雌激素在体外对大鼠成骨细胞的作用*★

目的：近来研究表明雌激素除抑制骨吸收外，还具有促进成骨的作用。实验拟观察雌激素在体外对大鼠成骨细胞的影响。 方法：实验于2007-03在上海复旦大学放射医学研究所骨代谢研究室完成。①实验材料：1日龄SD新生大鼠（红皮鼠）10只，清洁级，体质量约10 g 左右。雌雄不拘。②实验方法：取大鼠颅盖骨机械分离加酶消化法体外分离培养成骨细胞，取传一代细胞，以1.25×106 L-1 的密度接种于96孔细胞培养板，培养24 h 后分为两组，分别为空白对照组和10-8 mmol/L 雌激素组（加入1×10-8 mmol/L 雌二醇），继续培养72 h。③实验评估：碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞；四甲基偶氮唑盐法检测成骨细胞的增殖能力；PNPP法测定碱性磷酸酶活性。低倍镜下测量矿化结节面积并计算面积比，观察雌二醇对矿化能力的影响。 结果：①体外分离培养的成骨细胞碱性磷酸酶染色成阳性。原代培养的细胞纯率超过90%。②与空白对照组相比，10-8 mmol/L 雌激素组成骨细胞增殖能力及碱性磷酸酶活性显著提高（P < 0.01）；10-8 mmol/L 雌激素组单位细胞数碱性磷酸酶活性较空白对照组有上升趋势，但差异无显著性（P > 0.05）。③与空白对照组相比，10-8 mmol/L 雌激素组矿化面积及矿化面积比显著增加（P < 0.01）。 结论：雌二醇在体外可促进大鼠成骨细胞生长和增殖，提高碱性磷酸酶活性，并促进骨矿化物质在骨内沉积。     

黄芪调控体外培养大鼠成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达

背景：Ⅰ型胶原是体外培养成骨细胞所分泌的特异性胶原蛋白,所形成的网状结构也是成骨细胞矿化功能实现的前提,也是反映成骨细胞骨形成能力的重要指标。诸多报道反映了应用单味黄芪促进成骨细胞增殖的功能,但缺少有关黄芪促进Ⅰ型胶原分泌及表达的研究。 目的：观察黄芪注射液对体外培养新生大鼠颅盖骨成骨细胞增殖及分泌Ⅰ型胶原能力的影响。 方法：体外分离培养大鼠成骨细胞。分为用含小牛血清的MEM培养液培养的对照组,分别加入相应体积分数黄芪注射液培养的黄芪组,于培养1,3,5,7,9 d 以四甲基偶氮唑盐法观察成骨细胞增殖的影响;以Real-time PCR方法检测黄芪注射液干预6 h后成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白α1 mRNA的表达情况,并用in cell western方法测定培养6 d时成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白的分泌。 结果与结论：从培养3 d开始直至培养9 d,与对照组比较,各体积分数的黄芪注射液均能促进成骨细胞的增殖 (P < 0.05),这一趋势在培养7 d时达到最高峰。不同体积分数的黄芪注射液均能促进COLLα1 mRNA的表达,尤其以15%的黄芪作用明显。以15%和10%的黄芪注射液培养的成骨细胞Ⅰ型胶原的表达量明显高于对照组(P < 0.05)。结果证实,黄芪可以促进体外培养的成骨细胞的增殖和分泌Ⅰ型胶原的能力,但具有一定的量效趋势。     

降钙素基因相关肽诱导脂肪干细胞向成骨细胞的分化

背景：已证实降钙素基因相关肽可促进成骨细胞的增殖与分化，并加速骨折的愈合、促进异位骨化的形成，但其是否具有促使脂肪干细胞向成骨细胞定向分化的作用作者未查到相关报道。 目的：探讨降钙素基因相关肽在体外定向诱导脂肪干细胞向成骨细胞增殖分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，基因及蛋白质学检测，于2006-10/2007-08在武汉大学医学院中心实验室和三峡大学医学院病理实验室完成。 材料：清洁级4月龄健康新西兰大耳白兔2只。 方法：密度梯度离心+贴壁法体外分离培养兔脂肪干细胞，传至第3代分为2组：对照组加入含10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 mg/L抗坏血酸、1×10-8 mol/L地塞米松、体积分数为0.15的胎牛血清的RPMI 1640骨诱导培养基，实验组在此基础上加入1 μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。 主要观察指标：细胞形态学变化，免疫组织化学染色测定细胞碱性磷酸酶活性，四环素标记法检测矿化结节的形成，RT-PCR和Western blot法检测成骨细胞标志性蛋白I型胶原、骨钙素的表达。 结果：实验组脂肪干细胞经成骨诱导培养后，形态规则、多角型细胞增多，细胞倍增时间明显短于对照组。随诱导时间的延长，实验组细胞碱性磷酸酶活性呈增加趋势，诱导7，10，14 d细胞碱性磷酸酶活性均显著高于对照组(t=13.26，P < 0.01)。诱导21 d与对照组比较，实验组形成的金黄色圆形矿化结节数量增多，结节增大。诱导7 d，14 d实验组I型胶原及骨钙素mRNA、蛋白水平的表达均强于对照组。 结论：在体外降钙素基因相关肽能诱导并促进兔脂肪干细胞向成骨细胞方向分化。     

