兔关节软骨细胞在藻酸盐凝胶中体外培养

目的 观察体外藻酸盐凝胶三维立体支架培养软骨细胞的生长情况.方法 从2周龄兔关节表面切取软骨,经酶消化获得软骨细胞.在单层培养条件下增殖至P2代,转入藻酸盐凝胶中进行三维培养.通过倒置显微镜观察、DNA含量的测定、细胞组织化学及免疫组化染色,了解软骨细胞生长情况.结果 在藻酸盐凝胶中软骨细胞活性良好,增殖活跃,Ⅱ型胶原免疫组化和藩红O染色均呈阳性.结论 在该培养体系中有利于软骨细胞的表型维持.     

兔髁状突软骨细胞藻酸盐凝胶三维培养体系的建立

目的:建立兔髁状突软骨细胞的藻酸盐凝胶三维培养体系.方法:利用机械与酶消化的方法获得均一性的兔髁状突软骨细胞,在二维贴壁培养条件下增殖至P2代;将P2代细胞高密度条件下转入藻酸盐凝胶培养介质,进行三维培养;分别对培养细胞凝胶微球行石蜡包埋与树脂包埋切片,对三维培养条件下的软骨细胞行组织化学、免疫组织化学检测和超微结构观察.藻酸盐凝胶三维体系培养6周后,以EDTA分解凝胶,收获培养的软骨细胞,免疫组化法检测三维体系中收获的软骨细胞的蛋白合成能力.结果:藻酸盐凝胶三维培养体系中的髁状突软骨细胞生长状态良好;培养6周后从凝胶体系中收获细胞的软骨特异性功能蛋白表达水平较转入三维体系前未见降低,培养细胞保持了良好的分化表型.结论:成功地建立了髁状突软骨细胞的藻酸盐凝胶三维培养体系,在该体系中,软骨细胞生长状态与功能蛋白分泌能力良好.     

肝细胞生长因子对兔关节软骨细胞培养影响的实验研究

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对兔关节体外培养软骨细胞的作用.方法取10只大耳白兔的关节软骨制成软骨细胞悬液,接种到DMEM培养基中培养,细胞传至第3代后,加入不同浓度的HGF继续培养.通过MTT比色法及流式细胞仪技术检测培养细胞增殖情况.结果 HGF使软骨细胞增殖明显加快(P<0.05),HGF的作用存在剂量效应关系.不同浓度的HGF对关节软骨细胞增殖的促进作用不同,1 ng/ml时对细胞分裂增殖效应有作用,5～10 ng/ml作用效果最明显,加大HGF浓度,并未见促增殖效应加强.结论HGF对关节软骨细胞有明显促增殖作用.     

TGF-β1与IGF-Ⅰ对体外培养兔软骨细胞增殖的影响

目的探讨转化生长因子-β 1(TGF-β 1)与胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)联合作用对关节软骨细胞增殖行为的影响.方法采用兔关节软骨细胞体外单层培养方法,将TGF-β 1与IGF-Ⅰ作用于软骨细胞,并用MTT比色分析法对其增殖行为进行分析,探讨多因子对关节软骨细胞增殖行为的影响.结果(1)TGF-β 1组的最佳效应浓度为5 μg/L,IGF-Ⅰ组的最佳效应浓度为50 μg/L.(2)TGF-β 1组(5 μg/L)、IGF-Ⅰ组(50 μg/L)以及两因子联合使用组软骨细胞增殖均较对照组高(P＜0.01),联合使用组促增殖作用最强,优于单一的TGF-β 1最佳效应浓度组和IGF-Ⅰ最佳效应浓度组(P＜0.05).结论TGF-β 1与IGF-Ⅰ联合运用早期促软骨细胞增殖作用优于单一的TGF-β 1或IGF-Ⅰ,在软骨细胞增殖过程中TGF-β 1和IGF-Ⅰ有良好的协同作用.     

IGF-1对成兔关节软骨细胞体外增殖的影响

目的研究单独应用胰岛素样生长因子1(IGF-1)对成兔的关节软骨细胞体外增殖的促进作用,为成人关节软骨的体外培养扩增的理论提供新思路。方法通过细胞形态学,细胞计数、细胞计量检测成兔关节软骨细胞的存活及增殖。结果成兔关节软骨细胞增殖活跃。结论在IGF-1的单独作用下成兔关节软骨细胞在体外增殖能力明显增强。     

