融合表达pGEX-Tα1的发酵研究

为了研究重组人胸腺素α1(Tα1)工程菌的发酵工艺 ,在NBS MICROS15L自动控制发酵罐中 ,利用分批培养和补料分批培养技术培养含融合表达载体 pGEX Tα1的大肠杆菌DE3 (lys)。采用分批培养 ,得到的最终菌体密度OD60 0 为 8,GST Tα1融合蛋白的含量为 0 .1g L(发酵液 ) ;通过限制性流加补料 ,促进体系溶解氧能使发酵菌体密度及融合蛋白的含量显著提高 ,OD60 0 可达 3 2 ,融合蛋白的含量为 0 .7g L(发酵液 ) ,且融合蛋白主要以可溶形式表达 ,为后续蛋白纯化工作提供了便利。本研究确定了周期短、产率高且稳定的发酵工艺 ,为工业化生产重组Tα1打下了基础     

非融合型重组人骨唾液蛋白在毕赤酵母中的高效表达及纯化

通过正交设计对毕赤酵母GS115/pPICZaAN-hbsp工程菌的发酵条件(菌体密度、甲醇诱导浓度、初始pH值、诱导时间)进行优化.采用重组人骨唾液蛋白(recombinant lauman bone sialoprotein,rhBSP)单克隆抗体与Aldehyde-Resin HP FF介质偶联制备免疫亲和层析柱,纯化非融合型rhBSP,并用Western blotting和补体抑制实验检测非融合型rhBSP的抗原性和活性.毕赤酵母GS115/pPICZαAN-hbsp工程菌最佳发酵优化为:菌体密度OD600达到45甲醇诱导剂量为1.5%,pH值6.0,诱导时间2 d,最大表达量为0.126 mg/ml.经免疫亲和层析法纯化后,SDS-PAGE显示非融合型rhBSP为43～66 ku的分散条带,纯度在90%以上,Westernblotting显示rhBSP具有良好的抗原性,补体实验证明纯化的非融合型rhBSP活性很好.毕赤酵母GS115/pPICzαAN-hbsp工程菌发酵条件经优化后能高效表达非融合型rhBSP,应用免疫亲和层析方法纯化的非融合型rHBSP纯度好,活性高,为进一步研究非融合型rHBSP打下了基础.     

重组毕赤酵母生产干扰素α-2b的研究

目的为探求生产干扰素-α2b的方法。方法采用重组毕赤酵母发酵,纯化生产干扰素-α2b。结果重组毕赤酵母生产干扰素α-2b,产量高达70mg/L(发酵液),目标蛋白干扰素α-2b不需要复性,在纯化过程中,不需要价格昂贵的单抗柱,即可从发酵液中提取获得纯度达96%以上的目标蛋白,蛋白质比活性大于1.0×109IU/mg。结论PichiaPastoris高效酵母分泌表达系统取代大肠杆菌表达系统生产干扰素-α2b。结论采用重组毕赤酵母生产干扰素-α2b,能提高蛋白质比活性,简化生产工艺,降低生产成本。     

融合表达pGEX—Tαl的发酵研究

为了研究重组人胸腺素α1(Tα1)工程菌的发酵工艺，在NBS—MICROS15L自动控制发酵罐中，利用分批培养和补料分批培养技术培养含融合表达载体／pGEX—Tαl的大肠杆菌DE3(lys)。采用分批培养，得到的最终菌体密度OD600为8，GST-Tαl融合蛋白的含量为0．1g／L(发酵液)；通过限制性流加补料，促进体系溶解氧能使发酵菌体密度及融合蛋白的含量显著提高，0D600可达32，融合蛋白的含量为0．7g／L(发酵液)，且融合蛋白主要以可溶形式表达，为后续蛋白纯化工作提供了便利。本研究确定了周期短、产率高且稳定的发酵工艺，为工业化生产重组Tα1打下了基础。     

重组人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白的分子设计及活性测定

应用蛋白质工程原理对胸腺肽与人血清白蛋白进行不同方式融合的分子设计,应用Insight II软件包中的Hiopolylnet和Discover模块同源模建了胸腺肽Tα1、TP与人血清白蛋白融合前后的空间结构.并依据同源模建所得结果指导构建不同的重组融合蛋白毕赤酵母工程菌,表达的融合蛋白经分离纯化后进行生物活性分析,验证融合蛋白同源模建的结果.     

