出血(ICH)组、安宫牛黄丸治疗(AGNHW)组.每组分为5个时间点,分别为6、12、24、48、72 h,每个时间点5只大鼠.采用自体股动脉血注入尾状核建立大鼠脑出血模型,HE染色观察各组血肿周围神经细胞形态学改变,免疫组织化学方法观察各组血肿周围脑组织AQP-4表达的变化.结果:大鼠实验性脑出血后AQP-4表达升高,48 h达到高峰,72 h仍高于正常;脑出血后6 h可见神经细胞坏死,24～48 h时段达到高峰,脑组织损伤程度与AQP-4表达呈显著正相关(r=0.829,P<0.001);安宫牛黄丸处理后,脑组织损伤减轻,AQP-4表达下降.结论:脑出血后AQP-4表达与脑组织损伤程度呈显著正相关,安宫牛黄丸能够有效抑制大鼠脑出血后AQP-4蛋白表达,减轻脑水肿.     

不同时间窗给予活血化瘀中药三七治疗脑出血急性期大鼠的安全性评估

目的 探讨脑出血急性期大鼠不同时间窗给予活血化瘀中药三七颗粒治疗的安全性.方法 将210只SD大鼠按随机数字表法分为制模后即刻及1、2、3、5、7 d给药组和模型组,每组30只;采用自体血注射法制备脑出血大鼠模型;各给药组于相应时间点将三七颗粒溶于纯净水中以10 ml/kg灌胃,模型组给予等量纯净水;术后8 d观察各组死亡率,断头处死大鼠取脑,测定脑组织含水量及脑血肿体积.结果 制模后即刻给药组大鼠死亡率明显高于模型组(13.3%比3.3%,P＜0.01).与模型组比较,制模后即刻给药组脑组织含水量明显增多[(82.80±0.26)%比(80.97±0.45)%,P＜0.01],脑血肿体积明显减少[(18.92±0.38)μl比(23.96±0.77)μl,P＜0.01];从制模后1 d起给药组脑组织含水量、脑血肿体积均逐渐减少,制模后3 d降至最低(脑组织含水量(74.89±0.36)%,脑血肿体积(15.21±0.70)μl,与制模后即刻给药组比均P＜0.05],然后开始升高,后又下降,制模后7 d与1 d时接近[脑组织含水量(78.56±0.65)%比(78.93±0.51)%;脑血肿体积(17.98±0.69)μl比(18.05±0.53)μl,均P＞0.05].结论 三七颗粒在适当时间窗给药具有活血化瘀作用,可以减轻脑水肿,减少脑血肿体积,从而对脑出血后脑组织具有保护作用.     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑血肿周围组织和海马bax及bcl-2基因表达的调节

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对大鼠脑出血后出血灶周围脑组织和出血侧海马bax、bcl-2基因表达的影响,探讨神经营养因子对神经细胞调亡的调控。方法:实验于2006-01/10在广西医科大学医学科学实验中心完成。①取成年清洁级Wistar大鼠72只,雌雄各半,体质量250g左右。②采用脑内囊注射胶原酶建立大鼠脑出血模型,动物于苏醒后按Bederson法进行神经病学评分,评分>3分后入选本实验,入选72只大鼠随机抽签法分为3组,每组24只。碱性成纤维细胞生长因子组按8μg/kg剂量肌肉注射,1次/d;生理盐水组肌肉注射等剂量的生理盐水,1次/d;模型组不作任何干预。③每组分别于干预后1,3,7d随机抽取8只大鼠,麻醉状态下取出血灶周围脑组织和出血侧海马,采用半定量反转录-聚合酶链反应检测调亡调控基因bax mRNA,bcl-2mRNA的表达。结果:在建立脑出血模型中共5只大鼠死亡,随后对死亡动物进行解剖,发现脑内血肿量过大,致脑疝形成而导致死亡,后随机补充动物。72只大鼠进入结果分析。①血肿周围脑组织bax mRNA表达:干预后3d,7d,碱性成纤维细胞生长因子组血肿周围脑组织bax mRNA表达比生理盐水组明显减少(3d:0.54±0.19,0.76±0.23,P<0.05;7d:0.45±0.19,0.71±0.16,P<0.01)。②血肿周围脑组织bcl-2mRNA表达:干预后3d,7d,碱性成纤维细胞生长因子组的血肿周围脑组织bcl-2mRNA表达比生理盐水组明显增高(3d:0.68±0.25,0.39±0.19,P<0.05;7d:0.80±0.21,0.48±0.18,P<0.01)。③出血侧海马bax mRNA表达:干预后3d和7d,碱性成纤维细胞生长因子组的出血侧海马bax mRNA表达比生理盐水组均明显减少(3d:0.54±0.18,0.70±0.11;7d:0.43±0.24,0.69±0.18,P均<0.05)。④出血侧海马bcl-2mRNA表达:干预后3d和7d,碱性成纤维细胞生长因子组的出血侧海马bcl-2mRNA表达比生理盐水组均明显增多(3d:0.66±0.11,0.50±0.15;7d:0.72±0.12,0.52±0.22,P均<0.05)。结论:碱性成纤维细胞生长因子能调节凋亡相关基因,提高大鼠脑出血后大脑脑组织和海马bcl-2mRNA的表达,降低bax mRNA的表达。     

