上海市贝类水产品诺如病毒污染状况及基因分型

[背景]诺如病毒(NoV)是影响食品卫生与安全的重要污染物.贝类可富集环境水体中的病毒,是重要的食源性病原体传播载体.[目的]了解NoV在上海市贝类水产品中的污染状况,并对阳性株进行鉴定分型,为预防食源性疾病的发生,制定防控措施提供参考依据.[方法]采用实时荧光逆转录聚合酶链式反应法对2017—2019年上海地区采集的...     

荧光定量RT-PCR定量检测诺如病毒方法的建立及其评价

目的:建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒GⅠ、GⅡ的方法,以用于患者标本的检测、分型及绝对定量。方法:经过优化筛选出最佳反应体系及反应条件,建立荧光定量RT-PCR快速检测诺如病毒的方法;制作两种不同型号的荧光定量PCR仪的绝对定量标准曲线,并从灵敏度、特异性、重复性、对患者标本检测能力等方面对建立的方法进行综合评价。结果:该方法在两种不同型号的仪器上对108~101copy/μl范围内的病毒,具有良好的线性关系,最低灵敏度为101copy/μl。与容易引起腹泻症状的轮状病毒、腺病毒、星状病毒、肠道病毒均无交叉反应;诺如病毒GⅠ、GⅡ两种常见感染人类的亚型之间无交叉反应。批内及批间重复性实验的标准差在0.10~0.59、变异系数在0.43%~2.84%之间,显示该方法重复性较好。用该方法共检测腹泻患者粪便标本181份,其中33份诺如病毒阳性,随机抽取10份阳性标本测序分析,结果证实均为诺如病毒。结论:本研究建立的诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法,灵敏度、特异性、重复性、对患者标本的检测能力等均显示较好的结果,且能快速区分GⅠ、GⅡ两种感染人类的重要亚型,在诺如病毒的快速检测中有着实际推广意义。     

应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒

目的建立基因Ⅱ型诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并应用于临床标本的检测。方法二氧化硅法提取粪便中的病毒RNA,使用针对基因Ⅱ型诺如病毒N/S结构域的引物和探针建立荧光定量PCR方法,对罗城县急性胃肠炎疫情的34份标本进行检测,并与常规RT-PCR和ELISA检测结果比较;还用该法对2006年2月至2007年1月广西急性胃肠炎暴发及散发病例粪便样本305份做了临床检测。结果用实时荧光定量RT-PCR法成功地从罗城疫情样本中检测出基因Ⅱ型诺如病毒,实时荧光定量RT-PCR、常规RT-PCR和ELISA的检出率分别为为85.3%、76.5%和26.5%。而实时荧光定量RT-PCR对114份对急性胃肠炎暴发疫情及191份散发病例样本的基因Ⅱ型诺如病毒检出率分别为56.1%和23.6%。结论诺如病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法具有快速、灵敏和特异的优点,不但能对标本中病毒浓度进行定量检测,还能鉴别诺如病毒基因型别。同时也发现基因Ⅱ型诺如病毒感染在广西急性胃肠炎暴发疫情和散发病例中较常见。     

海岛地区腹泻病例中诺如病毒基因序列分析

目的了解海岛地区病毒性腹泻病原中诺如病毒的流行状况,对优势流行株进行基因序列分析。方法对舟山市监测医院疑似病毒性腹泻粪便样本经酶联免疫吸附法(ELISA)筛选轮状病毒,对阴性样本采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增诺如病毒RNA聚合酶与主要衣壳蛋白基因,PCR扩增产物进行测序反应,序列结果与GenBank已公布的序列进行比对,测其同源性;并绘制成系统发生树进行进化分析。结果在35份诺如病毒扩增阳性样本中挑选病毒载量最高的Hu/Zhejiang/9/2006/CHN株进行测序,并与Hunter株、Farming Hill株等进行比对并绘制系统发生树。Hu/Zhejiang/9/2006/CHN株属于诺如病毒GⅡ-4群,与Hunter株和Lanzhou株形成的分支较接近,RNA聚合酶有部分序列与这2株完全相同。结论舟山市(海岛地区)病毒性腹泻病原中存在诺如GⅡ-4群,采用GDD基序分析有利于更好地发现新的变异株的存在,为病毒性腹泻的病原学和基因学研究提供依据。     