生长因子(IGF-I、TGF-β1和BMP-2)对兔关节软骨细胞体外增殖的作用

目的观察IGF-Ⅰ、TGF-β1和BMP-2对培养兔关节软骨细胞增殖的作用.方法采用体外培养兔关节软骨细胞的方法,利用3H-TdR掺入反映软骨细胞增殖.结果 IGF-Ⅰ和TGF-β1均可促进软骨细胞3H-TdR掺入增加,并有一定的协同作用.而BMP-2对软骨细胞3H-TdR掺入无显著影响,但与TGF-β1和IGF-Ⅰ合用时却有抑制3H-TdR掺入的作用.结论生长因子之间的不同组合可以协同或拮抗方式影响软骨细胞的增殖,提示生长因子在关节软骨退变和防治上可能有重要的意义.     

bFGF、IGF-Ⅰ对兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响

目的：研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insuline-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）单独及联合应用对体外培养多次传代的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达的影响。探讨传代多次的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞的可行性。方法：第3、5、7代体外培养的兔关节软骨细胞，以常规培养组作为对照组，bFGF（5ns／m1）或和IGF-Ⅰ（100ng/ml）单独刺激及联合刺激作为实验组，免疫组化法测定Ⅱ型胶原的定性表达，并通过图像分析作半定量分析。结果：对照组细胞第5代以后无阳性表达。第3、5、7代细胞在bFGF或IGF-Ⅰ刺激下。Ⅱ型胶原表达强度显著高于对照组（P〈0．01）；bFGF和IGF-Ⅰ联合作用下，Ⅱ型胶原表达强度均显著高于单独以bFGF或IGF-Ⅰ刺激组（P〈0．05）。结论：bFGF、IGF-Ⅰ能促进多次传代软骨细胞Ⅱ型胶原的表达，且联合应用时促进作用更为明显。多次传代软骨细胞在生长因子刺激下，仍有再分化的能力。而有成为软骨组织工程种子细胞的可能。     

兔椎间盘纤维环细胞单层和立体培养条件下细胞表型的比较

目的 观察单层培养和藻酸盐立体培养对兔椎间盘纤维环细胞基因表达的影响.方法 10只新西兰大白兔腰椎椎间盘纤维环细胞经体外单层培养扩增后取第一代细胞分别同时行单层培养和藻酸盐立体培养1周,通过实时RT-PCR检测细胞Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因不同的表达情况.结果 在相差显微镜下,单层培养的椎间盘纤维环细胞呈贴壁生长的梭形或多角形细胞,其Ⅰ型胶原基因表达最高,Ⅱ型胶原基因表达其次,蛋白聚糖基因表达最低,符合成纤维细胞的细胞表型.而在藻酸盐凝胶珠内,同样的纤维环细胞呈圆形,被一层藻酸盐凝胶膜囿于凝胶珠内,其Ⅰ型胶原,Ⅱ型胶原基因表达明显下降,而蛋白聚糖基因明显升高,成为该培养条件下纤维环细胞表达最高的基因.结论 藻酸盐立体培养对兔椎间盘纤维环细胞维持软骨样细胞基因表型具有一定作用.     

IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响

目的 探讨IL-6对体外培养的兔软骨终板细胞生物学行为的影响.方法 分离培养兔软骨终板细胞,通过甲苯胺兰染色等方法鉴定后,分别加入不同浓度的IL-6,MTT法测定不同时间点软骨终板细胞增殖活性的变化;流式细胞仪检测软骨终板细胞生长周期的变化;RT-PCR检测蛋白聚糖、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化.结果 10、50、100 ng/ml IL-6对软骨终板细胞的增殖无影响,50 ng/ml IL-6对软骨终板细胞细胞周期无影响,10、50 ng/ml IL-6均对Aggrecan mRNA的表达无影响,仅50 ng/ml浓度时IL-6可降低Collagen Ⅱa mRNA的表达.结论 较大剂量IL-6时可抑制软骨终板基质合成,从而促进椎间盘的退变.     

体外构建可注射性组织工程软骨的初步研究

目的利用关节软骨细胞复合壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerophosphate, C/GP)凝胶,体外构建可注射性组织工程软骨,为微创方式治疗关节软骨缺损提供依据.方法以体外培养扩增的兔关节软骨细胞为种子细胞,以自制温固化可注射C/GP凝胶为支架,按5×107/ml细胞浓度复合体外培养.于倒置显微镜下观察细胞形态与分布,四甲基偶氮唑盐(MTT)法计算培养1周时种子细胞存活率,培养4周时样本进行组织学及扫描电镜观察.结果软骨细胞在7:1(体积分数)C/GP凝胶中保持球形,细胞存活率95%以上;HE染色可见软骨较为典型的陷窝样结构、软骨囊及同源细胞群等现象;甲苯胺蓝异染及免疫组化Ⅱ型胶原染色呈强阳性.结论软骨细胞在C/GP凝胶中可存活并保持分泌软骨基质的功能,形成类软骨组织.温固化可注射性C/GP凝胶能作为软骨组织工程的载体材料.     