纳洛酮对脑出血大鼠抓握能力的改善及血清S100B水平的影响

目的：探讨纳洛酮对脑出血大鼠抓握能力的改善及血清S100B水平的影响，为其临床应用提供理论依据。方法：40只SD大鼠随机分成假手术组，手术组，纳洛酮组，脑复康组，参照Rosenberg法制作大鼠脑出血模型，造模第二天测定大鼠抓握能力，用ELISA法检测造模后24小时及48小时血清S100B水平。结果：（1）纳洛酮组大鼠抓握能力明显好于手术组，两者比较有显著差异（P<0.05）。（2）纳洛酮组大鼠血清S100B水平明显低于手术组, 两者比较有显著差异（P<0.05）。结论：纳洛酮能明显改善脑出血大鼠抓握能力，降低血清S100B水平，具有神经保护作用。     

大鼠脑出血血肿周围神经细胞的另类死亡方式——胀亡

目的通过建立大鼠脑出血动物模型观察脑出血后血肿周围神经细胞胀亡时程表达变化。方法48只大鼠随机分为两组：脑出血组和对照组,脑出血组尾状核注入自体血50μL,对照组注入等量生理盐水。分别于6h、24h、2d、3d、5d、7d后处死,根据Rosenberg评分对各组大鼠进行评分,电镜下观察神经细胞胀亡及凋亡形态学变化并计数胀亡神经元。结果脑出血组大鼠神经功能评分24h最高,血肿周围存在胀亡神经元,且胀亡指数24h达高峰,以后逐渐下降,与对照组相比有统计学差异。结论脑出血后存在神经细胞胀亡,且有一定时空变化规律。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对重症急性胰腺炎大鼠小肠黏膜上皮细胞凋亡的影响

