竞争性逆转录聚合酶链反应定量检测对HCV RNA

为了解感染丙型肝炎病素（ＨＣＶ）后的（ＨＣＶＲＮＡ）含量与丙型肝炎病情轻重，预后，治疗反应的关系，采用竞争性逆转录聚合酶链反应（ＣＲＴ－ＰＣＲ）的方法，对９例感染了ＨＣＶ患者的血清进行了ＨＣＶＲＮＡ的定量检测。结果：６．６×１０３拷贝１毫升占８８．９％，６．６×１０４拷贝／毫升占１１．１％。结果提示：急慢性丙型肝炎及无症状ＨＣＶ感染者体内均含有较高的病毒滴度，且滴度低预后好，抗病毒疗效好。     

两种实时荧光定量聚合酶链反应检测血清HCV RNA的比较

目的 比较全自动病毒载量检测系统(COBAS TaqMan)和国产荧光定量PCR试剂盒对血清HCV RNA载量的检测结果,探讨两种检测方法在临床诊断和治疗中的应用价值.方法 收集26例慢性丙型肝炎患者抗病毒治疗前和治疗过程中2、4、8、12、24、36和48周的系列血标本,共168份,采用COBAS TaqMan 48全自动分析系统和广州某国产TaqMan实时PCR试剂盒分别检测系列血清中的HCV RNA载量.统计学处理采用x2检验和t检验.结果 当血清HCV RNA≥1×104IU/mL时(0周),COBAS检测和国产试剂盒均能很好测定HCV载量,而且国产试剂盒检测值为1.35×107IU/mL高于COBAS检测值2.21×106IU/mL,差异有统计学意义(t=2.05,P<0.05);血清HCV RNA<1×104IU/mL时(2～48周),COBAS检测出的HCV阳性率为21.4%(30/140),远高于国产试剂盒的1.4%(2/140),差异有统计学意义(t=3.66,P<0.01);治疗4周时,COBAS检测26例患者中14例血清HCV为阳性,12例病毒载量低于检测下限,获得快速病毒学应答(RVR);国产试剂盒检测结果为3例血清HCV为阳性,23例获得RVR.COBAS与国产试剂盒梧比,转阴率差异有统计学意义(x2=10.575,P<0.01).治疗12周时,COBAS检测完全早期病毒学应答(cEVR)率为95.7%(22/23),国产试剂盒检测的cEVR为100%(17/17),差异无统计学意义(x2=0.726,P>0.05).结论 国产荧光定量PCR试剂盒可用于HCV疑似患者的筛查和高HCVRNA载量者的确诊,对于低HCV RNA载量的疑似患者和抗病毒治疗过程中HCV载量的检测,COBAS则更为敏感.

Abstract：

Objective To compare the plasma hepatitis C virus(HCV)RNA levels detected by the fully automated viral load detection system(COBAS TaqMan)and the national real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR)kit,and to investigate the clinical application value of these two methods in clinical practice.Methods A total of 168 serial plasma samples collected from 26 patients with chronic hepatitis C(CHC)before and at week 2,4,12,24,36 and 48 of antiviral treatment were detected by both COBAS Taqman 48 analyzing system and the national real-time quantitative PCR kit.The results of two methods were compared by chi square test and t test.Resnlts Both COBAS and national kit showed great positive detecting results when HCV RNA≥1×104IU/mL(at week O),and the virus load value detected by national kit was significantly higher than that detected by COBAS(t=2.05,P<0.05).However,when HCV RNA<1×104(at week 2-48),the positive rate of HCV detected by COBAS was significantly higher than that detected by national kit (t=3.66,P<0.01).At week 4 of treatment,the rapid virological response(RVR)rate was 46.2 % (12/26)detected by COBAS,while that was 88.5%(23/26)detected by national kit,and the difference was significant(x2=10.575,P<0.01).At week 12 of treatment,the complete early virological response(cEVR)was 95.7%(22/23)detected by COBAS,while that was 100%(17/17)detected by national kit,and the difference was not significant(x2=0.726,P>0.05).Conclusions The national TaqMan real-time quantitative PCR kits could be used to screen the suspected cases of HCV infecrion and to diagnose CHC cases with high HCV virus load.COBAS detection is more sensitive in cases with low HCV virus load and in on-treatment monitor during anti-HCV therapy.     

