载银多聚赖氨酸-海藻酸钠静电自组装多层膜修饰钛表面及其抗菌研究

目的 利用层层自组装技术在钛表面构建聚L赖氨酸（PLL）-海藻酸钠（ALG）多层膜,并在膜层中导入纳米银颗粒,以评价其杀菌效果。方法 利用层层自组装的方法将带正电荷的PLL与带负电荷的ALG在钛片上交替吸附沉积形成聚电解质多层膜,再用盐诱导相分离技术在多层膜中形成一定尺寸的微孔并在其中包裹纳米银粒子。扫描电子显微镜（SEM）、傅立叶红外光谱（FTIR）和能谱分析（EDX）对表面进行表征。并与变形链球菌共培养,观察对细菌的粘附和杀灭的作用。结果 SEM、FTIR和EDX分析证实：多层膜成功沉积在钛片表面,并且纳米银粒子被包裹于其中。荧光显微镜显示纯钛表面有大量的活细菌,沉积聚电解质多层膜后细菌数量减少,导入纳米银离子之后附着于钛片上的细菌数量更少,并且随着膜层数的增多,银离子含量增加,抗菌效果也增强。SEM结果与荧光结果一致。结论 通过层层自组装的方法在钛金属表面沉积载银PLL-ALG聚电解质多层膜,能抑制细菌的粘附。同时,随着膜层数的增加,银粒子含量增加,抗菌效果增强。     

钛表面形貌和亲水性表面对成骨细胞增殖、分化的影响

目的:通过体外实验研究普通喷砂酸蚀纯钛表面和亲水性喷砂酸蚀纯钛表面对成骨细胞增殖、分化等生物学行为的影响。方法:纯钛片表面分别采用光滑处理(smooth pretreated Ti,PT)、大颗粒喷砂酸蚀表面处理(sand-blasted,large-grit,acid-etched,SLA)及亲水性化学活化大颗粒喷砂酸蚀表面处理(chemically-modified SLA,modSLA/SLActive),在表面接种MC3T3-E1成骨细胞,采用MTT、碱性磷酸酶半定量测试以及茜素红染色检测其对成骨细胞增殖、分化的影响,并采用实时荧光定量PCR检测成骨细胞在不同材料表面骨功能基因表达的差异。应用SAS 9.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与光滑钛表面相比,普通喷砂酸蚀钛表面能通过促进ALP、钙基质的分泌和成骨功能基因(Runx2、OSX、OCN和OPN)的表达而显著抑制成骨细胞增殖并促进其分化。在表面粗糙度的基础上增加亲水性,可使这一效应更加明显。结论:表面粗糙度和亲水性是影响成骨细胞生物学行为的重要因素,粗糙钛表面能显著抑制成骨细胞增殖,促进其分化,亲水性的粗糙钛表面促进成骨细胞分化的作用更加显著。     

钛片表面粗糙度和氧化膜对成骨细胞增殖和分化的影响

目的：研究钛片表面粗糙度和氧化膜对成骨细胞增殖和分化的影响,为种植体表面处理提供理论依据。方法：采用粒度分别为108～130 μm(S1)、216～301 μm(S2)和356～411 μm(S3)的二氧化钛颗粒对纯钛钛片表面进行喷砂处理,钛浆喷涂(titanium-sprayed plasma, TPS)表面处理组由Straumman 公司提供,600目砂纸打磨组(S0)作为对照组,在钛片表面进行成骨细胞培养。采用表面轮廓测量仪测量其表面粗糙度,电子探针(electron microprobe)测定钛片表面氧化膜结构。分别在1、3、5及7 d时,采用四锉盐比色(MTT)法检测不同处理表面对成骨细胞增殖(OD值)的影响;通过碱性磷酸酶活性(ALP)及骨钙素分泌(OC)检测比较不同处理的表面对成骨细胞分化的影响。采用SPSS12.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果：S0 、S1 、S2 、S3 和TPS组表面粗糙度由0.372 μm至5.239 μm递增;喷砂组钛片表面氧化膜结构完整、连续;粗糙表面比光滑表面更利于成骨细胞增殖和分化。喷砂表面粗糙度越高,越利于成骨细胞增殖和分化。S3组成骨细胞增殖和分化优于TPS组。结论：表面粗糙度较高的喷砂表面,更利于成骨细胞增殖和分化。     

