高糖诱导培养的牛视网膜血管周细胞凋亡

目的探讨高糖对牛视网膜血管周细胞的影响。方法将不同浓度的葡萄糖与周细胞孵育5d，应用四唑盐比色试验描绘高糖状态下牛视网膜血管周细胞数目。应用Tunnel法和透射电镜研究高糖培养对的牛视网膜血管内皮细胞的影响。结果高糖以剂量依赖的方式抑制周细胞的增殖。电镜下，高糖培养的周细胞内发现典型的凋亡小体。高糖培养的周细胞Tunnel阳性细胞显著增加。结论高糖能减少牛视网膜周细胞数目，其机制可能在于其诱导了周细胞的凋亡。     

bFGF对兔视网膜Müller细胞表达VEGF的影响

血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是视网膜细胞分泌的两种最重要的血管生成因子.二者有协同作用,bFGF还可以诱导内皮细胞表达VEGF.视网膜Müller细胞是视网膜中分泌VEGF的主要细胞之一,为了进一步探讨Müller细胞在糖尿病视网膜病变(DR)中的作用,本研究观察了bFGF对体外培养兔视网膜Müller细胞表达VEGF的影响.     

白藜芦醇对视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF表达的影响(英文)

目的:探讨白藜芦醇对缺氧诱导的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。方法:用100μmol/LCoCl2模拟缺氧环境,以体外培养的人视网膜血管内皮细胞为模型,采用MTT法测定细胞增殖、SABC法检测血管内皮生长因子的表达,并以计算机图像分析仪进行分析,观察研究白藜芦醇对CoCl2诱导的视网膜血管内皮细胞增殖的影响。结果:白藜芦醇对CoCl2诱导的视网膜血管内皮细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.01),且呈时间和剂量依赖关系;同时,各给药组均抑制VEGF的表达(P<0.01)。结论:白藜芦醇能抑制CoCl2诱导的视网膜血管内皮细胞增殖及VEGF的表达,将为视网膜新生血管疾病的药物治疗提供一条新思路。     

曲安奈德对缺氧条件下恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖的抑制作用

目的:观察曲安奈德对正常和缺氧条件下体外培养恒河猴视网膜血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:将曲安奈德加入到培养的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF/6A)中,用MTT法测定曲安奈德对RF/6A细胞活性的影响,应用流式细胞仪观察曲安奈德对正常和缺氧条件下细胞增殖与凋亡的影响。结果:缺氧条件下可使内皮细胞周期中s期细胞相对减少,G2-M期细胞比例增加,曲安奈德对恒河猴视网膜血管内皮细胞周期有明显影响并可诱导内皮细胞凋亡。,可使正常及缺氧条件下内皮细胞周期中s期细胞相对增加,G2-M期细胞比例减少,说明曲安奈德可阻滞内皮细胞由s期进入G2-M期,从而降低其有丝分裂能力。结论:缺氧条件可促进视网膜内皮细胞的增殖;曲安奈德对正常及缺氧条件下内皮细胞的增殖有抑制作用并可诱导内皮细胞凋亡。     