深低温保藏软骨细胞的胶原凝胶立体培养

目的研究经深低温保藏后软骨细胞在胶原凝胶载体中的生长特性。方法取4周新西兰兔关节软骨,经分离成软骨细胞悬液后,置于深低温保藏。2月后,复苏被冻存的软骨细胞,包埋于含小牛血清和DMEM的胶原凝胶中培养,通过组织化学和透射电镜观察进行分析。结果与新鲜软骨相同,经深低温保藏的软骨细胞,复苏后包埋在胶原凝胶中培养7d,见单个的软骨细胞形成增殖的两个或两个以上的同源细胞,细胞周围集聚异染性细胞外基质。结论经深低温保藏的软骨细胞,在胶原凝胶中培养,仍保持了分裂增殖和合成细胞外基质的能力,可作为种子细胞,供组织工程修复软骨组织。     

深低温保藏软骨细胞的胶原凝胶立体培养

目的：研究经深低温保藏后软骨细胞在胶原凝胶载体中的生长特性。方法取4周新西兰兔关节软骨,经分离成软骨细胞悬液后,置于深代温保藏。2月后,复苏被冻存的软骨细胞,包埋于含小牛血清和DMEM的胶原凝胶中培养,通过组织化学和透射电镜观察进行分析。结果与新鲜软骨相同,经深低温保藏的软骨细胞,复苏后包埋在胶原凝胶中培养7d,见单个的软骨细胞形成增殖的两个或两个以上的同源细胞,细胞周围集聚异染性细胞外基质。论经深低温保藏的软骨细胞,在胶原凝胶中培养,仍保持了分裂增殖和合成细胞外基质的能力,可作为种子细胞,供维修组组织工程修复软骨组织。     

骨关节炎Ⅰ号方对兔软骨细胞增殖及Fas、Bcl-2表达的调节作用

探讨骨关节炎Ⅰ号方对软骨细胞增殖及对Fas、Bcl-2表达的调节作用。取3～4周兔关节软骨，经胶原酶Ⅱ消化，建立软骨细胞体外培养体系，加入不同浓度骨关节炎1号方溶液，用MTT比色法检测其OD值变化：用流式细胞仪检测软骨细胞Fas Bcl-2的表达。结果：100mg／ml、50mg／ml骨关节炎Ⅰ号方组OD值显著高于正常对照组。10mg／ml组与正常对照组无显著差异；加入150mg／ml浓度骨关节炎Ⅰ号方培养4h时，软骨细胞Fas、Bcl-2表达显著高于正常对照组。结论：100mg／ml、50mg／ml浓度骨关节炎Ⅰ号方具有促进软骨细胞增殖作用。150mg／ml浓度骨关节炎Ⅰ号方具有促进软骨细胞Fas和Bcl-2表达作用。     

FGF对关节软骨细胞基质及其TGFβ1表达的作用

目的:观察成纤维细胞生长因子(FGF)对培养兔关节软骨细胞基质及转化生长因子β1(TGFβ1)表达的影响.方法:培养1月龄新西兰兔关节软骨细胞,在每次换液时加入FGF 100 ng/ml,铺满后收集细胞,作关节软骨细胞TGFβ1检测及电镜免疫组织化学观察.采用氯胺T法和Antonopoulos法,作细胞基质的胶原和蛋白多糖含量测定.结果:FGF能明显促进胶原和蛋白多糖的合成,并且与剂量、时间呈正相关(P＜0.01).光镜下实验组细胞明显呈棕色,电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒粘附.结论:FGF能促进关节软骨细胞TGFβ1的表达及基质合成,推迟了关节软骨细胞的成熟,维持细胞的软骨表现型,这些作用有利于关节软骨损伤后的修复,可能具有一定的临床意义.     