钛表面儿茶酚化聚电解质多层膜对蛋白质的吸附研究

目的探讨钛表面儿茶酚化聚电解质多层膜对蛋白质的吸附行为,为钛种植体表面改性提供参考。 方法根据本课题组前期建立的方法,采用脂多糖胺纳米囊泡（NPs）和3,4-二羟苯基丙酸反应制备儿茶酚接枝率为40%的儿茶酚化NPs（cNPs）;采用透明质酸（HA）和多巴胺反应制备儿茶酚接枝率为10%的儿茶酚化透明质酸（cHA）。利用层层自组装技术,以cNPs为引发层、cHA/NPs为阴、阳离子聚电解质,在钛或石英表面构建含3个（cHA/NPs）双层的儿茶酚化聚电解质膜[（基底-cNPs-（cHA/NPs）₃],记为cPEM。同时以NPs为引发层,构建含（HA/NPs）₃的未儿茶酚化聚电解质膜（PEM）。采用红外光谱分析膜表面化学组成、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）检测膜表面粗糙度,Zeta电位分析仪记录膜表面Zeta电位。选取4种等电点（pI）分别小于、等于、大于生理pH 7.4的蛋白质：牛血清白蛋白（BSA,pI = 4.7）、纤连蛋白（Fn,pI = 5.8）、牛血红蛋白（BHb,pI = 6.8 ~ 7.0）、多聚赖氨酸（PLL,pI = 9.74）,以其为模型蛋白,用0.15 mol/L的NaCl配制成1 mg/mL的水溶液。采用石英晶体微天平（QCM）实时动态监测膜表面蛋白吸附情况、原子力显微镜观察样品蛋白吸附前后形貌,LSCM、荧光酶标仪分别分析荧光标记蛋白在膜表面吸附情况,并测试荧光标记蛋白的吸附量。使用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析、SNK和LSD法进行比较,P<0.05认为差异有统计学意义。 结果LSCM结果表明,石英表面粗糙度为（301 ± 12）nm,组装cPEM、PEM后,表面粗糙度增加,分别为（656 ± 88）、（446 ± 25）nm,组间差异具有统计学意义（F = 66.974,P<0.001）。cPEM组的红外谱图中出现儿茶酚中的苯环（ν_{C = C}）、PEM组的胺基和烷基、多糖中的糖醛酸环等特征峰,证实钛表面引入cPEM和PEM。组装过程中Zeta电位呈锯齿状交替上升,cPEM组表面电位为+22.53 mV,PEM组的表面电位为+17.36 mV。QCM结果表明,生理pH下,所有表面均基本不吸附PLL。在不同表面,BSA和BHb的吸附量cPEM组>PEM组>Ti组。原子力显微镜下可见cPEM、PEM组表面为分布均匀的水滴形海岛状结构,吸附BSA后,表面可见圆盘状结构,且cPEM组量大于PEM组,说明可能BSA在cPEM组表面的吸附量大于PEM组。采用LSCM和荧光酶标仪分析绿色荧光标记蛋白在不同表面的吸附情况,发现在不同种膜表面,同一蛋白吸附量cPEM组>PEM组>Ti组;在同一种膜表面,不同蛋白吸附量BSA>Fn>BHb。 结论本实验研发的聚电解质多层膜对钛表面进行改性后,能提高蛋白在表面的吸附,儿茶酚化改性则进一步促进这种吸附。蛋白吸附的驱动力可能主要源于静电相互作用和儿茶酚基团对蛋白偶联捕捉作用。     

钛表面的碱化处理和含纳米银的聚电解质多层膜修饰

目的：对钛种植体基台表面进行生物改性,改善其抗菌性,减少种植体周围炎。方法：壳聚糖／硝酸银混合液被加热还原,产物通过紫外可见光谱检测和透射电镜观察。用NaOH溶液处理钛基材表面,然后采用层层自组装技术在其表面交替吸附含纳米银的壳聚糖和肝素,扫描电镜表征。结果：紫外可见光谱检测显示,硝酸银还原后在420nm附近形成特异性吸收峰,表明生成了纳米银。透射电镜观察可见纳米银颗粒直径约10-30nm。钛表面经NaOH处理后形成不规则多孔结构,孔径约200-300纳米。层层自组装后钛表面吸附了含纳米银的聚电解质多层膜。结论：壳聚糖热还原法是一种制备纳米银颗粒的“绿色”方法。形成多孔并包被纳米银颗粒的钛表面是一种新颖的钛表面改性方法。     