共培养系统中视网膜微血管周细胞经KDR/Flk-1途径对内皮细胞增生的影响

目的:采用细胞共培养模型研究缺氧诱导视网膜新生血管生成过程中周细胞对微血管内皮细胞增生的作用及其相关血管内皮细胞生长因子受体2(KDR/Flk-1)调节机制。方法:免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管内皮细胞和周细胞,分别采用抗VIII因子、CD31抗体以及抗血小板源性生长因子受体β、结蛋白抗体免疫细胞化学法鉴定内皮细胞和周细胞。通过Millicell小室建立周细胞和内皮细胞共培养模型,使用MTT法和流式细胞仪检测内皮细胞增殖数量及周期,观察缺氧和常氧下周细胞对血管内皮细胞增生的影响,并采用RT-PCR法检测内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA水平变化,探讨相关调节机制。结果:经免疫细胞化学法鉴定,免疫磁珠法可获得高纯度的视网膜微血管内皮细胞和周细胞。MTT法显示,缺氧3～9d内皮细胞增生明显,6d增生达高峰(24.9%,P<0.01);共培养时内皮细胞的增生可被周细胞抑制。流式细胞仪检测发现,缺氧6dS期内皮细胞数量明显增加(43.9%,P<0.01);常氧(3.6%,P<0.05)或缺氧(15.1%,P<0.01)共培养时,周细胞均可抑制内皮细胞增生。缺氧下内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA水平是常氧下的1.3倍;常氧(45.1%,P<0.05)和缺氧(27.7%,P<0.05)共培养下,周细胞均可下调内皮细胞KDR/Flk-1的mRNA表达。结论:缺氧和常氧共培养时周细胞均可抑制微血管内皮细胞增生,此抑制作用部分是通过下调内皮细胞KDR/Flk-1mRNA表达实现。     

生长因子诱导的血管内皮细胞增殖作用的研究

目的 研究生长因子对血管内皮细胞增殖活动的诱导和刺激作用。以进一步探讨生长因子在视网新生血管疾病中所起的作用。方法 采用血管内皮生长因子（VEGF）和碱性成纤维生长因子（bFGF）诱导离体培养的血管内皮细胞的增殖。研究VEGF及bFGF对血管内皮细胞DNA合成、细胞生长和细胞周期的调控，以及两种因子的协同效应。结果 VEGF及bFGF均可显著刺激血管内皮细胞的增生，其刺激效应与生长因子浓度呈剂量依赖关系。共同作用时，具有协同效应。两种因子均可显著增加^3H-TdR的掺入量，其刺激作用与浓度呈剂量依赖关系，共同作用时亦具有协同效应。VEGF和bFGF均可显著地产加S期细胞的比例。结论 VEGF及bFGF均可显著地刺激内皮细胞的增殖，促进细胞DNA的合成。两种因子联合应用时，具协同效应。提示：两种生长因子在视网膜新生血管的发生和发展中可能具有一定作用，且存在因子间的协同效应。     

选择性培养牛视网膜血管内皮细胞和周细胞

目的　建立选择性培养牛视网膜血管内皮细胞和周细胞的简要方法。方法　采用机械除杂法或等密度沉降分离法 ,培养皿用不同的基质成分包埋 ,培养液中加入有利于细胞生长的添加物。结果　原代培养的牛视网膜血管内皮细胞和周细胞纯净度 >95 % ,能连续传代。周细胞在传代后不规则形状及细胞内微丝更明显。视网膜血管内皮细胞融合后呈“铺路石”样改变。视网膜血管内皮细胞对Ⅷ因子相关抗体染色阳性。视网膜周细胞对单克隆抗体α 平滑肌肌动蛋白抗体染色阳性。结论　用明胶包被培养皿 ,在培养液中加入肝素、内皮细胞生长因子及高浓度的胎牛血清可获得较纯的内皮细胞。而周细胞最适合的培养液为DMEM加入 2 0 g·L-1胎牛血清。利用Percoll分离液也可分离培养出较纯的牛视网膜血管内皮细胞和周细胞     

重组人血管抑制因子Vasostatin对视网膜血管内皮细胞增殖的影响

目的 探讨重组人血管抑制因子Vasostatin对体外培养的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF／6A)增殖的影响。方法 以bFGF刺激增殖，体外培养恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF／6A)至4代，分别加入不同质量浓度的重组人Vasostatin蛋白，并采用MTT法、^3H-TdR法检测2、4、6d时其对血管内皮细胞增殖抑制的作用，同时利用流式细胞仪对重组人Vasostatin蛋白是否诱导细胞凋亡进行了探讨。结果 MTT法、^3H-TdR两种方法均显示重组人Vasostatin蛋白以质量浓度依赖的方式抑制bFGF刺激的恒河猴视网膜血管内皮细胞(RF／6A)的增殖。流式细胞仪检测显示加入重组人Vasostatin蛋白后，G0／G1期无明显的亚二倍体核形峰出现，其不是通过诱导细胞凋亡的方式来抑制细胞增殖的。结论 重组人Vasostatin蛋白在体外具有抑制bFGF诱导的血管内皮细胞增殖的作用，其有可能成为一种有效的血管新生抑制剂。     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞增生和VEGF表达的影响