目的 研究外源性胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡及凋亡相关基因bax,bcl-2,caspase-3 mRNA表达的影响.方法 72只雄性Wistar大鼠按照随机数字表法分为假手术组(SO组)、重症急性胰腺炎组(SAP组)、IGF-Ⅰ治疗组(IGF-Ⅰ组)共三组.通过胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠制作大鼠SAP模型,SO组用同样方法经胰胆管逆行注射生理盐水;IGF-Ⅰ组分别于术后30 min和术后3 h经后肢内侧皮下注射ICF-Ⅰ.各组动物分别于术后6,12,24 h处死8只,检测血浆淀粉酶,TUNEL法检测小肠黏膜上皮细胞凋亡,观察小肠组织病理学变化并进行病理评分,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测小肠黏膜上皮细胞中bax,bcl-2和caspase-3mRNA的表达.数据采用SPSS 11.0统计软件分析,多组间比较采用单因素方差分析.结果 IGF-Ⅰ治疗组与SAP组各时相点相比,血浆淀粉酶和小肠病理评分均低于各相应时相点,于12 h和24 h差异有统计学意义,均P<0.05;小肠黏膜上皮细胞凋亡指数IGF-Ⅰ组与SAP组各相应时相点相比均显著降低[6 h:(13.88±1.73)vs.(19.00±2.78);12 h:(10.13±1.55)vs.(17.63±1.60);24 h:(9.50±1.07)vs.(17.25±2.76)],P<0.05;电镜示小肠组织病理变化较SAP组明显改善.bax mRNA表达在SAP组各时点较SO组相应时相点明显增高[6 h:(1.35±0.18)vs.(0.85±0.12);12 h:(1.21±0.21)vs.(0.86±0.24);24 h:(1.14±0.24)vs.(0.95±0.22)],6 h即达高峰,而在IGF-Ⅰ组的表达与SAP组相应时相点比较则明显减弱,在12 h和24 h差异具有统计学意义(P<0.05),于24 h即接近SO组;caspase-3 mRNA表达在SAP组各时相点较SO组相应时相点明显增高[6 h:(0.78±0.01)vs.(0.55±0.04);12 h:(0.79±0.04)vs.(0.57±0.05);24 h:(0.81±0.06)vs.(0.55±0.01)(P<0.01)],而在IGF-Ⅰ组的表达与SAP组相应时相点比较则明显减弱,在12 h和24 h差异具有统计学意义(P<0.05):bcl-2 mRNA的表达在SO组和SAP组均较弱且差异无统计学意义,P>0.05,而在IGF-Ⅰ组各时相点的表达则明显增强[6 h:(0.65±0.07)vs.(0.54±0.04)vs.(0.57±0.06);12 h:(0.69±0.04)vs.(0.56±0.05)vs.(0.53±0.05);24 h:(0.72±0.05)vs.(0.54±0.07)vs.(0.58±0.08),P<0.05].结论 外源性IGF-Ⅰ通过拮抗SAP大鼠小肠黏膜上皮细胞的凋亡从而可以减轻SAP大鼠肠黏膜损害,其机制可能与其上调bcl-2 mRNA表达及下调bax,caspase-3 mRNA表达有关.     

低温对失血性休克炎症小体活化的影响研究

目的 探索治疗性低温对失血性休克(hemorrhagic shock,HS)大鼠肺组织炎症小体活化的影响.方法 本研究将24只SD大鼠随机(随机数字法)分成3组:假手术组,常温液体复苏(normothermia resuscitation,NR)组,低温液体复苏(hypothermia resuscitation,HR)组.各组通过股动脉放血到平均动脉压达40 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)保持1h建立HS模型,随后NR组和HR组通过液体复苏使平均动脉压达90 mmHg,维持1h,4h后通过放血处死各组大鼠,留取大鼠肺组织.经苏木精-伊红(HE)染色于光镜下观察肺组织的损伤程度,使用于湿比重法检测肺组织水肿情况,采用RT-PCR和Western blotting检测肺组织炎症小体NLRP-3、Caspase-1、IL-1βmRNA和蛋白表达水平.多组间比较采用方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义.结果 (1) HE染色结果示,与NR组相比,HR组急性肺损伤程度明显较低.(2)肺组织湿/干比重与HR组相比NR组肺水肿显著降低,HR组(5.85 ±0.10);NR组(6.47±0.17),t=3.14,P＜0.05;(3)与NR组相比,HR组的NLRP-3和Caspase-1的蛋白表达均显著减少;(4)与NR组相比,HR组的NLRP-3 mRNA表达水平显著降低,HR组(1.027±0.143),NR组(1.349 ±0.163),t=4.36,P＜0.05;HR组的IL-1β mRNA表达水平显著降低,HR组(1.623±0.125),NR组(2.388±0.229),t=7.72,P＜0.05.结论 治疗性低温能够降低炎症小体信号通路的活化,从而减弱HS诱导的肺组织损伤.     