Hedgehog通路对成骨细胞增殖和分化的作用

目的:研究Hedgehog通路因子Shh和Ihh对成骨细胞增殖和分化的影响.方法:体外分离和培养新生大鼠颅顶骨成骨细胞,RT-PCR检测Shh和Ihh信号的表达;用HedgehogN端重组蛋白(N-Shh)及Hedgehog通道抑制剂Cyclopamine(cy)对成骨细胞进行干预,分别采用MTT比色法、流式细胞仪、碱性磷酸酶(ALP)定性定量、茜素红染色检测成骨细胞的增殖、分化及基质钙化情况:实时定量PCR检测Hedgehog通路相关基因Ptch和Smo的表达.采用SAS8.0软件包对数据进行t检验.结果:在成骨细胞体外生长过程中,Shh的表达逐渐减弱,而Ihh的表达逐渐增强;N-Shh促进成骨细胞的增殖(P<0.05)和S期细胞比例增加(P<0.05),促进ALP的活性并促进Ptch和Smo表达(P<0.05);cy则抑制成骨细胞的增殖和分化(P<0.05).结论:Hedgehog通路参与对成骨细胞增殖和分化的调节.     

成骨生长肽对纯钛表面成骨细胞样细胞增殖和分化的影响

目的探讨成骨生长肽（osteogenic growth peptide,OGP）涂层对纯钛表面新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞增殖和分化的影响。方法实验分为纯钛组（Cp-Ti组）、碱-热水陈化处理组（AW-Ti组）和碱热处理-OGP涂层组（OGP-Ti组）,将体外培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞接种于3组钛片表面,进行细胞培养,第1、3、5、7天通过四甲基偶氮唑盐光密度值检测法测定细胞在材料表面的增值情况,培养第7、11、15天通过检测碱性磷酸酶活性测定细胞在材料表面的分化成熟情况。结果培养第1、3、5、7天,AW-Ti组和OGP-Ti组的细胞光密度值均高于Cp-Ti组（P〈0.05）;培养第1、5、7天,OGP-Ti组细胞光密度值均高于AW-Ti组（P〈0.05）。培养7、11、15 d后,AW-Ti组和OGP-Ti组的ALP活性均高于Cp-Ti组（P〈0.05）;培养7 d时,AW-Ti组和OGP-Ti组ALP活性差异无统计学意义（P〉0.05）;培养11、15 d时,OGP-Ti组的ALP活性均高于AW-Ti组（P〈0.05）。结论钛表面OGP涂层具有良好的生物相容性,能够提高其表面生物学活性。     

导电高分子聚吡咯纯钛表面改性对成骨细胞生长的影响

目的 :研究电场刺激下纯钛表面聚吡咯涂层对成骨细胞的黏附、增殖的影响。方法 :10 0mV阳极电刺激下 ,观察接种 4、8、12、16、2 0、2 4h成骨细胞的黏附数量以及 2 4h、72h的MTT吸光度值 ,SEM观察成骨细胞的生长情况。结果 :电刺激组 (Ti+电刺激 ,Ti+Ppy +电刺激 )的成骨细胞贴附密度在 4、8、12、16h均高于无电刺激组 (Ti、Ti+Ppy) (P <0 .0 5 ) ;聚吡咯涂层电刺激组的成骨细胞贴附密度 (Ti +Ppy +电刺激 )在4h、8h高于单纯电刺激组 (Ti+电刺激 ) (P <0 .0 5 ) ;72h后钛表面聚吡咯涂层加电刺激组 (Ti+Ppy +电刺激 )的吸光度高于其它三组 (Ti、Ti+Ppy、Ti+电刺激 ) (P <0 .0 1)。 结论 :聚吡咯涂层具有良好的生物相容性 ,并且在阳极电刺激下可以显著的促进成骨细胞的早期贴附和增殖     