目的　观察缺氧对培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelial,RPE)细胞增生和血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的影响。 方法将培养的人RPE细胞接种于 2 4孔板 ,分别放入正常和缺氧环境中培养 ,于 1、2、3、4、5d后用四甲基偶氮唑蓝 [3 ( 4 ,5 dimethylthiazole 2yl) 2 ,5 diphenyltetrazoliumbromide ,MTT]比色法检测RPE细胞的增生 ,于 6、12、2 4h后用免疫组织化学法检测RPE细胞对VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析。结果　缺氧组的MTT实验吸光度 (A值 )均高于正常组 (P <0 .0 1) ;抗VEGF抗体染色 ,缺氧组明显强于正常组 (P <0 .0 5 )。结论缺氧可促进RPE细胞的增生及其对VEGF的表达 ,控制RPE细胞的活动是抑制脉络膜新生血管生成的关键     

血管内皮生长因子受体与眼新生血管及增生性病变

血管内皮生长因子（VEGF）是一种特异性刺激血管内皮细胞增殖和新生血管形成的生长因子,是最直接的血管内皮细胞促分裂素,与血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合而发挥各项功能。在视网膜细胞、色素上皮细胞、表皮细胞、M(?)ller细胞内均有VEGFR表达。缺氧可上调其基因表达,直接造成视网膜新生血管形成及增生性玻璃体视网膜病变。对VEGFR结构、功能、与新生血管的关系,VEGFR表达增高所导致的病理变化,VEGFR高表达的调节因素,如何抑制VEGFR阻断VEGF/VEGFR信号传导途径抑制VEGF作用等方面进行了较为全面的综述。     

缺氧状态下牛视网膜色素上皮细胞增殖与VEGF分泌的研究

目的:探讨缺氧对牛视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞分泌血管内皮细胞生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)的作用及VEGF与RPE细胞增殖的相关性。 方法:以不同环境(正常:5％ CO_2,95％空气,37℃;缺氧:3％ O_2,5％ CO_2,92％ N_2,37℃)下培养的牛RPE细胞为研究对象,抗VEGF单克隆抗体(VEGF M_(Ab))为干预剂,培养24h后收集上清:(1)ELISA VEGF kit测定VEGF含量;(2)用四甲基偶氮唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazole-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid,MTT]比色法观察不同培养环境下抗VEGF单克隆抗体干预时细胞的增殖程度。 结果:吸光度A值和VEGF含量:缺氧加VEGF MAb组(A组)分别为(1.812±0.068)、(55.07±19.18)pg/ml;缺氧无VEGF MAb组(B组)分别为(2.292±0.197)、(171.61±16.02)pg/ml;正常加VEGF MAb组(C组)分别为(1.350±0.185)、(43.92±21.39)pg/ml;正常无VEGF MAb组(D组)分别为(1.435±0.157)、(48.51±24.73)pg/ml。其中A组细胞增殖程度和VEGF含量均较B组明显降低,两组之间的差异均具有显著性(P<0.05)。A组与D组在细胞增殖程度上差异有显著性,P<0.05;B组细胞增殖程度和VEGF含量均较C组明显增高,两组之间的差异均具有显著性(P<0.05);通过Pearson Correlation相关分析发     