荧光定量PCR与微粒子酶免分析法同步检测HCV对比分析

目的　对荧光定量PCR与微粒子酶免分析法 (MEIA法 )同步检测HCV进行比较。方法　收集北京协和医院 2 0 0 3- 0 1～ 12门诊及住院 5 0例ALT正常 ,无恶心、呕吐、乏力、黄疸临床表现 ,行胃镜和肠镜检查的门诊病人。检查前用MEIA法检测HCV 3抗体弱阳性 (1～ 2 0S/CO) ,对其进行荧光定量PCR检测HCV RNA ;5 0例用荧光定量PCR检测HCV RNA阳性血清 (HCV RNA≥ 5 0× 10 5copies/L) ,再进行HCV 3抗体检测。 结果　MEIA法检测HCV 3抗体阳性在 1～ 2 0S/CO且ALT正常病人 ,用荧光定量PCR检测HCV RNA含量 ,3例(6 % )高于最低检测限 (5 0× 10 5copies/L)。对 5 0例用荧光定量PCR检测HCV RNA阳性血清 (HCV RNA≥ 5 0× 10 5copies/L) ,且ALT正常病人 ,进行HCV抗体检测 ,2例 (4 % )丙肝抗体阴性 ,余丙肝抗体数值在 80～ 15 0S/CO。结论　MEIA法在AXSYM机器上检测HCV 3抗体弱阳性时 ,不能轻易得出丙肝的诊断 ,应检测HCV RNA并结合临床表现。定量PCR不适宜检测含量较低的HCV RNA ,MEIA法在AXSYM机器上检测HCV抗体作为献血员筛查不失为一种好方法。     

荧光定量PCR检测HBV-DNA和ELISA检测HBsAg的分析比较

目的：研究血站开展HBV-DNA检测的必要性。方法：对205份HBsAg有反应性标本（s／co≥1）,108份HBsAg灰区可疑标本（0．8≤s／co〈1）及1000份HBsAg无反应性标本（s／co〈0．8）分别作FOPCR检测以及对部分样本作HBV-M5项（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb）检测。结果：3类标本HBV-DNA有反应性数分别为117例,32例,6例,作HBV-M检测的样本有多种不同的表现模式。结论：在ELISA检测HB-sAg基础上加做HBV-DNA核酸检测,有助于保证输血安全。     

罗氏COBAS HCV RNA定量一代和二代检测试剂对556例丙型肝炎患者HCV RNA定量检测结果的比较

目的评估两代HCV核酸定量检测试剂的临床应用。方法收集南京市第二医院住院和门诊HCV感染者556例,采用罗氏COBAS HCV核酸定量一代和二代检测试剂检测其标本,其中HCV RNA阴性血浆93份;HCV RNA阳性血浆350份;血清血浆配对标本52份;干扰样本61份。将阳性血浆样本分为3组,低浓度(3次方及以下)61例、中浓度(4、5次方组)191例和高浓度89例(6次方及以上)。采用线性分析法,计算相关系数和回归方程,比较各组之间的关系。结果总体分析2种HCV RNA定量检测试剂的结果具有相关性(r=0.948,P0.05)。低浓度组的线性回归方程y=0.9809x+0.1359,r2=0.8047,P0.05;中浓度组的线性回归方程y=0.8130x+1.0727,r2=0.6956,P0.01;高浓度组的线性回归方程y=0.6746x+1.8914,r2=0.3088,P0.01。血清血浆有效对比检测结果的相关性良好(r2=0.9698,P0.05),线性回归方程y=0.9368x+0.4469。结论两代HCV RNA定量检测试剂符合程度较好,在低浓度组中具有良好的相关性,更适用于临床HCV RNA低浓度的检测。     

血清抗—HCV与HCV RNA检测结果比较

采用逆转录一大一聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅ－ＰＣＲ）及ＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ）对一组经第二代抗－ＨＣＶ ＥＬＩＳＡ（上海科华生物技术有限公司，科华）试剂筛选的抗－ＨＣＶ阳性血清及抗－ＨＣＶ阴性的非甲非乙型肝炎患者清，进行了ＨＣＶＲＮＡ与抗－ＨＣＶ检测。对两者检测结果表明相互关系进行了分析与比较。结果显示：Ａｂｂｏｔｔ与科华ＥＬＩＳＡ试剂两者抗－ＨＣＶ检测的阳性符合率及总符合率为７７．７％及７     

巢式PCR检测血液病血清中HCV RNA

巢式ＰＣＲ检测血液病血清中ＨＣＶ　ＲＮＡ仉红刚，张秋菊，王景明通过输血途径感染丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是血液病治疗中的一个长期潜在的并发症。为难确、及时地检测ＨＣＶ的近期感染，采用巢式ＰＣＲ技术对４６例血液病患者血清中ＨＣＶＲＮＡ进行了检测研究，现将有...     

