胰蛋白酶法和Triton X-100法脱猪软骨细胞的比较

背景：作为修复软骨缺损的一种材料，脱细胞软骨基质已受到越来越多研究者的关注，但是制备脱细胞软骨基质的两种主要方法其脱细胞效果孰优孰劣尚不清楚。 目的：对比胰蛋白酶法和Triton X-100法脱猪关节软骨细胞的效果。 设计、时间及地点：对比观察，于2008-03/07在山西医科大学第二医院骨科中心实验室完成。 材料：新鲜猪膝、髋关节软骨市场上购得。 方法：选取新鲜猪关节软骨片分别置入2.5 g/L胰酶溶液和2.5 g/L Triton X-100溶液中脱细胞处理，并以未经处理的新鲜软骨片作对照。 主要观察指标：①大体观察脱细胞后关节软骨的外观形态。②免疫组织化学染色及扫描电镜下观察两种脱细胞方式对细胞外基质胶原的影响。③每组随机选取10片软骨片进行加载、卸载试验和拉断试验，测定断裂强度和断裂拉伸率。 结果：①经过两种方法脱细胞后，软骨脱细胞基质在外观上与未脱细胞软骨差别甚微，只是颜色较软骨略白，触摸较未脱细胞基质柔软。②免疫组织化学染色及扫描电镜可见，胰酶法和Triton X-100法均彻底脱去了关节软骨上的细胞成分，胰酶法观察到胶原排列有序，纹理清晰，可见胰酶在脱细胞的同时对细胞外基质没有明显的破坏；Triton X-100法观察到胶原仍比较多，但纹理结构有些紊乱，可能是Triton X-100法脱细胞对细胞外基质进行了破坏。③新鲜关节软骨组、胰酶组和Triton X-100组断裂强度和断裂拉伸率相比，差异均无显著性意义。 结论：两种方法均彻底脱去了关节软骨上的细胞成分，脱胰酶法脱猪关节软骨细胞的方法作用时间较短，胶原保存好，且成本较低。Triton X-100法脱细胞步骤较多，时间较长，对胶原结构有轻微的破坏，但对软骨的力学性能没有显著影响。     

40000/改良酶学方法获得异种血管脱细胞支架的实验研究

目的 研究采用改良的酶学方法处理异种血管,体外获得异种脱细胞血管支架。方法 取猪的颈动脉作为基质,利用Triton和酶学方法进行脱细胞处理,采用改良的酶学方法,体外获得异种脱细胞血管支架,并且对脱细胞支架材料进行力学和组织生物相容性实验评价与鉴定。结果：应用Triton X-100、氢氧化铵和胰蛋白酶顺序处理及其改良的方法,通过改变胰蛋白酶处理时间的方法,成功脱除猪颈动脉细胞成分,获得较好的孔径和孔隙率的脱细胞支架。结论 并通过延长胰蛋白酶处理时间的方法后得到的脱细胞血管基质,具有良好的孔径和孔隙率。支架在生物力学、孔隙率、生物相容性方面符合构建组织工程血管支架的要求。     

胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化获取关节软骨细胞*

背景：近年来，众多研究欲采用体外分离培养的关节软骨细胞作为修复缺损的关节软骨的种子细胞，然而，获得纯化的具有生物活性的关节软骨细胞较为困难。 目的：拟运用胰蛋白酶与Ⅱ型胶原酶联合消化获取关节软骨细胞。 方法：从SD大鼠的正常股骨及胫骨关节表面获取关节软骨，先后运用0.25%的胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶消化，显微镜下见大量细胞游离后，弃去大块的未消化的关节软骨碎片，离心，去上清，PBS洗涤2次后，加入软骨细胞原代培养液进行培养、增殖。应用甲苯胺蓝及苏木精-伊红染色方法检验所得细胞是否为关节软骨细胞。 结果与结论：在严格掌握酶的浓度及消化时间的前提下，通过0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型胶原酶联合酶解关节软骨的方法，成功从大鼠股骨及胫骨关节软骨内分离培养出细胞，并经过甲苯胺蓝染色及苏木精-伊红染色证实，所得的细胞为具有生物活性的关节软骨细胞。 关键词：关节软骨细胞；Ⅱ型胶原酶；胰蛋白酶；联合消化；甲苯胺蓝；苏木精-伊红染色     