2014-2015年昆明市175件市售海产品中诺如病毒污染状况检测

目的 调查昆明市售海产品中诺如病毒的污染状况,为市民消费海产品提供建议,为昆明市售海产品食用安全性提供依据。方法 2014年7月至2015年7月,采集市售海产品175件,应用real-time RT-PCR法分别检测诺如病毒的ＧⅠ和ＧⅡ两个亚型,并对不同类型、不同季节、不同产地市售海产品中诺如病毒的污染情况进行比较。结果 175份市售海产品中诺如病毒总检出率为1.14%（2/175）,从基因分型看,2份阳性样品均为GⅡ型。结论 2014年-2015年昆明市售海产品中检出GⅡ型诺如病毒,存在通过食用海产品感染的风险。     

2015—2016年江苏地区双壳贝类海产品中诺如病毒携带状况

目的了解江苏地区流通环节双壳贝类中诺如病毒(Norovirus,NV)携带和流行状况,为预防食源性疾病的发生和食品安全风险评估提供基础资料。方法 2015年7月—2016年6月,从江苏6个市(县)的流通和养殖环节采集657份贝类海产品样本,采用RT-PCR法检测NV。结果共采集657份标本,监测标本NV阳性率为15.22%,以GⅡ型为主(13.39%),其次为GⅠ型(6.85%)、GⅠ+GⅡ型NV同时检出(5.02%),不同亚型NV阳性率差异有统计学意义(χ~2=11.389,P<0.05)。不同双壳贝类NV检出率差异有统计学意义(χ~2=67.677,P<0.05),牡蛎中NV感染率最高(24.83%);不同地区样品阳性率的差异有统计学意义(χ~2=21.67,P<0.05),东台阳性率最高(23.64%)。不同季度双壳贝类阳性率的差异有统计学意义(χ~2=9.518,P<0.05),2016年第一季度阳性率最高(18.16%)。结论牡蛎为携带NV的高危食品,沿海城市中销售的双壳贝类感染水平较高,NV携带存在季节性的变化。     

广东省市售牡蛎中诺如病毒污染调查

目的 调查广东省地区市售牡蛎中诺如病毒污染状况并对阳性株进行鉴定、分型,为控制和预防因食用牡蛎而引起诺如病毒胃肠炎提供基础数据。方法 应用实时荧光定量RT-PCR,对2016年1月 - 2017年12月期间在广东省8个城市收集的290份牡蛎样品进行诺如病毒定性和定量检测,并对不同季节、城市及采样点诺如病毒的污染情况及基因分型情况进行比较。结果 290份牡蛎样品的诺如病毒总检出率为为17.20%(50/290),不同季节的诺如病毒污染率分别为春12.50%、夏6.90%、秋18.30%和冬30.70%;从病毒污染的不同基因型分析,GⅠ诺如病毒检出率为6.20%,GⅡ型诺如病毒检出率为11.00%。结论 广东省市售牡蛎存在诺如病毒污染,且污染具有季节特点,以冬季污染较严重,具有较高引起食源性胃肠炎疾病感染的风险,其基因型以GⅡ型为主。     

2011-2017年广东省牡蛎中诺如病毒污染状况分析

目的 分析2011—2017年广东省牡蛎中诺如病毒的污染情况,为开展牡蛎中诺如病毒污染状况的风险评估以及采取有效措施减轻污染程度提供科学依据。方法 2011—2017年选取广东省11个牡蛎消费量较大的地级市进行样品采集,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分别进行诺如病毒GI型和GII型检测。结果 共采集牡蛎样品1 298份,检出诺如病毒阳性217份,总阳性检出率为16.72%;其中GII型检出率（14.56% ）高于GI型（7.78%）,差异有统计学意义（P<0.01）。不同季节检出率差异有统计学意义（P<0.01）,以冬季检出率最高（43.40%）。产地为国外的牡蛎检出率（6.72%）低于国内（13.31%）,差异有统计学意义（P<0.01）。流通环节的检出率（18.21%）高于餐饮环节（13.53%）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 广东省流通和餐饮环节中的牡蛎均存在诺如病毒污染,以GII型为主,冬季检出率较高。     