黄芪多糖对成骨细胞增殖分化和结构的影响

目的探讨黄芪多糖对新生大鼠颅骨成骨细胞增殖和分化以及结构的影响。方法体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞,检测其在质量浓度分别为0.08、0.1、0.2、0.4g·L-1的黄芪多糖培养基中的增殖和分化与结构。结果当黄芪多糖的质量浓度为0.1g·L-1时,甲噻唑四唑氮法所测其光密度值和碱性磷酸酶活性高于对照组,成骨细胞能保持良好的表面结构和超微结构。结论适宜质量浓度的黄芪多糖水溶液在短期内对体外成骨细胞的增殖与分化具有一定的促进作用。     

静磁场对大鼠成骨细胞增殖分化功能的影响

目的研究静磁场刺激对成骨细胞的增殖和分化的影响,为临床选择合适的磁场参数,科学利用磁场疗法提供实验依据。方法体外培养Wistar大鼠颅骨成骨细胞,实验分为5组,分别置于0、40、62、83、108mT不同磁场强度的静磁场中作用24、48和72h,用噻唑兰(MTT)法检测成骨细胞的增殖情况;化学方法测定ALP酶的活性。结果随着细胞培养时间的增加,各组细胞出现不同程度的增殖和ALP活性增高,,以40mT和62mT组成骨细胞的增殖明显,与0mT组比较有显著性差异,P<0.05。结论一定强度的静磁场可以促进成骨细胞的增殖和分泌ALP的能力。     

染料木黄酮对成骨细胞增殖、分化和凋亡影响的实验研究

目的研究染料木黄酮对成骨细胞增殖、分化和凋亡的影响，以阐明其对骨形成的作用机制。方法酶消化和组织块相结合培养获得原代成骨细胞，并以成骨肉瘤细胞株UMR-106细胞作对照，加入不同浓度的染料木黄酮后，流式细胞仪和噻唑蓝比色法(MTT)检测成骨细胞细胞周期比例的改变以及凋亡情况；生化法检测细胞内碱性磷酸酶含量的改变。结果流式细胞分析和MT观测结果表明：染料木黄酮促进了原代成骨细胞由G0(G1)期向S期、G2期和M期的移行过渡，从而促进了原代成骨细胞的增殖。染料木黄酮对成骨肉瘤细胞株UMR-106细胞周期无影响，但可诱导UMR-106细胞凋亡。碱性磷酸酶检测结果表明：染料木黄酮可促进原代成骨细胞的分化。结论染料木黄酮可在一定程度上促进成骨细胞的增殖和分化，诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

钛表面接枝溴代十六烷后的杀菌效果研究

目的 在钛表面沉积透明质酸(HA)和壳聚糖(CHI)聚电解质多层膜,并用溴代十六烷对CHI上的氨基季铵化,以评价其杀菌效果.方法 在碱化处理过的钛片上吸附带正电荷的聚乙烯亚氨(PEI),再用层层自组装的方法在钛表面交替沉积带负电荷的HA和带正电荷的CHI,并用溴代十六烷(C16H33Br)对CHI上的氨基季铵化,形成Ti-PEI-(HA-CHI)20-N+(C16H33)3Br涂层,扫描电子显微镜(SEM)对涂层断面进行表征;以纯钛为对照组,Ti-PEI-(HA-CHI)20和Ti-PEI-(HA-CHI)20-N+(C16H33)3Br-为实验组,分别在其表面进行变形链球菌(S.m)培养24h后用荧光显微镜和SEM检测钛片表面的细菌活性.结果 SEM显示聚电解质多层膜已沉积到钛片表面并具有一定的厚度.荧光显微镜显示纯钛表面有大量的活细菌,Ti-PEI-(HA-CHI)20上细菌数量较少,且有部分死菌;而Ti-PEI-(HA-CHI)20-N+(C16H33)3Br-上细菌几乎全为死菌.SEM结果显示纯钛、Ti-PEI-(HA-CHI)20、Ti-PEI-(HA-CHI)20-N+(C16H33)3Bf 3组钛片上的细菌数量依次减少.结论 钛表面沉积HA/CHI聚电解质多层膜,并对多层膜中的CHI季铵化后,其表面具有显著的杀菌作用.     