兔肋软骨脱细胞基质的制备

摘要 背景：研究表明新西兰兔软骨组织可作为组织工程支架材料,其中关节软骨及耳软骨的脱细胞基质的研究较多,但采用肋软骨作为组织工程软骨支架的研究较少。 目的：制备新西兰兔肋软骨脱细胞基质,探讨天然软骨支架作为组织工程支架的可行性。 方法：用联合去垢剂-酶法获得软骨支架,根据脱细胞过程中Triton X-100第2次处理时间0,24,48,96 h分为4组。脱细胞完毕后各组支架固定行扫描电镜采集图像观察计算支架孔隙率、孔径长度,并对支架进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,并将脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下观察其相容性。 结果与结论：兔肋软骨脱细胞基质呈乳白色,大小均一,染色示支架结构完整,仍保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型胶原成分,扫描电镜观察经一定时间的脱细胞处理后可得到结构完整,孔隙均匀的天然软骨支架,其孔隙率为(61.31±8.45) %;孔径长度为(32.80±5.15) μm,符合正态性分布,各组脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下7 d后生物相容性良好,周围软组织无明显充血、化脓等炎症排斥反应出现。结果显示,兔肋软骨脱细胞支架具有良好的基质组成,有较完整、均匀的孔隙结构及孔径分布,可作为组织工程支架材料。 关键词：软骨;脱细胞;支架;生物相容性;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.16.008     

关节软骨细胞外基质源性软骨组织工程取向支架的制备

背景：仿生天然软骨细胞外基质特殊的力学、结构特性和生化成分的软骨组织工程支架具有巨大的应用潜能。 目的：观察仿生天然关节软骨细胞外基质的生化和结构特性,探讨关节软骨细胞外基质材料及软骨组织工程取向支架的制备方法,并对其理化性质进行检测。 设计、时间及地点：组织工程材料支架制备及性能分析的体外实验,于2007-07/2008-07在解放军总医院骨科研究所完成。 材料：将新鲜猪关节软骨湿法粉碎,差速离心,收集无细胞的软骨细胞外基质成分。脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺均为美国Sigma公司产品。 方法：对关节软骨细胞外基质材料进行组织学和形态学检测后,用pH3.2的稀盐酸制成质量浓度为20 g/L溶液,采用定向结晶及冷冻干燥技术制成关节软骨细胞外基质源性取向支架,再采用物理化学方法交联,同时制备多孔软骨细胞外基质源性非取向支架。 主要观察指标：①关节软骨细胞外基质材料的生化组成和形态。②软骨细胞外基质取向支架和非取向支架的表面特征及孔道结构。③取向和非取向软骨细胞外基质支架的孔隙率、吸水膨胀率、力学特性的比较。 结果：收集的关节软骨细胞外基质材料中无细胞存在,纤维为纳米尺度,甲苯胺蓝、番红花O、奥新蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性;制备的取向支架具有纵向排列的孔道结构,孔径100~200 μm,分布均匀,非取向支架的孔呈海绵样结构;两种支架孔隙率均≥ 95%,吸水膨胀率均≥ 96%。取向支架纵向压缩模量和拉伸模量为：（2.02±0.02）,（22.10±0.67）MPa,均大于非取向支架,差异具有统计学意义(P < 0.05)。 结论：天然关节软骨细胞外基质材料与天然关节软骨的生物力学特性相似,可满足软骨组织工程的需要,是一种比较理想的软骨组织工程支架。     

转化生长因子β1与软骨源性形态发生蛋白1修复关节软骨缺损

背景：研究表明，转化生长因子β1在诱导软骨分化和维持软骨表型上起着重要作用，骨形态发生蛋白具有促进祖母细胞聚集及向软骨细胞的分化,使去分化的软骨细胞重新恢复表型。 目的：验证转化生长因子β1与软骨源性形态发生蛋白1在修复关节软骨缺损中的作用。 设计：分组对照动物实验。 材料：软骨源性形态发生蛋白1、转化生长因子β1为PEPROTECH公司产品；健康4~6个月青紫蓝兔30只。 方法：选用青紫蓝兔30只，共60个关节，相同方法制备关节软骨直径4 mm的全层软骨缺损模型，随机分成3组，每组20个关节。转化生长因子β1组、注射软骨源性形态发生蛋白1组、生理盐水对照组，分别于术后2~6周关节腔内相应注射100 μg/L转化生长因子β1、100 μg/L软骨源性形态发生蛋白1和生理盐水各1 mL，1次/周。 主要观察指标：分别于术后12周，在各组动物软骨缺损区取材，行大体观察、光镜观察及大体评分和组织学评分。 结果：大体及组织学观察显示:转化生长因子β1组修复组织高度、质地、颜色接近于正常软骨。缺损处被成熟、新生类软骨细胞修复，排列较整齐，与软骨下骨结合紧密。软骨源性形态发生蛋白1组与转化生长因子β1组基本一致。生理盐水对照组修复组织覆盖面积、高度不完全，质韧不透明。大体评分和组织学评分表明：转化生长因子β1组和软骨源性形态发生蛋白1组修复结果良好，两组之间差异显著性意义(P > 0.05)，均优于生理盐水对照组(P < 0.05)。 结论：转化生长因子β1、软骨源性形态发生蛋白1都具有较强的修复软骨能力，是修复关节软骨缺损的良好的生长因子，而软骨源性形态发生蛋白1较转化生长因子β1价格较低，无骨软骨赘和正常关节软骨的退变，在临床应用及基础研究更为理想。     

