牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞的促凋亡作用研究

目的探索分离培养原代正常大鼠肝细胞的条件和方法,研究牛磺酸对原代培养的正常大鼠肝细胞的促凋亡作用。方法使用经典的两步灌注法分离原代肝实质细胞后贴壁培养,记录细胞生长状况,台盼蓝拒染法测定细胞活率、绘制生长曲线。经用不同浓度的牛磺酸培养24 h后,用TUNEL法测定牛磺酸对原代培养大鼠肝细胞致凋亡作用,测定细胞凋亡率(AI)。结果两步灌注分离取得的肝细胞活率>70%,贴壁生长良好,从生长曲线可看出培养第3天进入对数生长期;TUNEL实验3个给药组AI分别为:3.71%,29.72%,42.56%。结论两步灌注法是一种细胞产量高,损伤小,纯度高的分离原代正常大鼠肝细胞的方法;高浓度的牛磺酸对体外培养肝细胞有一定致凋亡作用。     

大鼠胰岛细胞原代培养模型的研究

目的：建立一种客观的用于糖尿病和降血糖药物研究的大鼠胰岛细胞原代培养模型。方法：大鼠胰腺经胶原酶消化后，利用细胞贴壁时间、紧密程度及存活时间的差异，获得较为纯净的胰岛细胞。通过胰岛素含量测定，葡萄糖刺激实验及移植实验评价该细胞的功能。结果：分离得到的胰岛细胞成活率可达95％以上；双硫腙染色表明大部分细胞团为含有β细胞的胰岛细胞团；经RPMI 1640培养的细胞，其上清及细胞内的胰岛素含量均高于DMEM组，且对葡萄糖刺激的敏感性优于DMEM组：培养的胰岛细胞移植入1型糖尿病模型小鼠体内，可使糖尿病小鼠的血糖降至正常。结论：利用该方法得到的胰岛细胞活力和纯度均较高，体外培养后细胞功能正常，有望成为一种实用的降糖药研究的细胞模型。     

比较两种消化酶对分离大鼠肝细胞的影响

目的:比较胶原酶和胰蛋白酶在分离大鼠肝细胞数量、活力、原代培养及MTT试验等四个方面的差别。方法:分别用胶原酶和胰酶分离获取大鼠肝细胞,通过台盼蓝拒染试验测细胞活力并计数,将分离的肝细胞进行原代培养并观察肝细胞形态变化,采用噻唑蓝(MTT)试验测肝细胞的增殖状况。结果:胶原酶分离的肝细胞数量是胰酶的2．4倍,而胰酶分离的肝细胞活力是胶原酶的2．8倍;胶原酶分离的肝细胞原代培养时贴壁慢,生长不良,而胰酶分离的肝细胞贴壁快,生长良好;MTT试验结果表明胰酶分离培养的细胞活性明显高于胶原酶。结论:胶原酶分离的细胞数量及纯度优于胰酶,而胰酶分离的细胞活力优于胶原酶。     

人乳腺肿瘤原代细胞的分离培养

目的分离培养人乳腺肿瘤原代细胞,为研究人乳腺肿瘤的病理研究提供实验模型。方法采用Ⅲ型胶原酶消化法和差速离心法分离培养人乳腺肿瘤细胞,对存活乳腺肿瘤细胞进行细胞形态观察和免疫荧光染色鉴定。结果乳腺肿瘤细胞接种24 h后开始贴壁,培养8~10 d生长融合成片,在倒置显微镜下观察,细胞呈上皮细胞样,细胞角蛋白(CK)-19免疫荧光染色呈阳性,细胞纯度达到95%以上。结论采用本法体外分离培养人乳腺肿瘤原代细胞,细胞生长良好,纯度高,可用于人乳腺肿瘤病理等方面研究。     

肉苁蓉总苷对原代培养小鼠肝细胞酒精损伤保护作用研究

目的:研究肉苁蓉总苷对原代培养肝细胞的保护作用。方法:采用原位灌流法收集原代肝细胞,MTT法评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞存活率的影响;荧光显微镜技术评价肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞及细胞核形态的影响;流式细胞仪检测肉苁蓉总苷对酒精损伤原代培养肝细胞凋亡的影响;免疫细胞化学染色法检测肉苁蓉总苷对bcl-2和c-fos表达的影响。结果:原代肝细胞经酒精损伤后,存活率降低,出现明显凋亡和坏死改变,凋亡抑制基因bcl-2减弱、促凋亡基因c-fos表达增强。肉苁蓉总苷可明显提高细胞存活率,改善凋亡和坏死情况,增强bcl-2表达,抑制c-fos表达。且作用呈剂量依赖性。结论:肉苁蓉总苷可通过增加凋亡抑制基因bcl-2表达,减少促凋亡基因c-fos表达,减少凋亡和坏死,增加细胞存活率来实现对原代培养肝细胞的保护作用。     