周细胞对缺氧诱导下视网膜微血管内皮细胞增生的影响

目的探讨视网膜微血管内皮细胞（RMECs）与共培养的周细胞（PCs）及PCs条件培养液（PCM）对常氧和缺氧条件下RMECs增生的影响。方法传代培养大鼠RMECs和PCs,采用兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体和小鼠抗大鼠CD31单克隆抗体免疫组织化学法鉴定RMECs,PCs采用小鼠抗大鼠desmin多克隆抗体和兔抗鼠抗血小板衍生生长因子受体-β（PDGFR-β）进行免疫荧光双标鉴定。Millicell小室建立PCs和RMECs共培养系统,PCs培养近融合期后制备PCM,向共培养系统或PCM中加入终浓度为200μmol/L的CoCl2诱导形成细胞化学缺氧模型,观察常氧和缺氧条件下PCs和PCM对RMECs增生的影响。使用MTT法、3H-TdR掺入法检测RMECs在不同培养条件下的增生数量,并用流式细胞仪检测RMECs在不同细胞周期的细胞率。结果近融合期的RMECs呈类纺锤状、单层生长,可见明显的接触抑制,Ⅷ因子和CD31均阳性表达。PCs形状不规则,细胞重叠生长无接触抑制,PDGFR-β和desmin抗体双标阳性。缺氧3～9d缺氧RMECs单独培养组较常氧RMECs单独培养组各时间点的RMECs均明显增生,缺氧6d时增生达高峰（P〈0.01）,细胞生长抑制率（GIR）为-24.9%。缺氧共培养组较缺氧RMECs单独培养组RMECs增生下降（P〈0.05）。缺氧3、6、9d时常氧共培养组较常氧RMECs单独培养组RMECs数目均明显下降（P〈0.05,P〈0.01,P〈0.01）。缺氧6d时S期RMECs数量明显增加,占各期细胞总数的（43.9±0.8）%;常氧或缺氧共培养组,PCs均可抑制RMECs的增生,S期细胞分别占各期细胞总数的（3.6±0.1）%、（15.1±0.9）%（P〈0.05,P〈0.01）。常氧PCM组RMECs的吸光度（A）值和3H-TdR掺入量4～24h均低于对照组（P〈0.05）。结论缺氧和常氧条件下RMECs和PCs共培养时PCs均可抑制RMECs的增生,常氧条件下PCM可抑制RMECs的增生。     

Inhibitory effect of 2'-O-benzoylcinnamaldehyde on vascular endothelial cell proliferation and migration

PURPOSE: To evaluate the inhibitory effect of the farnesyl transferase inhibitor 2'-O-benzoylcinnamaldehyde (CB 2'-ph) on proliferation and migration of vascular endothelial cells. METHODS: Bovine lens epithelial cells, bovine corneal endothelial cells, bovine keratocytes, bovine aortic endothelial cells (BAECs) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were treated with CB 2'-ph to determine its cell type specificity and antiproliferative effect. For inhibition of vascular endothelial cell growth factor (VEGF)- or basic fibroblast growth factor (bFGF)-induced proliferation of HUVECs, these cells were treated with various concentrations of CB 2'-ph. To assess the proliferation, MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay was used. The migration assay was also performed to determine the effect of CB 2'-ph on HUVECs. The distance of HUVEC outgrowth was measured from the scraped edge of a monolayer after treatment with CB 2'-ph concentrations of 0, 1.5 and 2.5 microg/ml for 24, 48 and 72 h. RESULTS: The CB 2'-ph had an inhibitory effect on all tested types of cell proliferation but only HUVEC and BAEC proliferation was specifically inhibited in a dose-dependent manner. In addition, CB 2'-ph inhibited VEGF- or bFGF-induced proliferation and migration of HUVECs in a dose-dependent manner. CONCLUSIONS: These results indicate that CB 2'-ph, a farnesyl transferase inhibitor is thought to be an effective inhibitor of vascular endothelial cell proliferation and migration.     

