携带HPV16 E7病毒癌基因的重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定

①目的构建携带人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7病毒癌基因的复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。②方法应用PCR技术从宫颈癌组织中扩增E7病毒癌基因全长片段,并导入T载体进行测序,与Nucleotide中HPV16标准毒株序列比较鉴定。目的基因及穿梭质粒载体pAdTrack-CMV分别经Bgl Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后连接,转化宿主菌E．coli DH5α,应用PCR法及限制性内切酶消化法双重鉴定重组质粒,并测序。③结果PCR扩增产物与Nucleotide中HPV16E7序列一致,重组穿梭质粒经Bgl　Ⅱ和Hind　Ⅲ双酶切后电泳,可观察到9220bp大小的载体条带和313bp大小的目的基因条带;将经PCR和双酶切鉴定的重组阳性克隆测序,结果证实克隆成功。④结论成功地构建了携带HPV16E7基因的重组腺病毒穿梭质粒。     

人乳头瘤病毒16型 E6蛋白真核表达载体pGADT7-E6的构建与鉴定

目的 构建HPV16 E6基因的真核表达载体,为在酵母菌中表达以及进一步探讨HPV16 E6基因与宫颈癌发生的关系奠定前期实验基础.方法 用PCR扩增含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的E6基因序列,双酶切pGADT7载体与E6基因PCR产物,纯化回收后,用连接酶将二者连接并转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,并对其进行双酶切和测序鉴定,构建HPV16 E6基因的真核表达载体pGADT7-E6.结果 双酶切pGADT7-E6后,琼脂糖凝胶电泳显示2个片段,分别在约500 bp与8.0 kb处.DNA测序结果经与GenBank登录的序列做BLAST分析,显示重组质粒含有477 bp的目的 基因片段,读码框正确,无碱基错配和移码突变.结论 成功构建了HPV16 E6基因真核表达载体pGADT7-E6.     

重组人乳头瘤病毒16型E7抗原痘苗病毒的构建

目的 :研究人乳头瘤病毒 16型E7(HPV16E7)基因蛋白的生物学和免疫学活性。方法 :用聚合酶链反应(PCR)技术扩增并分离出HPV16E735 9bp的基因片段 ,经XhoⅠ和BglⅡ双酶切后 ,定向插入到表达质粒PJ12 0的晚期启动子P11下游。结果 :经PCR技术、双酶切分析证明HPV16E7基因已克隆到载体PJ12 0上。结论 :HPV16E7基因痘苗病毒重组体构建成功 ,为其在真核细胞的表达奠定了基础     

人乳头瘤病毒58型E7基因重组真核表达质粒的构建与序列分析

目的:构建含人乳头瘤病毒58型(HPV58)E7基因的真核表达质粒,获得HPV58感染人后病毒基因结构的基本信息。方法:用HPV型特异性引物扩增出HPV58型E7 DNA,将HPV58 E7 DNA与PBS-T载体连接,获得克隆重组体HPV58 E7-PBS-T,经双酶切鉴定后,将E7基因与真核表达载体PCDNA3.1连接,然后经双酶切、测序鉴定,通过GenBank的数据库分析软件对HPV58型E7基因进行同源性分析。结果:双酶切重组DNA结果显示,重组体中HPV58型E7基因片段和载体DNA大小与预期计算一致,经BLAST比对,与GenBank数据库中的HPV58型E7基因序列具有高度的同源性,其中与1991年日本学者最早报道HPV58型E7基因相比,仅125位一个碱基的差异,即C-T的突变;推导相应的氨基酸由脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu)。结论:构建了含HPV58型E7基因的真核表达质粒,其基因序列与报道的基因序列高度同源,其微小差异对功能有无影响有待探讨。该重组质粒的构建为HPV58型E7基因及表达蛋白的功能研究奠定基础。     

HPV16 E6/E7融合基因真核表达载体的构建

目的构建pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。方法应用聚合酶链反应技术(polymerasechain reaction,PCR)从SiHa细胞中扩增出人类乳头瘤病毒16型(HPV16)E6/E7基因全长片段,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1上。结果获得了包含全长阅读框架的HPV16E6/E7基因,并成功克隆到真核表达载体中。结论成功构建了pEGFP-N1-E6/E7融合基因真核表达载体。     

噬菌体库技术构建HPV 16 E7人源化单克隆抗体

目的：构建抗HPV16E7的噬菌体抗体库。方法：由感染者抗凝血中分离外周淋巴细胞，提取细胞总RNA，以逆转录聚合酶链反应（RT－PCR），用人IgG Fab基因特异引物，从合成的cDNA中分别扩增出抗体轻链和重链可变区基因，回收纯化PCR产物。用SpeI XhoI酶切重链可变区基因，XbaI SacI酶切轻链可变区基因，先后克隆入噬菌体载体pComb3。结果：PCR产物经电泳证实分子量大小正确，酶切电泳证实质粒构建正确。结论：成功构建抗体轻链和重链基因克隆，建立抗HPV16E7噬菌体抗体库。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

HPV16 E6E7与C3d3 融合基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建可作为DNA疫苗的包含人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6E7与C3d3融合基因真核表达质粒,并在体外进行表达和鉴定。方法采用PCR技术扩增HPV16 E6E7片段,将该片段插入到pMDT-18载体中后,亚克隆至真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL和pSG.SS.YL,构建E6E7与C3d3融合基因及E6E7表达质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL和pSG.SS.E6E7.YL。经限制性酶切鉴定和DNA序列测定后,将重组质粒pSG.SS.E6E7.C3d3.YL、pSG.SS.E6E7.YL转染COS-7细胞,用Western blot及免疫细胞化学技术检测其表达。结果经酶切、DNA测序及转染真核细胞后表达产物的鉴定结果显示,重组质粒构建成功。结论构建的质粒可在真核细胞内正确表达,为其作为DNA疫苗诱导免疫效应的动物实验打下了基础。     

HPV16E7基因的原核克隆及表达

目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.     