大鼠原代神经元的培养及操作技巧

目的:建立一种实用体外原代培养新生大鼠皮层神经元的方法.方法:取24h内的SD乳鼠两侧大脑皮层,采用胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.利用免疫细胞化学进行鉴定.结果:培养的细胞贴壁生长,胞体饱满,突起较长;经神经元特异性鉴定,培养的神经元纯度可达90%以上.结论:该技术是一种可靠、稳定的获得神经元的方法,可以用于实验.     

苦参碱对人原代白血病细胞的体外作用研究

目的研究苦参碱对原代人白血病细胞的体外作用及可能的分子机制。方法取临床初诊的髓系白血病患者外周血,分离得到原代白血病细胞体外培养。不同浓度苦参碱作用后,观察细胞的形态学改变、CCK8法检测细胞增殖、Annexin V-FITC/PI分析细胞凋亡及流式检测细胞周期。结果苦参碱作用24 h,细胞增殖明显受抑,0.5、0.8 mg/m L组的生长抑制率分别为54.98%和72.96%,与对照组相比差异显著(P<0.01),抑制效应有明显剂量相关性。苦参碱作用24 h的IC50为0.5 mg/m L。苦参碱作用24 h,0.2、0.5、0.8 mg/m L组细胞早期凋亡率分别为11.8%、37.6%、54.7%,明显高于对照组自发凋亡率(7.50%)(P<0.05)。苦参碱作用48 h后,细胞周期阻滞于G0/G1→S期。结论苦参碱可显著抑制体外培养的人原代白血病细胞增殖,其机制与诱导细胞早期凋亡,促进细胞周期G1→S期阻滞有关。     

硫代乙酰胺促进骨髓间充质干细胞凋亡的研究

目的研究硫代乙酰胺(TAA)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的毒性作用。方法体外分离大鼠骨髓间充质干细胞并培养;光学显微镜下观察原代细胞生长的过程;CCK-8检测TAA对BMSCs细胞的生长抑制作用;流工式细胞术法检测细胞凋亡率;免疫印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白Bax,Bcl-2,Caspase-3的表达情况。结果分离培养的BMSCs阳性表达CD90,CD29,阴性表达CD45,CD11b/c;与对照组比较,TAA能显著的抑制BMSCs细胞增值,具有明显的时间和剂量依赖性;流式细胞术结果显示TAA能够诱导细胞凋亡;Western blot结果显示TAA能够上调Bax,Caspase-3的表达,Bcl-2的表达下降。结论 TAA对BMSCs具有促进其凋亡的作用。     

原代肝细胞培养在药物代谢研究中的应用

新鲜分离和单层培养的肝细胞已应用于药理,毒理学研究的各个方面,尤其是人原代肝细胞培养成为评价细胞色素Ｐ４５０诱导与抑制的理想体外模型。本文介绍了原代肝细胞的分离,培养方法及其在药物代谢研究中的应用。     

透骨消痛颗粒含药血清对兔软骨细胞增殖影响的研究

目的：探讨透骨消痛颗粒含药血清对兔软骨细胞增殖的影响。方法：取4周龄新西兰兔膝关节关节软骨Ⅱ型胶原酶消化,建立软骨细胞体外培养体系,体外培养第3代软骨细胞随机分为5组,分别加入培养液、空白血清和中药血清低、中、高剂量继续培养24、48、72 h后,采用流式细胞仪检测软骨细胞周期的变化。结果：流式细胞仪细胞周期检测显示中药血清中、高剂量能够刺激软骨细胞由G0/G1期进入S期和G2/M期,并呈现时间的依赖性,干预48 h后G0/G1期细胞比例降低,S期与G2/M期细胞之和增加,与低量组、空白组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。结论：透骨消痛颗粒含药血清能有效促进软骨细胞的增殖。     

吡格列酮对高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的利用体外培养的乳鼠心肌成纤维细胞,观察噻唑烷二酮(TZD)类药物吡格列酮对高浓度葡萄糖与高浓度胰岛素共同诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响,进一步推测TZD类药物对糖尿病并发心肌肥厚的可能作用机制。方法以培养的乳鼠心肌成纤维细胞为模型分组给药后。利用结晶紫染色法测定细胞的数量;利用[3H]thym id ine标记法测定细胞DNA的合成;利用流式细胞仪分析细胞周期。结果吡格列酮可以抑制高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞数量、DNA合成及S+G2+M期细胞的百分比增加,并呈一定的剂量依赖性。结论吡格列酮能有效抑制高糖高胰岛素诱导的心肌成纤维细胞的增殖,这种作用可能是通过作用于PPARγ来实现的。     