Characterization of the basic fibroblast growth factor-evoked proliferation of the human Müller cell line,MIO-M1

Background Basic fibroblast growth factor (bFGF) has been suggested to mediate activation of Müller glial cells in the ischemic–hypoxic retina. However, the intracellular pathways activated by bFGF in human Müller cells have been little explored. We characterized the signaling transduction pathways which are involved in the control and growth factor-evoked proliferation of a recently described human Müller cell line, MIO-M1. In addition, we investigated whether bFGF evoked the release of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor (HGF) from the cells.Methods The growth factor-evoked proliferation of cultured MIO-M1 cells was estimated by means of a bromodeoxyuridine immunoassay, in the absence and presence of blockers of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and of the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K). The activation state of the p44/p42 MAPK was determined by Western blotting, and the bFGF-evoked release of VEGF and HGF was evaluated by ELISA.Results bFGF evoked a concentration-dependent increase of the cell proliferation, with an EC₅₀ of ~1 ng/ml, via activation of both the p44/p42 MAPK and the p38 MAPK. In contrast, the mitogenic effects of the platelet-derived and the heparin-binding epidermal growth factors were dependent on p44/p42 MAPK activation and independent of activation of p38 MAPK. The transforming growth factors 1 and 2 also evoked cell proliferation which was independent of activation of the MAPKs investigated. bFGF evoked a release of VEGF and of HGF by the cells; these effects were independent of MAPK activation and were possibly mediated by activation of the PI3K signaling pathway.Conclusion bFGF evokes multiple intracellular signaling pathways in human Müller cells which underlie the gliotic cell responses upon ischemic–hypoxic insults in the retina. Beside the stimulation of cell proliferation, which is dependent on activation of p44/p42 and p38 MAPKs, bFGF induces the secretion of VEGF and HGF by Müller cells.     

In vitro studies on the mechanism of action of VEGF and its inhibitors

VEGF expression and signalling are deregulated in diabetic retinopathy. Cellular processes like migration and proliferation as well as control of the permeability of the endothelium by VEGF are regulated as a consequence of its binding to the VEGF receptor 2. Proteins forming tight junctions between microvascular endothelial cells of the retina are delocated to the cytoplasm after treatment with VEGF(165), likely leading to the breakdown of the blood-retina barrier. VEGF-inhibitors such as a VEGF-aptamer (modified RNA-oligonucleotide; pegaptanib) or specific antibodies/antibody fragments (bevacizumab, ranibzumab) which directly interfere with the interaction of VEGF with its receptors are considered to be promising novel therapeutics to treat diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. In vitro studies using microvascular endothelial cells will help to clarify the mechanisms of action of VEGF and its inhibitors. In particular, the influence of VEGF isoforms and the inhibitor ranibizumab on the proliferation and migration of bovine retinal microvascular endothelial cells was studied, as well as the rearrangement of tight-junction proteins after treatment of the cells with VEGF(165) and specific inhibitors. In addition to a review of recent publications in the field, primary data from our own studies are presented in this article.     

紫外线对翼状胬肉细胞的作用

目的研究紫外线对翼状胬肉细胞的作用，探讨紫外线和翼状胬肉发生发展的关系。方法收集翼状胬肉标本，采用血管内皮细胞和成纤维细胞单独培养、条件培养和共同培养的方法构建体系，用MTY法选择紫外线照射细胞的适宜强度；采用M1Tr法绘制强度20mJ／cm2紫外线照射下细胞生长曲线；采用ELISA和RT—PCR检测紫外线照射下3种体系中细胞上清液和细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（bFGF）的蛋白和RNA含量变化。结果不同强度紫外线照射细胞活性实验，选择20mJ／cm2强度作为实验照射基数；翼状胬肉微血管内皮细胞（PE）和成纤维细胞（PF）在紫外线照射下，细胞活性下降；单独培养PE受紫外线照射后VEGF的RNA含量和上清液VEGF蛋白含量，照射组较未照射组有显著性下降（P〈0．05）；单独培养和条件培养PF受紫外线照射后VEGF的RNA含量和上清液VEGF含量，照射组较未照射组有显著性下降（P〈0．05）。3种体系PE和PF照射后bFGF的RNA含量及细胞上清液中bFGF的蛋白含量，照射组较未照射组呈显著性下降（P〈0．05）。结论紫外线对体外培养的血管内皮细胞和成纤维细胞生长有抑制作用。