地塞米松磷酸钠对兔关节软骨细胞体外培养的影响

目的探讨地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞的影响。方法兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不合地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同浓度地塞米松磷酸钠的DMEM培养液,应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖情况及其合成Ⅱ型胶原能力,并应用透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化。结果实验各组软骨细胞进入S期、G2＋M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G0／G1期的细胞比率增加,免疫细胞化学阳性信号的平均灰度值与对照组平均灰度值的差异均有显著性,电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少。结论地塞米松磷酸钠可抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白合的合成能力有关。     

参麦注射液对体外培养软骨细胞增殖的影响

目的 探讨参麦注射液对软骨细胞增殖的影响。方法 运用关节软骨体外培养方法，设立空白对照与IGF—Ⅰ药物对照组，采用MTF比色法观察不同浓度参麦注射液对软骨细胞增殖情况。结果 参麦注射液与生长因子IGF—Ⅰ均可促进软骨细胞增殖，同空白对照组相比差异有非常显著性（P〈0．01），其中5％参麦液组同浓度为5ng／ml的IGF—Ⅰ组作用效果相当（P〉0．05）。结论 参麦注射液可促进软骨细胞的合成代谢，减少其分解代谢，从而减轻关节软骨的退变，延缓OA的进展。     

IGF-Ⅰ对体外培养的大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性的影响

为探讨矫形治疗中髁突软骨增殖活性变化的机理,本研究采用流式 细胞术 检测胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)对体外培养的大鼠下颌髁突软骨细胞增殖活性的 影响。结 果显示,IGF-Ⅰ直接作用于培养的髁突软骨细胞24小时及96小时后,实验各组细胞的增殖 指 数（PI）均大于对照组（42.0±0.29及11.4±0.37）,其中以100ng/ml组增大最多（48.9± 0.29及23.6±0.29）;而作用96小时后各实验组的PI较对照组增高 幅度更大。以上提示,IGF-Ⅰ是大鼠下颌髁突软骨细胞的促有丝分裂因子,其作用存在延 迟效应。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

趋化素样因子1(CKLF1)对关节软骨细胞增殖及代谢的影响

目的：研究趋化素样因子1(CKLF1)对兔关节软骨细胞增殖及代谢的调节作用。方法：采用体外细胞培养技术及同位素参入法，检测CKLF1真核表达载体转染293T细胞所得条件培养基对软骨细胞DNA、胶原及蛋白多糖合成能力的影响。结果：在含5％(体积分数)胎牛血清(FCS)的DMEM培养条件下，转染后293T细胞表达的CKLFl可抑制兔关节软骨细胞DNA、胶原及蛋白多糖的合成，并可促进诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的转录。结论：CKLF1可能通过提高iNOS的表达抑制关节软骨细胞增殖、胶原及蛋白多糖的合成。     

碱性成纤维细胞生长因子对国产多孔钽-软骨细胞复合物软骨细胞表型维持及去分化的影响

目的 对比不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对国产多孔钽-软骨细胞复合物维持软骨细胞表型和去分化作用的影响.方法 分离培养3周龄新西兰幼兔膝关节软骨细胞,Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色、番红O (Safranin O)染色鉴定软骨细胞;取第3代软骨细胞分为5组:A组(1 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞),B组(10 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞),C组(50 ng/mL bFGF-多孔钽软骨细胞),D组(多孔钽-软骨细胞)及E组(软骨细胞);MTT法检测不同浓度bFGF对多孔钽-软骨细胞生长及增殖状态的影响;扫描电镜观察bFGF-多孔钽-软骨细胞复合物细胞形态及生长;Ⅰ、Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ型胶原免疫细胞化学染色检测软骨细胞表型变化及去分化状态;real time-PCR检测软骨细胞Ⅱ、Ⅹ型胶原mRNA表达.结果 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色及Safranin O染色均呈阳性反应,证实所分离培养的细胞为软骨细胞;1、10、50 ng/mL bFGF均可促进软骨细胞增殖,各实验组(A～D组)软骨细胞增殖与对照组(E组)相比,差异有统计学意义,其中10 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞增殖最为明显(P＜0.05);组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);扫描电镜观察:各组软骨细胞在多孔钽表面及孔隙内生长、黏附,早期呈不等的球形,24 h后胞质延展并向周围伸出多条突起,相互连接、延展向孔隙内部生长,细胞间相互融合并覆盖支架材料;Ⅰ、Ⅱ、Ⅸ和Ⅹ型胶原免疫细胞化学染色显示10 ng/mL bFGF-多孔钽-软骨细胞组(B组)Ⅱ和Ⅸ型胶原表达高于对照组(E组,P＜0.05),组间差异也有统计学意义(P＜0.05);而Ⅰ和Ⅹ型胶原表达则低于对照组(E组,P＜0.05);real time-PCR检测软骨细胞Ⅱ、Ⅹ型胶原mRNA表达显示:各实验组(A～D组)Ⅱ型胶原mRNA的表达高于对照组(E组,P＜0.05),而Ⅹ型胶原mRNA表达量则低于对照组(E组,P＜0.05).结论 bFGF能维持多孔钽-软骨细胞复合物软骨细胞表型,抑制去分化,加强软骨细胞分泌功能.