角质细胞生长因子-2的发酵及纯化工艺研究

目的研究重组人角质细胞生长因子 2 (rhKGF 2 )工程菌的高密度发酵和提纯工艺。方法通过增加培养基营养成分 ,发酵过程补加葡萄糖 ,获得高产率菌体。细菌裂解液经硫酸铵沉淀、分子筛、肝素亲和色谱和离子交换色谱等方法进行纯化 ,电泳分析结果。结果每 1L发酵液可获得菌体 12 .2g ,表达率达 2 8.7%。纯化后rhKGF 2纯度达 97%。结论rhKGF 2工程菌可获得高密度发酵。纯化工艺适用于rhKGF 2的大量制备     

胞红蛋白酵母表达载体构建与表达纯化

胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

重组人血清白蛋白突变体干扰素2b融合蛋白的纯化

在成功构建人血清白蛋白突变体干扰素α2b融合蛋白(rmHSA-IFN-α2b)毕赤酵母工程菌株PicZαA/rmHSA-IFN-α2b/X33的基础上,建立了发酵分泌表达rmHSA-IFN-α2b的纯化工艺。对工程菌进行9 L罐高密度发酵后,离心收集发酵液上清,rmHSA-IFN-α2b的表达量为421 mg/L。对发酵液上清,依次进行3步纯化。第一步采用SP sepharose FF除去大部分色素和部分杂蛋白。第二步采用Blue sepharose FF根据亲和作用原理除去部分杂质。第三步采用Q sepharose FF除去溶剂和其他杂质以及类毒素。最终得到高纯度、有活性的rmHSA-IFN-α2b。通过HPLC检测和SDS-PAGE检测,最终产品的纯度都大于95%;通过活性检测,rmHSA-IFN-α2b的比活为1.5×106IU/mg。纯化总收率为25.3%。连续重复纯化6批,结果稳定。该工艺简单稳定,容易放大,适合规模化生产。简单高效纯化工艺的建立,为rmHSA-IFN-α2b后续研究奠定了坚实的基础。     

重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化表达重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)工程菌的高密度发酵条件。方法考察培养基以及诱导时机、诱导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响;用自控发酵罐进行分批补料培养实验,确定优化工艺条件。结果以2×YT+0.5%葡萄糖为发酵培养基,经0.8 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导5 h,通过pH-stat反馈补料方式实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每1 L发酵液收获干菌体50.1 g,IGF-Ⅰ含量达5.25 g/L。结论建立了IGF-Ⅰ工程菌优化的高密度发酵工艺,为IGF-Ⅰ的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

重组人白介素18的发酵、纯化及功能鉴定

目的:利用构建的重组菌株Pichia pastoris X-33/hlL-18,在3.7L发酵罐中表达重组人自介素18(hIL-18),探讨其大规模发酵及纯化工艺.方法:复苏工程菌X-33/hIL-18于BMGY培养基,在其A600鲫达到6左右时转入发酵罐进行高密度发酵.发酵液经过滤浓缩柱、疏水层析和阴离子交换层析分离纯化.结果:工程菌在3.7 L发酵罐采用甲醇诱导补料批式发酵,在pH 6.0,溶氧值(DO)20%～30%,温度28℃,甲醇诱导48 h重组hIL-18的表达产量为202 mg/L,发酵液经纯化后纯度可达97%以上,并初步证明重组hIL-18能协同IL-2诱导PBMCs分泌IFN-γ和协同IL-2增强NK细胞的杀伤活性.结论:利用Pichia pastoris分泌型表达系统和建立的分离纯化方法,能获得大量较高纯度的重组hIL-18,为进一步研究其活性和功能奠定基础.     