β-淀粉样蛋白对神经干细胞致凋亡作用研究

目的观察β-淀粉样蛋白(Aβ)能否诱导体外培养的大鼠神经干细胞凋亡。方法取孕13d的胎鼠大脑,体外进行培养、传代、鉴定后,加入Aβ,利用细胞计数观察细胞增生,利用琼脂糖凝胶电泳及流式细胞仪观察凋亡情况。结果当Aβ浓度>25μmol/L时,能明显抑制神经干细胞的增生,同时引起神经干细胞的明显凋亡。结论Aβ抑制神经干细胞的增生并可致神经干细胞凋亡,可能与阿尔茨海默病的发病有关。     

胰岛素对高糖所致鼠骨髓间充质干细胞增殖抑制的改善作用

目的研究胰岛素对高糖所致小鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)增殖抑制的改善作用并对其机制做初步探讨。方法首先鉴定MSCs纯度,然后给予25mmol/L葡萄糖干预,并分别给予不同浓度胰岛素予以干预,用MTT法检测细胞的增殖,并用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的改变,以期解释增殖的差异性。结果鉴定MSCs纯度>90%。胰岛素能够纠正高糖所致的MSCs增殖抑制作用(P=0.000),并且对细胞周期S期百分比没有影响(P=0.066),但是能够明显降低高血糖所致的细胞凋亡率(P=0.001)。结论胰岛素治疗对高糖所致的MSCs增殖抑制具有改善作用,凋亡率的变化可以部分解释这种作用。     

多西紫杉醇诱导宫颈癌HeLa细胞自噬性凋亡的研究

目的：观察多西紫杉醇对体外培养的宫颈癌HeLa细胞自噬性凋亡的影响,并初步探讨其可能的机制。方法：不同浓度（1、5、10、20、40μg/mL）的多西紫杉醇处理体外培养的宫颈癌HeLa细胞6、12、24、48、72h后,用MTT法测定其生长抑制率,倒置显微镜及透视电镜观察细胞形态学变化,通过流式细胞术分别测定细胞凋亡率、细胞周期分布,RT-PCR法检测自噬基因Beclin1表达的变化情况。结果：多西紫杉醇呈剂量和时间依赖性抑制宫颈癌HeLa细胞增殖（P〈0.05）;多西紫杉醇10μg/mL处理的HeLa细胞,早期（24h内）可出现明显的细胞自噬性变化,细胞凋亡数明显增加,G2/M期阻滞,且自噬基因Beclin1的表达明显增高。结论：多西紫杉醇具有抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、诱导细胞自噬性凋亡等作用,其机制可能与上调自噬基因Beclin1的表达水平有关。     

Withaferin A arrested glioblastoma cells at G_2/M phase and induced apoptosis through intrinsic pathway

OBJECTIVE To explore the efficacy and mechanism of withaferin A(WA) in Glioblastoma multiforme(GBM, WHO grade Ⅳ astrocytoma). METHODS Cell viability assay and nude mice xenograft model were used to evaluate the efficacy of WA in GBM. Flow cytometry was performed to detection the effects of WA on apoptosis and cell cycle of GBM. Western blotting and si RNA transfection were carried out to check signaling pathway induced by WA. RESULTS WA significantly inhibited the growth of GBM in vivo and in vitro. WA treatment triggered the intrinsic apoptosis of GBM cells by upregulating expression of Bim and Bad, and arrested GBM cells at G_2/M phase through dephosphorylating Thr161 of CDK1 by activating p53-independent p21 up-regulation. In addition, p21 knockdown restored progress of cell cycle and cell viability by down-regulating the expression of Bad rather than Bim. CONCLUSION WA arrested GBM cells at G_2/M phase and triggered the intrinsic apoptosis through p21-Bad axis.     