卒中散对脑出血大鼠抓握能力的改善及血清S100B水平的影响

目的:探讨卒中散对脑出血大鼠抓握能力的改善及血清S100B水平的影响,为其临床应用提供理论依据。方法:40只SD大鼠随机分成假手术组、手术组、卒中散组、脑复康组,参照Rosenberg法制作大鼠脑出血模型,造模第2天测定大鼠抓握能力,用ELISA法检测造模后24h及48h血清S100B水平。结果:(1)卒中散组大鼠抓握能力明显好于手术组,两者比较有显著差异(P<0.05)。(2)卒中散组大鼠血清S100B水平明显低于手术组,两者比较有显著差异(P<0.05)。结论:卒中散能明显改善脑出血大鼠抓握能力,降低血清S100B水平,具有神经保护作用。     

大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达及意义继发性脊髓损伤适宜干预时间窗的选择

背景半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族被认为是细胞凋亡的执行因子,脊髓损伤后可发生神经细胞凋亡.目的观察大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化,探讨其与神经细胞凋亡发生的关系,为判定减轻继发性脊髓损伤的适宜干预时间窗提供依据.设计自身对照、相互对照动物实验.单位华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科、骨科.材料实验于2001-09/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成.54只SD大鼠,雌雄不限,体质量220～250g,由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供.方法①动物模型建立及分组将大鼠分为对照组和损伤组,对照组仅做Ts,T9椎板切除术,损伤组于4、8 h和1,2,3,7,14和21 d取材共9组,每组6只.以30 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉后,按Nystrom法暴露T8,T9节段胸髓,将50 g重物通过2.2 mm×5.0 mm弧型光滑金属垫片压迫该段脊髓后正中部5 min,损伤后每天1000,1600和2200 3次人工膀胱排尿,直至建立反射性膀胱排空.②取材及切片准备在脊髓损伤后各时间点完整取出脊髓全长,将每组4只损伤段脊髓组织块,长约8 mm,石蜡包埋,连续切片,分别行苏木素伊红染色、免疫组化及原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TdT-mediated dUTP-biotin nick endlabeling,TUNEL)标记;每组2只在冰上处死,将损伤脊髓中心组织置入液氮罐中保存备用.③检测指标以免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达,以逆转录-聚合酶链反应半定量测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA的表达变化,以TUNEL法检测神经细胞的凋亡水平,并以直线相关分析半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达和神经细胞凋亡的相关性.主要观察指标①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察.②免疫组化结果.③各组大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达变化.④各组大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡情况及与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达的相关性.结果纳入结果分析的各组动物数均为6只.①光镜下各组大鼠脊髓损伤观察结果损伤段1 h有广泛出血;4～8 h脊髓结构开始破坏,大量的神经元死亡;24 h脊髓破坏严重;7～21 d损伤范围确定,脊髓内有空洞形成.②免疫组化检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果正常大鼠脊髓神经细胞中很少有半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达(2.1±0.5);脊髓损伤后8 h,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达阳性的神经细胞明显增加(89.2±10.5),3 d达到高峰(189.6±12.7);半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的阳性细胞与凋亡细胞出现的时限相似,呈正相关(r=0.941).③逆转录-聚合酶链反应检测的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 mRNA 4 h开始增高(0.442±0.024),48 h达到高峰(0.634±0.028),7 d后恢复正常(0.351±0.013),早于凋亡出现的时期,与神经细胞凋亡水平呈正相关(~0.622).4④rUNEL标记及计数的各组大鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的结果对照组及4 h组仅见偶染细胞,8 h后开始出现阳性细胞,主要位于灰质中;此后阳性细胞逐渐增多,3 d达到高峰,7 d灰质中凋亡染色的阳性细胞逐渐减少,主要在周围白质中,14和21 d可见少量的阳性细胞.结论在正常的脊髓组织半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3是以活性很低的酶原形式存在;大鼠脊髓损伤后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达增强,8 h开始大量表达,24～48 h达到高峰,与TUNEL所检测的阳性凋亡细胞在时间上相重叠,从半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3阳性细胞先后出现的区域上看,与脊髓损伤阳性凋亡细胞一致,可见半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节.从本实验可以看出,从脊髓损伤后到半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活化这段时间是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗时间窗,应用基因干预或特异性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂宜在48 h内应用.     