血清抗－HCV与HCV RNA检测结果比较

采用逆转录一套式－聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔｅ－ＰＣＲ）及ＥＬＩＳＡ（Ａｂｂｏｔｔ）对一组经第二代抗－ＨＣＶＥＬＩＳＡ（上海科华生物技术有限公司，科华）试剂筛选的抗－ＨＣＶ阳性血清及抗－ＨＣＶ阴性的非甲非乙型肝炎患者血清，进行了ＨＣＶＲＮＡ与抗－ＨＣＶ检测。对两者检测结果及相互关系进行了分析与比较。结果显示：Ａｂｂｏｔｔ与科华ＥＬＩＳＡ试剂两者抗－ＨＣＶ检测的阳性符合率及总符合率为７７．７％及７９．８％。两者与ＨＣＶＲＮＡ检测阳性结果的符合率分别为４９，７％及５６．３％。２０８份血清中ＨＣＶＲＮＡ阳性１０９份，其中抗－ＨＣＶ阳性组ＨＣＶＲＮＡ阳性率为６０．２％，较之抗－ＨＣＶ阴性之非甲非乙型肝炎ＨＣＶＲＮＡ阳性率（５０．０％）为高，其在ＰＣＲ试验中呈阳性与强阳性反应者的比率，前者亦显著高于后者（８５．２％与２５．ｏ％，Ｐ＜０．０１）。     

尖锐湿疣患者荧光定量PCR检测结果分析

目的探讨尖锐湿疣患者疣体中人乳头瘤病毒(HPV)分型、基因含量及其意义。方法采用荧光定量PCR技术(FQ-PCR)检测尖锐湿疣患者疣体中HPV-DNA含量及其型别。结果169例尖锐湿疣患者经FQ-PCR检测后168例(99.41%)阳性,其中HPV6/11型阳性150例(88.76%),平均1.2×107拷贝/ml;HPV16/18型阳性13例(7.69%),平均2.3×106拷贝/ml;HPV6/11和HPV16/18型同时阳性5例(2.96%),平均1.0×107拷贝/ml;4型均阴性1例(0.59%),定量为0×10拷贝/ml。结论HPV6/11型是尖锐湿疣发病的主要型别,尖锐湿疣患者疣体中HPV-DNA含量与其是否复发无明显关系,FQ-PCR可作为尖锐湿疣早期诊断的指标。     

肝细胞癌组织中HCV基因型的逆转录原位PCR检测

目的 从分子病理学水平探讨HCV基因型与HCE发生的关系.方法 采用逆转录原位PCR法对95例HCC及其非癌组织中1b型和2a型HCV进行检测,同时采用Okamoto法对HcC组织RNA抽提物中HCV基因型加以验证.结果 HCC中HCV阳性率为44%(42/95),检出3种HCV基因型,包括1b(13例,31%)、2a(23例,55%)、混合型(1b+2a,2例,5%)和3a(4例,10%),1b型检出率(14%)与2a型者(24%)无显著性差异(χ2=3.427,P＞0.05),两型与HCE主要病理学参数的相关性相似.2a型阳性细胞在癌和非癌区的分布相似,而1b型在癌组织多呈局灶分布,在非癌区多呈局灶/弥漫分布.HCG中1b型HCV的核一胞质型/核型阳性信号较2a型者明显多见(χ2=4.073,P＜0.05).去除逆转录并用RNase A处理后,1b型和2a型HCV仍分别有5例和9例可见阳性信号.结论 我国两种常见的HCV基因型与HCC发生的相关性相似,HC/3中HCV相关DNA及其与宿主基因组整合的可能性不能除外.     

HIV-HCV合并感染者血清HCV RNA的定量检测

人类免疫缺陷病毒(HIV)与丙型肝炎病毒(HCV)传播途径相同，二者可以合并感染。据报道，在美国和欧洲有约30％的HIV感染者合并有HCV感染，而在吸毒人群中HIV—HCV的合并感染率高达60％～90％。国外研究显示，HIV感染会对HCV的病程造成影响，加快肝硬化的进程提前进入肝功能衰竭；而HCV又会加速HIV引起的CD4细胞破坏，促进HIV复制，使HIV进展到艾滋病(AIDS)相关疾病及死亡的时间缩短。目前，国内对HIV—HCV合并感染的研究报道较少。为了探索国人HIV—HCV合并感染对两种疾病的相互影响，     