利培酮与氯氮平对离体胰岛细胞凋亡的影响

目的:探讨利培酮和氯氮平对体外培养胰岛细胞凋亡的影响.方法:利用细胞培养技术,在一定的葡萄糖浓度(5.5mmol/L)和不同作用时间(1h或4 h)下,以1μmol/L利培酮和氯氮平分别作用于体外培养大鼠胰岛细胞,以单染法流式细胞仪检测作用后胰岛细胞的凋亡率,并与相应的对照组比较.结果:利培酮作用于胰岛细胞1h和4h后,细胞凋亡情况与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05)；氯氮平作用于胰岛细胞1h和4h后,细胞凋亡情况与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)；氯氮平作用于胰岛细胞4h后与作用1h后相比,细胞凋亡差异无统计学意义(P＞0.05).结论:氯氮平可以诱导离体大鼠胰岛细胞凋亡,导致胰岛细胞DNA含量减少,而利培酮在本研究中引起离体胰岛细胞发生凋亡的现象不明显.     

Combination acetaminophen and doxapram potentiated hepatotoxicity in mouse primary cultured hepatocytes

Doxapram-induced potentiation of acetaminophen-induced reductions in cell viability and apoptosis was examined in mouse primary cultured hepatocytes. Loss of viability following exposure of acetaminophen and/or doxapram in cultured hepatocytes was assessed by monitoring [3H]-thymidine incorporation and mitochondrial activity, and apoptosis of hepatocytes was determined by nuclear microscopic observation and from detection of a ladder-like DNA fragmentation pattern in agarose gel electrophoresis. The combination of acetaminophen (5 mM) and doxapram (10, 20, 50 or 100 microM) potentiated the reduction in cell viability and increased lipid peroxide levels of hepatocytes. Hepatocytes exposed for 24 h to acetaminophen (5 mM) plus doxapram (100 microM) showed atrophy of nuclei including chromatin condensation and a ladder-like DNA fragmentation pattern characteristic of apoptosis. Antioxidant (N-acetylcysteine), iron-chelator (deferoxamine), intracellular calcium ion chelator (quin 2-AM), endonuclease inhibitor (aurintricarboxylic acid) and poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor (3-aminobenzamide) all improved the viability of cells and eliminated the ladder-like DNA fragmentation in cells exposed to acetaminophen plus doxapram. In conclusion, the combination acetaminophen and doxapram potentiated the reduction in cell viability and apoptosis in mouse primary cultured hepatocytes. We suggest that careful observation for hepatotoxicity is recommended when acetaminophen and doxapram are prescribed simultaneously.     

17β-雌二醇对人牙髓细胞增殖影响的体外研究

目的：观察不同浓度17β-雌二醇对体外培养人牙髓细胞增殖的影响。方法选取年轻恒牙,采用组织块酶消化法获取人牙髓细胞并进行原代培养。取第4代对数生长期人牙髓细胞SABC法进行波形蛋白和角蛋白免疫组化染色鉴定细胞来源。将处于对数生长期的第4代人牙髓细胞随机分为5个实验组、1个对照组和1个空白对照组,96孔培养板每组选6个孔。实验组：在有细胞孔内分别加入含2％活性碳吸附胎牛血清的无酚红高糖DMEM培养液配置的终末浓度为10－5、10－6、10－7、10－8、10－9 mol／L的17β-雌二醇。对照组：在有细胞孔内仅加入培养液。空白对照组：在无细胞孔内仅加入培养液。分别于培养48 h和72 h时用MTT比色法检测17β-雌二醇对人牙髓细胞增殖的影响。采用流式细胞术检测各浓度组17β-雌二醇对人牙髓细胞的细胞周期的影响。结果与对照组比较,在一定浓度范围内17β-雌二醇能促进人牙髓细胞的增殖和细胞周期进程,以10－8 mol／L的17β-雌二醇作用最为明显（ P＜0．05）。结论17β-雌二醇对人牙髓细胞细胞增殖有一定的诱导作用。     

Caspases在缺氧性脑微血管内皮细胞凋亡中的作用

目的研究caspases在缺氧性脑微血管内皮细胞凋亡中的作用。方法用氰化钠合并无糖培养基造成培养的牛脑微血管内皮细胞缺氧；用台盼蓝染色、TUNEL及流式细胞仪计数方法观察细胞受损和凋亡情况；用免疫细胞化学染色法观察受损细胞中caspase-3的表达。结果氰化钠合并无糖培养基可损伤牛脑微血管内皮细胞，使细胞发生凋亡，受损细胞中caspase-3大量表达。广谱caspases抑制剂、选择性caspase-1，-3和-6抑制剂均能显著减少细胞死亡数目、caspase-1和-6抑制剂可以抑制caspase-3的表达。结论Caspases在缺氧性脑微血管内皮细胞凋亡过程中起重要作用，在caspases的蛋白酶级联切割反应中caspase-3位于caspase-1和-6的下游。