以Triton X-100和脱氧胆酸钠为萃取剂制备兔脱细胞神经基质：有最佳时间吗？**

背景：与其他脱细胞神经基质制备方法相比,化学萃取的去细胞同种异系(体)神经组织内细胞成分可以较完全地清除,进一步减少了发生免疫排斥反应的可能性,并能较好地保留神经支架的完整性,但制备过程中的相关问题有许多尚需讨论。 目的：应用Triton X-100和脱氧胆酸钠化学萃取剂处理新西兰大白兔的面神经,提出脱细胞神经基质制备的所需试剂及最佳时间。 设计、时间及地点：随机分组,对比观察细胞学实验,于2009-02/06在滨州医学院附属医院口腔科学实验室完成。 材料：3月龄新西兰大白兔15 只,体质量2.5~3.0 kg。Triton X-100、脱氧胆酸钠由美国Sigma 公司提供。 方法：取兔双侧面神经,在手术显微镜下去除神经表面的脂肪组织和神经外膜,将其分为每段10 mm长,共66条。将66条神经随机分成11 组,每组6条。除正常对照组外,其余10 组均放入培养皿中,先用蒸馏水室温下浸浴12 h ,以使细胞和髓鞘在低渗液体中膨胀,使部分细胞被胀破;然后将其中5组置于3% Triton X-100 12,24,36,48,60 h,室温下振荡,另外5组用3%Triton X-100和4%脱氧胆酸钠先后作用12 h(为1个周期),室温下反复振荡1~5个周期。 主要观察指标：常规苏木精-伊红染色,光镜下观察去细胞程度及纤维管道结构的完整性。 结果：单独应用Triton X-100处理神经即使作用60 h,仍不能将神经中的所有细胞成分去除,且许旺细胞基底膜有较大破坏;Triton X-100配合脱氧胆酸钠处理处理2个周期,可有效地去除神经中的细胞成分及神经纤维髓鞘和轴突,保留完整的许旺细胞基底膜,周边可见神经外膜和束膜。 结论：大白兔面神经经 Triton X-100和脱氧胆酸钠室温处理2个周期,并不停地振荡,可完全去除神经组织中的所有细胞成分,保留完整的许旺细胞基底膜,得到脱细胞的神经基质。 关键词：脱细胞神经;制备条件;基质 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.47.007     

不同比例壳聚糖胶原复合骨、软骨缺损支架材料的制备及性状比较

摘要 背景：骨组织工程支架材料由最初的自体骨,软骨材料到生物活性陶瓷,乃至后来的有机材料胶原蛋白等细胞外基质材料,其生物相容性及性能越来越优越,越来越接近体内的真实情况。但是这些材料在抗压性及强度方面还有待进一步提高。 目的：应用胶原与壳聚糖制备生物支架并对其检测其生物学性质,为骨、软骨缺损提供移植替代物。 方法：将不同比例壳聚糖-胶原蛋白溶解,经冷冻冻干后紫外线交联后冷冻干燥,二次冻干制备好支架。检测不同比例支架的孔隙率,降解率,溶胀率。扫描电镜观察孔径的大小及形态。 结果与结论：制备的支架外观呈海绵多孔状。支架的孔径大小随着胶原比例增加而减小。胶原比例的增加对支架孔隙率的影响较轻微。支架的溶胀率可达到80%左右,支架的溶胀程度随胶原比例增加而减少。胶原含量越大支架柔韧度增加明显。支架的降解率随着胶原比例增加而增加,而壳聚糖含量越高,降解速度越慢。结果提示,通过调整壳聚糖-胶原蛋白比例使支架具有作为骨、软骨缺损移植材料的替代物可能。 关键词：壳聚糖;胶原蛋白;骨;生物支架;组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.006     