液滴式数字PCR与实时荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法比较

目的 建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,将其与同时建立的实时荧光定量PCR检测方法进行方法学比较,探究其在内脏利什曼病诊断方面的价值。方法 以杜氏利什曼原虫小环动基体DNA(kinetoplast DNA,kDNA)为分子靶标,根据其约200 bp的保守片段设计引物和探针,建立内脏利什曼病液滴式数字PCR检测方法,比较其与实时荧光定量PCR检测方法的检测限、精密度以及在不同利什曼原虫虫株中的检测效果。结果 液滴式数字PCR检测下限与实时荧光定量PCR检测下限相同,约为1.0×10 copies/μL;随待测样本浓度的降低(1.0×10⁴ copies/μL～1.0×10 copies/μL),液滴式数字PCR检测方法变异系数呈增大趋势(12.07%～62.96%),重复性越差;实时荧光定量PCR变异系数较小(2.96%～4.26%),且不同浓度之间的变异系数差别不大。2种方法在不同利什曼原虫中的检测灵敏度不同。结论 和实时荧光定量PCR相比,液滴式数字PCR在利什曼原虫检测中的灵敏度和重复性没有表现出显著的优势,后续还需更多的研究从分子靶标的选择、灵敏度、...     

三联放大技术与荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的应用比较

目的通过比较聚合酶链反应偶联印迹杂交和酶联放大技术(即三联放大技术)与荧光定量PCR(FQ-PCR)两种方法检测HBV DNA结果,探讨三联放大技术用于血液HBV筛查的优越性。方法医院肝病门诊患者血清195份,同时进行三联放大技术检测和FQ-PCR检测,比较检测结果。结果195份血清,经三联放大技术检出HBVDNA 125份,检出率64.10%;FQ-PCR检出HBV DNA 103份,检出率52.82%。两种方法的HBV DNA检出率差异有统计学意义(P0.01)。结论与FQ-PCR比较,三联放大技术能显著提高HBV DNA的检出率,可用于血液HBV筛查。     

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR)方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针,以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900HT)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果几乎为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0~2.1%之间,证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本,结果与套式PCR检测结果有密切相关性,但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。     

实时荧光定量RT-PCR检测血清和单个核细胞中HCV RNA的意义

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测血清和外周血单个核细胞(PBMCs)中HCV RNA含量及其临床价值。方法采集可疑丙型病毒性肝炎病人血,用FQ-RT-PCR分别检测血清和PBMCs中HCV RNA含量。血清或PBMCS HCV RNA阳性者都视为HCV RNA阳性。结果检测可疑患者180例,HCV RNA阳性106例。其中血清HCV RNA阳性84例,占79.25%;PBMCs HCV RNA阳性63例,占59.43%。HCV RNA阳性比率血清高于PBMCs(χ2=9.78,P<0.01)。单独血清HCV RNA阳性43例,占40.57%;单独PBMCs HCV RNA阳性22例,占20.75%;血清和PBMCs中HCV RNA同时阳性41例,占38.68%。血清和PBMCs HCV RNA含量差异无显著性。结论同时检测血清和PBMCs HCV RNA可提高HCV感染诊断的阳性率,检测PBMCs HCV RNA对抗病毒治疗的疗效评价及治疗时间有重要意义。     

HBV DNA荧光定量PCR检测的临床意义

乙型肝炎病（ＨＢＶ）毒核酸定量测定方法经过近几年的长足发展,迄今已有数种检测设备和商业化试剂盒面市,其中Ｒｏｃｈｅ公司新开发的Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ荧光定量ＰＣＲ仪和深圳匹基公司推出的ＨＢＶ荧光定量ＰＣＲ（ＦＱ－ＰＣＲ）检测法的临床应用鲜见报道。我们采用上述设备和试剂定量测定ＨＢＶ ＤＮＡ并探讨其临床意义。 一、资料和方法 １．研究对象：我所２００１年１月至６月收治的门诊和住院患者共１５３例。 ２血清标志物检测：由本所临床检验室测定。ＨＢＶ标志检测采用军事医学科学院四环公司研制的试剂盒,ＨＢＶＤＮＡ…     

三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较

目的 选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529 bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-timePCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法 将529 bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR。结果 529 bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R²)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为 86.5±0.5 ℃ 、78.8±0.5 ℃、83.1±0.5 ℃;构建的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529 bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2 ℃、78.9 ℃和83.3 ℃,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529 bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为 173copies/μL、123copies/μL、和135 copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13%;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P＜0.01)。结论 建立弓形虫三重SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性,可为临床弓形虫的诊断提供科学依据     

固相杂交检测HCV RNA PCR产物方法的建立

目的建立简便、快速的丙型肝炎病毒基因扩增产物的固相杂交检测方法．方法将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的丙肝病毒基因产物,与通过结合在微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值．结果应用本方法对血清中丙型肝炎病毒核酸检测,灵敏度可达５拷贝～５０拷贝／反应．结论此方法简便、快速、特异性好、敏感性高、结果判定指标客观,可广泛应用于病毒感染的临床诊断和疗效评价及其他基因的扩增检测和基因分型等