HPV16 E7“自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E7基因的“自杀性”DNA疫苗，并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32／E7质粒为模板，用PCR方法扩增HPV16 E7基因，构建真核表达重组质粒pSCA／E7，经PCR、酶切和测序鉴定正确后，将重组质粒转染BHK-21细胞，然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达，用dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400bp的目的基因片段，测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100％同源。免疫荧光技术检测证实，pSCA／E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实，pSCA／E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA／E7，该重组质粒可在BHK-21细胞中表达，并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

Determination of human papillomavirus type 16 genotype and construction of cloning vector pTZ57R encoding HPV16 E7 gene

OBJECTIVE: To isolate and construct a cloning vector containing the human papillomavirus (HPV)16-E7 gene as a target for application as a DNA vaccine. METHODS: The study was performed in 2005 in Iran. The E7 gene, one of the most important HPV oncoproteins and a target molecule for therapeutic vaccines, was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The PCR product was cloned into a suitable cloning vector and confirmed by colony-PCR, restriction enzyme analysis, and sequenced. RESULTS: The desired plasmid was sequenced and indicated 99% homology with those mentioned in the Genbank. CONCLUSION: The Iranian HPV16 E7 gene sequence is very similar to other sequences in the Genbank, and it can be used as a candidate gene in a therapeutic vaccine for Iranian patients with cervical cancer.     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

pEGFP-HPV16E6/E7表达载体的构建及转染角朊细胞的瞬时表达

目的：构建ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体,观察其在角朊细胞中的瞬时。方法：基因重组技术,基因转染技术。结论 ｐＥＧＦＰ－ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７表达载体便于观察,转染细胞中ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７－ＧＦＰ融合蛋白的表达民政部及蛋白定位,适用于对ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７分子生物学特性及致瘤机理的研究。     

人乳头瘤病毒16型E7抗原表达模型的构建

目的 :构建pEGFP HPV1 6E7表达载体 ,并观察其在肝癌细胞中的瞬时和稳定表达及小鼠肝癌细胞皮下成瘤情况 ,为建立表达HPV1 6E7的实体瘤动物模型奠定基础。方法 :应用基因重组技术 ,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与HPV1 6E7的融合表达载体 ,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,用脂质体转染技术将其转入小鼠肝癌细胞 ,2 4h后RT PCR检测HPV1 6E7mRNA的生成 ,荧光显微镜观察EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达 ,将转染细胞接种小鼠皮下 ,观察成瘤及成瘤后融合蛋白的表达情况。结果 :酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段及载体DNA大小、方向和插入位点均正确 ,在转染的小鼠肝癌细胞中检测到HPV1 6E7mRNA的生成和绿色荧光蛋白的表达 ,接种的转染细胞在小鼠皮下可成瘤且可检测到HPV1 6E7mRNA的生成。结论 :pEGFP HPV1 6E7表达载体便于观察转染细胞中EGFP HPV1 6E7融合蛋白的表达情况 ,小鼠肝癌细胞接种小鼠皮下可成瘤 ,成瘤后可检测到HPV1 6E7mRNA的转录     

HPV16 E7"自杀性"DNA 疫苗的构建及其体外表达特性研究

目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。     

人乳头状瘤病毒16E7在人喉癌细胞系中的转染及表达

目的:构建含人乳头状瘤病毒16E7(HPV16E7)基因的真核表达载体,观察HPV16E7对人喉癌HEp-2细胞系生物学特性的影响,为后续实验提供研究对象.方法:以含HPV16E7基因的中间质粒pET28a-HPV16E7为模板扩增出HPV16E7基因全长序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-) B中,并进行序列分析和酶切鉴定.电穿孔法将重组体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入喉癌HEp-2细胞中,Western 印迹法检测HPV16E7蛋白的表达,相差显微镜观察转染前后的HEp-2细胞系形态学变化,流式细胞仪检测转染前后细胞生长周期的改变.结果:成功构建并将pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7转染入人喉癌HEp-2细胞中;转染后HEp-2细胞增生活跃,S期明显延长,并能够稳定表达HPV16E7蛋白.结论:HPV16E7有促进HEp-2细胞的致瘤活性;真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-HPV16E7可为下一步建立动物模型和喉癌体外治疗实验提供研究工具.     

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的 研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达截体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达截体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下现察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.结果 GFP 荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆.结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆.     

GST-HPV16E7融合蛋白的原核表达与纯化

目的 构建HPV16地方株E7基因原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化.方法 将成都本地某宫颈癌患者所感染的HPV16 E7全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-HPV16E7,转化宿主菌E.coli BL-21.经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western blot分析证实蛋白表达的特异性.并用GST亲和层析法对融合蛋白进行纯化.结果 该患者所感染的HPV16为东亚株,成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-HPV16E7并表达出GST-HPV16E7融合蛋白,证实了蛋白表达的特异性,并获得了GST-HPV16E7融合蛋白的纯品.结论 成功表达、纯化了本地流行株GST-HPV16E7融合蛋白,为进一步研究HPV16E7蛋白的功能奠定了实验基础.