人重组骨形态发生蛋白2及碱性成纤维细胞因子纤维蛋白复合物修复兔陈旧性关节软骨缺损：18周组织学观察

背景：纤维蛋白的天然网状结构为骨髓细胞黏附、增殖提供了良好的三维空间环境，且同时又限制了人重组骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子的快速扩散，使两者随着纤维蛋白的逐渐降解而缓慢释放，最终诱导间充质细胞向软骨转化。 目的：观察人重组骨形态发生蛋白2和碱性成纤维细胞生长因子分别复合纤维蛋白后，修复兔陈旧性关节软骨缺损的效果。 设计、时间及地点：组织形态学观察，于2005-07/2006-02在石河子大学医学院完成。 材料：清洁级健康8周龄新西兰大白兔18只36膝，随机分为3组：人重组骨形态发生蛋白2组、碱性成纤维细胞生长因子组、对照组，6只12膝/组。人重组骨形态发生蛋白2，碱性成纤维细胞生长因子为英国BioSource产品；冻干人纤维蛋白原为上海莱士血制品有限公司产品。 方法：各组兔均于双侧膝关节股骨髌股关节面制备直径4 mm、深3 mm的全层软骨缺损，4周后在原切口再次开腔，清除缺损区内的纤维组织，钻通骨髓腔，成为陈旧性关节损伤。人重组骨形态发生蛋白2组用注射器注入人重组骨形态发生蛋白2+冻干人纤维蛋白原，使复合物添满缺损区；碱性成纤维细胞生长因子组同法注入碱性成纤维细胞生长因子+冻干人纤维蛋白原；对照组单纯注入等量的冻干人纤维蛋白原。 主要观察指标：光镜及电镜观察骨缺损区组织修复及软骨再生情况，并进行组织学评分。 结果：18只兔（36膝）均进入结果分析。人重组骨形态发生蛋白2组修复后10，14周，软骨缺损被白色半透明坚硬组织平滑修复，富有光泽，与正常软骨边界清楚，至18周时修复组织与正常软骨边界模糊，质地坚硬，表面平滑光润；碱性成纤维细胞生长因子组修复后10，14，18周时均有1膝关节缺损区未能完全修复；对照组全程均未见软骨修复。与对照组比较，人重组骨形态发生蛋白2组、碱性成纤维细胞生长因子组再生软骨组织学评分均明显降低（P < 0.01），且前组下降幅度优于后组（P < 0.05）。 结论：人重组骨形态发生蛋白2纤维蛋白复合物可有效修复兔陈旧性关节软骨缺损，且短期效果优于碱性成纤维细胞生长因子纤维蛋白复合物。     

丝素-壳聚糖复合支架制作及其特性研究

摘要 目的：探索应用丝素与壳聚糖复合制作生物可降解三维多孔支架,并对其特性进行相关检测。 方法：通过脱胶、溶解、透析这三个主要步骤制成浓度为1.5%（m/v）的丝素溶液,将壳聚糖溶解在2%的醋酸溶液中制成2.5%（w/v）的壳聚糖-乙酸溶液,然后将两者混合,配制成质量比（丝素：壳聚糖）分别为10：0、5：5、4：6、3：7、2：8、0：10的6种溶液,分别吸入24孔板中,4℃排出气泡后-20℃预冷冻12h,再冷冻干燥仪冻干30h。取出后用梯度乙醇水化后再用NaOH-乙醇溶液中和稳定1h,漂洗后,再次冻干。用光镜和扫描电镜比较观察各种质量比配制的支架孔径、结构。采用改良的液体替代法测定各种支架的孔隙率。并对各种支架在体外降解1、2、3、4周后的体外降解率进行了测定。 结果：丝素/壳聚糖质量比以10：0制成的支架孔隙粗大,非常蓬松,易碎,溶失率太高;相反仅以壳聚糖制成的支架冻干后较硬,缺乏足够的弹性;以5：5、4：6、3：7、2：8制成的复合支架冻干后,发现支架较松软,类似海绵,随着壳聚糖浓度增加,支架硬度增加,支架上有分布均匀且细密的小孔。光镜下观察发现各个孔形态不规则,一个个孔紧密相连并联通,孔径大小均匀,孔径在20~100μm之间,随着壳聚糖浓度增加,孔径逐渐减小。孔隙率测定后发现质量比为4：6这组的孔隙率最高84.2%±3.8%,其次为质量比为5：5组81.3%±4.5%,3：7组和2：8组分别为74.8%±4.2%、70.6%±4.2%,各组间用q检验法两两比较（SNK）发现5：5组和4：6组与2：8组比较P值均小于0.05,差异有统计学意义,其它各组间P值均大于0.05,差异无统计学意义。各组的吸水膨胀率用q检验法做两两比较,P值均大于0.05,差异无统计学意义。体外降解实验发现质量比为2：8组降解的最慢,5：5组降解的最快。 结论：将丝素与壳聚糖混合制作复合支架较单纯用丝素或者壳聚糖制作的支架从理化性能上来说都显示出优势,其中用丝素/壳聚糖质量比为5：5及4：6制成的支架最符合软骨组织工程的需要。