纳米级颅骨替代及诱导材料与颅骨成骨细胞的生物相容性体外实验研究

目的观察新型纳米级颅骨替代及诱导材料对体外培养的颅骨成骨细胞生长的影响，评价其生物相容性，为新型颅骨修复材料的临床应用提供依据。方法体外培养兔颅骨骨膜成骨细胞，将成骨细胞与纳米级颅骨替代材料及诱导材料一同培养。观察成骨细胞的形态学、生长情况及成骨能力变化。结果体外培养的兔颅骨骨膜源性细胞具有典型的成骨细胞形态，且具有体外成骨能力。与新型颅骨修复材料联合培养后细胞形态正常，生长繁殖良好，能够在材料表面成骨；与共培养前比较，细胞周期及生长曲线无显著性差异。结论纳米级颅骨替代及诱导材料具有良好的生物相容性。     

降钙素基因相关肽与骨修复及骨重建

骨折的愈合过程是通过一系列复杂的因子来调节完成的，其中，降钙素基因相关肽已经被证实在骨代谢中发挥合成作用。有人发现在骨折局部含降钙素基因相关肽的神经纤维明显增加。降钙素基因相关肽是表达于骨组织的一种重要的感觉神经肽，虽然最初发现其主要作用是扩张血管，增加血流量，但是大量的动物实验结果表明，成骨细胞定向表达降钙素基因相关肽可以增加骨密度，刺激松质骨形成。尤其是降钙素基因相关肽受体在大鼠成骨细胞上的发现，为降钙素基因相关肽具有直接调节骨生长的作用提供了更有力的证据。降钙素基因相关肽也被证明是一种与炎症反应相关的神经肽，有文献报道，骨折时它可以诱发损伤局部炎症细胞浸润。虽然已经认识到降钙素基因相关肽在骨修复及骨重建中的重要作用，但其具体作用机制仍不明了。     

卵巢切除股骨骨折大鼠骨愈合中降钙素的作用

背景：降钙素可活化腺苷酸环化酶蛋白激酶A通路及磷脂酶C通路,抑制破骨细胞的活性,可能治疗骨质疏松性骨折。 目的：观察降钙素对去卵巢大鼠股骨骨折愈合的作用。 方法：构建双侧卵巢切除骨质疏松右股骨骨折SD大鼠模型,然后分别皮下注射生理盐水和降钙素(16 IU/kg),隔日1次,于骨折后3周和6周测量右股骨行骨密度,苏木精-伊红及抗酒石酸酸性磷酸酶染色,骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子免疫组化染色。 结果与结论：骨折后给予降钙素治疗的大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶染色阳性细胞积分吸光度值较生理盐水治疗的大鼠显著减少(P < 0.05)。骨折后3周,两组骨折线均较清晰,骨痂体积无明显差别,骨折愈合以软骨内化骨过程为主,骨密度无显著性差异(P > 0.05)。骨折后6周,两组骨折线较模糊,骨痂体积无差别,骨小梁排列较有序,用药组股骨骨密度较对照组升高(P < 0.05)。两组在骨折后3周和6周的骨形态发生蛋白2及血管内皮生长因子差异无显著性意义(P > 0.05)。证实降钙素可以抑制去卵巢大鼠骨折部位破骨细胞活性,但无明显促进大鼠股骨骨折愈合的作用。     