贝类中诺如病毒ELISA与荧光定量PCR检测技术的研究

目的:贝类中诺如病毒是世界范围内急性非细菌性流行性胃肠炎的重要病原。目前我国沿海地区也暴发了诺如病毒,为了更准确的检测,本文寻找和建立了贝类产品中诺如病毒的快速检测方法。方法:用荧光定量PCR和ELISA法对大连地区的贝类样品进行检测。结果:大连地区的贝类样品未检测出诺如病毒。结论:通过实验证明荧光定量PCR法和ELISA法都可用于快速检测诺如病毒,但ELISA法更适于检测诺如病毒含量低的样品。     

某儿童福利院诺如病毒聚集性疫情调查分析

目的 通过对儿童福利院诺如病毒疫情的调查分析,查找可疑病原和传播模式,为疫情控制提供科学依据。方法 采用现场流行病学方法调查病例发生情况和可疑传播因素。采用RT-PCR法对采集的肛拭子进行检测。结果 本次疫情从2018年4月9日开始至4月14日结束,共发现15例病例,均为该福利院儿童,儿童罹患率为65.2%。发病高峰期为4月11日,临床表现均为呕吐。调查共采集12份肛拭子进行病原学检测,其中6份肛拭子检出GⅡ型诺如病毒。结论 该起事件为病例缺乏管理和呕吐物处理不当引起的GⅡ型诺如病毒聚集性疫情。     

南通地区沿海贝类诺瓦克病毒携带情况调查

目的:调查南通地区沿海贝类诺瓦克病毒携带情况。方法:从2010年11月-2011年4月,在南通沿海及南通市区主要水产市场采集文蛤、花蛤、竹蛏、毛蚶等贝类,采用荧光定量PCR方法检测诺瓦克病毒(Novoviruses,NV)的感染。结果:检测结果显示,南通地区沿海贝类中,仅从毛蚶中检出NV,检出率为6.25%,而其它被测贝类均未检出。结论:南通地区沿海部分贝类被NV污染,需加以监管,以确保贝类食用安全。     

登革2型病毒全长基因组的长链RT-PCR法扩增

目的采用长链RT—PCR技术扩增登革2型病毒新几内亚株（NGC）全长基因组。方法根据登革2型病毒NGC株基因组全序列设计引物，在上游引物中加入Sp6RNA聚合酶启动子核心序列，下游引物中加入Cla Ⅰ内切酶位点。从病毒感染的乳鼠脑中提取RNA，采用长链RT—PCR技术进行扩增。以获得的PCR产物为模板分别扩增3个NGC株特异的基因片段。结果长链RT—PCR法扩增出约11kb基因片段，经PCR法证实为登革2型病毒NGC株特异序列。结论通过长链RT—PCR技术，获得了登革2型病毒NGC株全长基因组，为进一步构建感染性克隆打下基础。     

双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸方法建立

目的：建立快速且简便的常见腹泻病毒筛检和诊断方法，为及时明确病因、控制病原体的传播以及采取有效的治疗措施，防止抗生素滥用提供病原学依据。方法：对建立的一步法双重RT—PCR进行灵敏度、特异性、重复性分析。并应用该方法对28份疑似病毒性腹泻监测标本进行轮状病毒和诺瓦克病毒核酸检测，同时用普通RT—PCR方法、乳胶凝集法和基因序列分析进行检测结果验证。结果：检测出轮状病毒核酸6份，诺瓦克病毒核酸2份，验证符合率达100％。结论：一步法双重RT—PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸的方法建立，不仅节省了检测过程中的人力、试剂和时间，更重要的是提高了应急筛检的能力，为病毒性腹泻病及时防控和治疗赢得时间。     

牡蛎和粪便中GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时聚合酶链反应检测方法的建立

目的 建立适用于牡蛎和粪便中快速、特异、灵敏的GⅠ、GⅡ型诺如病毒(NV)定量分型诊断方法.方法 通过对GⅠ、GⅡ型NV基因组保守序列的比对分析,设计高度特异的引物和探针,建立以TaqMan探针为基础的实时聚合酶链反应方法(TaqMan Real-time RT-PCR).结果 该方法对NV核酸检测高度特异,且GⅠ和GⅡ型之间无交叉反应,最低检出限达102 copies/μl.对90份新鲜牡蛎样品和37份腹泻粪便标本分别用常规RT-PCR和笔者建立的TaqMan Real-time RT-PCR进行NV检测,发现牡蛎样品中后者的检出率明显高于前者,而粪便标本中两者无明显差别.同时对阳性标本的测序分析证实结果准确可靠.结论 研究中建立的TaqMan Real-time RT-PCR方法可用于海产品标本及粪便中NV定量及分型检测,可作为应对NV胃肠炎暴发的有效诊断方法.     

诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR的检测研究

目的建立特异、灵敏的诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测方法。方法根据GenBank诺如病毒遗传组Ⅱ型代表株保守序列设计特异引物对和TaqMan～MGB探针，调整引物、探针浓度，优化最佳反应条件，建立一步法实时荧光PCR快速检测反应体系，进行灵敏度、特异性、稳定性试验，以评价反应体系，并与引物P289／P290常规RT—PCR进行灵敏度比较。结果诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测时限短，仅1h就出结果；最低检出下限为100拷贝/mL，比引物P289／P290常规RT—PCR灵敏度高100倍；与轮状病毒、腺病毒、星状病毒、甲肝病毒无交叉反应；4份核酸含量不同的标本重复检测5次，平均G值变异系数范围0．96％-2．27％。结论诺如病毒遗传组Ⅱ型TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速、特异、灵敏、稳定性好。可应用于突发公共卫生应急检测，提高快速检测能力。     

几种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法的验证

目的比较和验证5种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法。方法首先使用美国NCBI网站的Primer—BLAST程序验证5种甲型H1N1流感病毒SYBRGreenI荧光RT—PCR检测方法引物的理论特异性,然后使用猪流感H1N1病毒核酸、2009年新甲型H1N1流感病毒核酸、H5N1禽流感核酸、能力验证样品作为试验样品验证方法的实验特异性。结果理论验证结果显示5对来源于文献的引物均适合于猪流感的检测,前3对可用于新型甲型H1Nl流感的检测,但只限于个别来源的毒株,与预期略有差别。实验验证结果显示,方法l可正确检出甲型流感病毒;方法2可正确检出猪流感H1N1亚型病毒、新甲型H1N1流感病毒核酸;方法3检测新甲型H1N1流感核酸时未获得阳性结果;方法4可以正确检测出猪流感H1病毒核酸;方法5可以正确检测出猪流感H1N1病毒核酸,但检测新甲型H1N1流感核酸、禽流感H5N1核酸时也为阳性。结论方法1可用于猪甲型流感和新甲型H1N1流感病毒的初筛;方法2可用于猪流感H1N1亚型病毒和新甲型H1N1流感病毒核酸的初筛;方法3不适合新甲型H1N1流感病毒核酸的检测;方法4可用于猪流感H1亚型的检测;方法5不适合于猪流感H1N1亚型病毒的检测。采用SYBRGreenI荧光RT—PCR方法检测甲型H1N1流感病毒核酸,特异性普遍不十分理想,只能用于初筛检测。     

免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交检测贝类中甲型肝炎病毒的方法研究

目的：建立贝类中甲型肝炎病毒新的检测方法。方法：先用IgG抗体吸附标本中的HAV，然后将HAV中的RNA逆转录成cDNA，用PCR方法扩增。PCR产物与标记特异基因探针孔中分子杂交，最后加入与标记物对应的酶配体，酶联免疫检测。结果：采用的两对引物和探针均可用于检测。仅加入HAV的可测出阳性，其余病毒测不出。寡核苷酸探针3．75nmol／L、7．5nmol／L、15nmol／L比较理想，杂交时间为120min，显色30min最佳。免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交方法比原方法提高25倍以上。推测方法的检测限达到8pfu/g贝组织。结论：免疫捕获-核酸扩增-微孔杂交方法灵敏度高、特异性强，且可以定量。     

半巢式RT-PCR法检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、敏感、特异的人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)检测方法。方法根据RSVF基因的保守序列设计3条引物，建立半巢式RT-PCR(semi-nested RT-PCR)检测方法。用该方法检测125例患急性下呼吸道感染的婴幼儿的鼻咽吸引物(nasopharyngeal aspirates，NPA)标本，同时对标本进行病毒分离和直接免疫荧光法检测。结果该半巢式RT-PCR灵敏度为0．1TCID50，用该方法在125例标本中共检出RSV阳性标本63例，阳性率50．4％。结论建立快速、敏感、特异的RSV半巢式RT-PCR检测方法，该方法适用于临床早期诊断和流行病学监测。