促红细胞生成素对大鼠脑出血神经的保护作用

目的 研究促红细胞生成素(EPO)对脑出血神经保护作用的机制.方法 用立体定向技术,将自体小凝血注入大鼠尾状核区制备脑出血模型.110只Wistar雄性大鼠,随机分成四组:正常组、假手术组、ICH对照组、rhEPO治疗组.应用免疫组化及原位细胞凋亡检测脑出血灶周组织Bcl-2、Bax表达及凋亡细胞.统计学方法采用LSD-t检验及Pearson相关分析.结果 ICH对照组及rhEPO治疗组术后6 h血肿周围皮质TUNEL,Bcl-2,Bax阳性细胞明显增加,72 h达到高峰,120 h下降,各时间点与假手术组比较,差异具有统计学意义(P<0.01).rhEPO治疗组TUNEL、Bax阳性细胞数明显少于同时点ICH对照组(P<0.01),但Bcl-2阳性细胞数明显增加(P<0.01).Bax蛋白表达及Bax/Bcl-2均与细胞凋亡呈正相关(P<0.01).结论 凋亡机制参与脑出血后继发性损伤过程,EPO通过上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,对脑出血后神经损伤起保护作用.     

脓毒症大鼠肺高迁移率族蛋白B1的表达及意义

目的 观察创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织HMGB1表达和肺损伤的动态变化,并探讨HMGB1在创伤弧菌脓毒症肺损伤中作用.方法 温州医学院生命科学院实验室,清洁级SD大鼠60只,随机分为正常组(A组,n=10)和创伤弧菌脓毒症组(B组,n=50),采用大鼠左下肢皮下注射创伤弧菌悬液(浓度为6×108cfu/mL,剂量为0.1 mL/100 g)制作大鼠创伤弧菌脓毒症模型),B组于染菌后1、6、12、24、48 h后活杀(各时间点n=10),采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测大鼠肺组织HMGB1基因与蛋白的表达,检测肺含水分数和光镜观察肺组织病理变化,数据采用单因素方差分析,并用LSD法进行组间两两比较,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 B组染菌后12 h(1.161±0.358,P=0.013)、24 h(1.679±0.235,P=0.000)及48 h(1.258±0.274,P=0.004)大鼠肺组织HMGB1 mRNA表达量较A组(0.652±0.177)明显增高(P＜0.05),并于24 h达到高峰;与A组(0.594±0.190)比较,B组HMGB1蛋白表达量于感染后6 h(1.408±0.567,P=0.026)(P＜0.05)逐渐增加,24 h达到高峰(2.415±1.064,P=0.000);与A组(0.699±0.054)比较,B组大鼠肺含水分数于感染后6 h(0.759±0.030,P=0.001)、12 h(0.767±0.023,P=0.000)、24 h(0.771±0.043,P=0.000)和48 h(0.789±0.137,P=0.000)明显增大(P＜0.05),呈逐渐递增趋势;感染后12 h,大鼠肺内血管明显充血,间质水肿并伴炎性浸润,且逐渐加重,到48 h肺泡腔塌陷明显,肺泡间隔分界不清.结论 大鼠创伤弧菌脓毒症可导致肺脏损伤,HMGB1的表达增加可能是创伤弧菌脓毒症大鼠肺组织损伤的机制之一.