烟草浸提液对大鼠成骨细胞在钛板上附着和增殖的影响

目的:观察烟草浸提液(smokeless tobacco extract,ST)对大鼠成骨细胞(rat osteoblasts,ROBs)在钛板上附着和增殖的影响。方法:采用酶解-组织块法进行ROBs的原代培养,观察细胞生长状态;用碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色法、矿化结节茜素红染色法对成骨细胞进行鉴定。不同浓度的ST作用于附着在钛板上的ROBs,观测细胞的铺展面积,MTT法检测钛板表面细胞的附着、增殖情况。采用SPSS 13.0软件包对数据进行双因素方差分析。结果:ALP染色显示,ROBs细胞内有黑色颗粒,矿化结节茜素红染色为红色,证明该细胞为成骨细胞。随着ST浓度的升高,ROBs在钛板上的铺展面积逐渐变小;增殖呈下降趋势,ST实验组与阴性对照组之间存在显著差异(P<0.05)。各实验组内前3 d存在显著差异(P<0.05),但3.2～50g/L组第4～7天间的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ST可影响ROBs在钛板上附着和增殖,并随ST浓度的增加而增强,提示吸烟不利于口腔种植的骨整合。     

成骨细胞在微弧氧化处理后纯钛表面的附着、增殖及ALP活性

目的 :对表面微弧氧化 (microarcoxidation ,MAO)处理后的纯钛材料进行成骨细胞生物相容性检测 ,评价改进的MAO工艺应用于钛植入材料表面处理的可能性。方法 :纯钛材料经过 2种MAO处理后 (MAO 1和MAO 2工艺 ) ,采用MC 3T3细胞系对不同时间点成骨细胞在材料表面的附着率、生长增殖情况以及ALP活性进行检测 ,以未经处理光滑纯钛表面作为对照 ,以SPSS对实验结果进行统计分析。结果 :早期 (0 .5h、1h)细胞附着率差异有统计学意义 ,MAO 1组 >MAO 2组 >纯钛组 ;2h后 ,MAO 1组与MAO 2组无差异 ,2组细胞附着率都显著高于纯钛组。细胞增殖及ALP活性测试中 ,MAO 1处理组在各时间点都显著高于另外 2组。结论 :MAO处理后的纯钛对成骨细胞的生物相容性优于未处理组 ,改进的MAO 1处理工艺较一般工艺可以更有效提高成骨细胞的早期粘附、增殖及ALP活性。     

载基因纳米囊泡自组装多层膜组装行为研究

目的探讨构建载基因脂多糖胺纳米囊泡(NPs,简称pNPs)/透明质酸(HA)聚电解质多层膜(PEM)的组装行为和机理。 方法利用含骨形成蛋白2(pBMP-2)基因的pNPs作为阳离子聚电解质,HA作为阴离子聚电解质,通过层层自组装技术在钛或石英玻璃表面构建PEM,记为Ti/Quartz-pNPs-(HA/pNPs)_n,其中HA和pNPs依次组装1次为1个组装循环,n为组装循环数。采用原子力显微镜(AFM)观察膜组装过程中形貌和粗糙度值改变;膜表面Zeta电位(electric potential)表征聚电解质膜表面的电荷和吸附特性;利用耗散型石英晶体微天平(QCM-D)实时监测膜的组装过程,探索膜组装规律。 结果AFM观察发现,pNPs最初以单个离散的纳米粒子形式吸附在石英玻璃表面,随着组装进程,形成越来越粗壮、密集的"树枝"状三维立体纳米结构,膜表面粗糙度值逐渐增大。Zeta电位结果表明,石英玻璃表面经过处理后Zeta电位为-4.83 mV,首层pNPs的表面电位为正,至第3个组装循环后Zeta电位稳定在+18 mV;而HA的Zeta电位最初为负值,随组装层数增加,其表面电荷逐渐趋正;组装过程中Zeta电位呈锯齿状交替上升。石英晶体微天平测量结果显示,随着组装进行膜质量和厚度逐渐增加,且以指数型增长。 结论载基因pNPs/HA通过层层自组装构建具有独特三维纳米结构的聚电解质多层膜,其增长方式为指数型,具有纳米级粗糙度和非致密性的特点。