重组鼠源角质细胞生长因子的发酵表达优化及纯化

通过正交实验优化了融合型小鼠角质细胞生长因子(rm-KGF)重组大肠杆菌的发酵和诱导表达条件。优化后的发酵培养基为:葡萄糖6g/L,酵母提取物10g/L,NH4Cl1.3g/L,磷酸盐1mol/L,MgSO4·7H2O0.6g/L。诱导表达条件为:以1mmol/LIPTG于菌体密度(A600)为1时诱导5h。在此条件下,分别经CM-SephadexG-50和HeparinSepharoseCL-6B两步纯化,所得融合rm-KGF经HPLC检测纯度约96%,每升发酵液可得约82mg纯化产品。     

人源抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达

目的：探讨抗HBsAg单链抗体与白细胞介素2融合蛋白在巴氏毕赤酵母(P．Pastoris)中的表达以及初步的纯化、活性鉴定方法。方法：用PCR将目的蛋白基因从质粒PGEM7Zf( )-HBScFv-IL-2上扩增出来，再亚克隆到酵母表达载体pPICZaA中，转化P．Pastoris宿主菌GS 115，菌落：PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定转化子，重组酵母经甲醇诱导后，通过SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定表达产物；再通过亲和层析法纯化目的蛋白；用间接ELISA实验鉴定其活性。结果：表达的重组蛋白分子质量约为44ku，表达量可达12％；纯化后凝胶成像分析目的蛋白的纯度达到95％；重组融合蛋白能与HBsAg、鼠抗IL-2单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建了抗HBsAg单链抗体与IL-2融合蛋白酵母表达工程菌，并初步建立了对目的蛋白的纯化及活性鉴定方法。     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

溶氧对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响

目的考察发酵液中不同的溶氧浓度对重组毕赤酵母高密度发酵生产腺苷蛋氨酸的影响。方法通过改变通气量、搅拌转速和辅助通入纯氧的方式将发酵液中溶氧浓度控制到试验设定值。结果当控制发酵液中溶氧浓度在30%时,SAMe产量最高。结论通过控制发酵液中溶氧浓度有助于提高重组毕赤酵母高密度发酵高表达腺苷蛋氨酸。     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。     

重组TNF-α衍生物RMPT的制备及其抗肿瘤作用初步研究

利用基因重组技术制备具有抗肿瘤作用的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)衍生多肽RMPT,并研究其体外生物学效应。PCR方法合成RMPT基因序列,定向插入高效表达载体pTXB1-MCS,在大肠杆菌ER2566中诱导表达重组融合蛋白并建立RMPT融合蛋白诱导表达的优化体系。N端自动切割、纯化、HPLC制备获得RMPT,电泳和质谱鉴定其分子质量。CCK-8检测RMPT对肿瘤细胞的抑制作用。实验结果表明:重组工程菌可溶性RMPT融合蛋白最佳诱导表达条件为37℃、8 h、IPTG浓度0.75 mmol/L;DTT诱导蛋白内含肽自剪切固相纯化和HPLC制备重组肽RMPT,纯度大于95%,电泳和质谱鉴定其分子质量为3.7 ku,结果与理论值相符合,其产率为10.8 mg/L发酵液;体外研究表明,RMPT能够高效抑制多数肿瘤细胞增殖。     

D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究

用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化.PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500～2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统.     

重组人胰岛素pET28a-IHI下游工艺研究

目的对含有重组人胰岛素原基因的大肠杆菌工程菌pET28a-I HI摇瓶发酵,并探讨采用磺酸化方法对包涵体蛋白纯化复性的工艺。方法工程菌pET28a-I HI经摇瓶发酵、机械破碎得到包涵体,包涵体经过磺酸化、等电点沉淀、DEAE-52柱层析三步纯化后采用15%SDS-PAGE电泳检测,经过复性,酶切,DEAE-52纯化后,冷冻干燥,样品进行HPLC检测以及整体生物学活性实验。结果工程菌表达量约在30%左右,经过三步纯化,包涵体纯度可达98%以上,酶切之后经质谱检测,与人胰岛素标准品相对分子质量一致,而且动物实验降血糖效果明显,1 L发酵液最终可得到人胰岛素140mg。结论该工艺耗时短,效果好,成本较低。     

重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵

目的优化重组人白细胞介素-18的发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达.方法在10L发酵罐中,研究重组人白细胞介素-18工程菌在不同的pH值、溶氧和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响.结果根据优化条件,连续三批重复发酵10L工程菌,最终菌体密度均达A600nm=28,菌体获得量均可达湿重50g?L-1以上.目的蛋白表达量均为40%以上.结论优化了重组人白细胞介素-18基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础.