Abstract：

Objective To observe the dynamic changes of high mobility group protein B1 ( HMGB1 )expression in the lung of rats with Vibrio vulnificus sepsis so as to unravel the role of HMGB1 in lung injury.Methods Sixty rats of clean grade were randomly divided into normal control group ( A group, n = 10) and Vibrio vulnificus sepsis group (B group, n =50). Sepsis model was made in rats with subcutaneous injection of Vibrio vulnificus with concentration of 6 × 108 cfu/ml in dose of 0. 1 ml/100 g into left lower limb.The rats of group B were sacrificed 1 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h after infection for taking lung tissues to detect the water content of lung and to observe the histopathological changes in lung under light microscope.The expression of HMGB1 mRNA and the level of HMGB1 protein in the lungs were detected by RT-PCR and Western blot, respectively. Data were analysed with ANOVA and LSD method for comparison between groups, and P ＜0.05 was considered statistically significant. Results Compared with the group A (0.652±0. 177), the expressions of HMGB1 mRNA in lung of rats of group B were significantly higher in 12 hours (1. 161 ±0.358, P=0.013), 24 hours (1.679 ±0.235, P =0.000) and 48 hours (1.258 ±0.274, P=0.004) and reached the peak in 24 h. Compared with group A (0.594 ±0. 190), the level of HMGB1 protein in rats of group B 6 h after infection ( 1. 408 ± 0. 567, P = 0. 026) was significantly increased (P＜0.05), and it reached peak in 24 h (2.415 ± 1.064, P =0.000) after infection. Compared with group A (0.699 ± 0.054), the lung water contents in rats of group B were significantly increased in 6 h (0.759±0.030, P=0.001), in 12 h (0.767 ±0.023, P =0.000), in 24 h (0.771 ±0.043, P=0.000) and in 48 h (0.789 ±0.137, P=0.000) after infection. Compared with group A, the pathological changes in the lung of rats in group B showed clearly marked pulmonary vascular congestion, interstitial edema and inflammatory cell infiltration, and those changes became more and more serious until alveolar sacs entirely collapsed and the boundaries of the alveolar septa could not be clearly identified in 48 h. Conclusions Vibrio vulnificus sepsis leads to the lung injury of infected rats, and the increase in the expression of HMGB1 mRNA in lung might be one of the mechanisms of lung injury in rats with Vibrio vulnificus sepsis.     

NG-硝基-L-精氨酸对脂多糖诱导大鼠肺损伤时肺表面活性物质和细胞凋亡的影响

目的 探讨NG-硝基-L-精氨酸(L-NA)对内毒素性肺损伤大鼠肺表面活性物质(PS)和细胞凋亡的影响.方法 雄性SD大鼠24只,按随机数字表法均分为对照组、模型组、L-NA治疗组.模型组、L-NA治疗组舌下静脉注射脂多糖(LPS)复制内毒素性肺损伤模型;对照组给予等量生理盐水.L-NA治疗组于注射LPS 3 h后给予L-NA 20 mg/kg;对照组和模型组给予等量生理盐水.6 h后处死动物,取肺组织,用原位杂交法测定肺组织表面活性物质相关蛋白A(SP-A)mRNA表达;用流式细胞术检测肺组织细胞凋亡率;用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)蛋白表达;用免疫组化法测定Bcl-2和Bax蛋白表达.结果 与对照组比较,模型组SP-A mRNA表达[吸光度(A)值]明显下降(0.071±0.017比0.113±0.021),细胞凋亡率[(25.04±4.57)%比(11.37±3.08)%]、caspase-3蛋白表达(A值:298.64±37.11比110.24±14.35)、Bax蛋白表达(A值:0.145±0.011比0.076±0.010)明显升高,Bcl-2蛋白表达(A值:0.064±0.011比0.073±0.009)和Bcl-2/Bax比值(0.447±0.086比0.976±0.157)明显下降(均P<0.01).与模型组比较,L-NA治疗组SP-A mRNA表达(A值:0.085±0.015)和Bcl-2蛋白表达(A值:0.070±0.087)明显增强(P<0.01和P<0.05),但细胞凋亡率[(20.67±1.35)%]、caspase-3蛋白表达(A值:268.75±42.56)、Bax蛋白表达(A值:0.142±0.012)和Bcl-2/Bax比值(0.498±0.069)均无明显变化(均P>0.05).结论 L-NA不通过抑制肺细胞凋亡来减轻内毒素性肺损伤的程度,对调节凋亡相关基因caspase-3和Bax也无明显影响;而是可通过增强PS表达减轻内毒素性肺损伤.