应激对大鼠空间学习记忆的影响及与蛋白激酶活力的关系

目的探讨不同时段的应激对大鼠海马依赖性空间学习记忆的影响及与海马蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）和钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）活力的关系。方法将60只雄性SD大鼠随机分为对照组、应激1次组、应激1周组、应激2周组和应激4周组，每组动物12只，其中应激模型为强迫大鼠游泳。应用Morris水迷宫（MWM）测试大鼠的空间学习记忆情况，采用同位素法检测蛋白激酶的活力。结果（1）MWM实验，应激1周组在第7和第8个实验中逃避潜伏期（EL）分别为（9．8±2．8）s和（9．8±4．6）s，少于其他4组（P〈0．01）；其他10个实验各组的EL相互比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；记忆保留实验中，应激4周组的EL长于对照组（P〈0．05）；应激1周组大鼠60s内穿越原平台位置的次数[（3．24-1．2）次]多于对照组[（1．8±0．5）次；P〈0．05]。（2）应激1周组大鼠PKA和PKC活力[分别为（6．42±0．27）×10^-2和（4．71±0．37）×10^-2]高于对照组[分别为（5．53±0．49）×10^-2和（1．48±0．27）×10^-2；P〈0．01]；应激2周组和应激4周组PKA[分别为（4．88±0．23）×10^-2和（3．92±0．22）×10^-2]和PKC[分别为（0．57±0．03）×10^-2和（0．69±0．02）×10^-2]活力则低于对照组（P〈0．01）。各应激组海马CaMKⅡ的活力均明显低于对照组（P〈0．01）。结论慢性应激损害大鼠海马依赖性空间长时记忆，抑制大鼠海马PKA、PKC和CaMKⅡ的活力；短时间的重复应激选择性提高大鼠海马依赖性空间短时记忆，提高PKA和PKC活力。应激导致记忆改变可能与蛋白激酶活力变化有关。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

成骨细胞复合材料修复颅骨缺损的实验研究

目的 应用纳米级羟基磷灰石复合成骨细胞修复兔颅骨缺损,观察新型颅骨修复材料的修复效果,探索临床应用骨组织工程学修复颅骨缺损的可能性.方法 体外原代培养兔颅骨成骨细胞,并将其与纳米级羟基磷灰石联合培养.应用联合培养后的复合材料修补颅骨缺损模型,应用大体观察、病理切片及扫描电镜观察修复效果.结果 体外培养并鉴定的兔颅骨骨膜成骨细胞可形成钙化结节,ALP染色呈强阳性,具备良好的成骨能力,在新型颅骨修复材料表面生长良好,6周后扫描电镜下观察显示产生大量新生骨组织,达到较满意修复效果.结论 新型纳米级羟基磷灰石作为细胞外基质,复合成骨细胞对颅骨缺损进行组织工程学修复是可行的.     

健骨颗粒含药血清对肿瘤坏死因子α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响

背景：成骨细胞数量减少或凋亡进程加速,使骨形成少于骨吸收可导致骨质疏松的发生。肿瘤坏死因子α在去势大鼠或绝经后骨质疏松患者骨组织中呈高表达,在体外可刺激成骨细胞凋亡。健骨颗粒可降低骨质疏松模型鼠血清肿瘤坏死因子α水平。 目的：验证健骨颗粒含药血清对肿瘤坏死因子α诱导的鼠成骨细胞凋亡的影响。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2004-07/2006-12 在福建中医学院骨伤系分子生物学实验室完成。 材料：3月龄SD雌性大鼠40只用于制备含药血清,24 h SD乳鼠5只用于培养成骨细胞。健骨颗粒由煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参等药味组成,原药材由福建省药材公司提供,福建中医药研究院中试车间加工制备,每克颗粒含原生药2.9 g。 方法：用酶消化法培养成骨细胞。随机将40只SD大鼠分为高、中、低剂量含药血清组和生理盐水对照组,每组10只,分别将健骨颗粒按4,2,1 g/(kg•d)的药量灌服,对照组每天灌服2 mL生理盐水。连续给药7 d后腹主动脉取血得到健骨颗粒含药血清,将含药血清作用于成骨细胞48 h后,再用肿瘤坏死因子α诱导24 h。运用TUNEL技术、流式细胞术、免疫细胞化学结合图像分析方法,检测成骨细胞凋亡情况。 主要观察指标：①成骨细胞凋亡指数。②成骨细胞凋亡峰。③成骨细胞Bcl-2、Bax表达。 结果：用肿瘤坏死因子α诱导的各组成骨细胞均出现凋亡现象,其中中、高剂量含药血清组的细胞凋亡指数和凋亡率明显低于其他组,而Bcl-2/Bax灰度比值却较其他组高(P < 0.05),Bcl-2/Bax灰度比值与凋亡指数呈负相关(r =-0.757, P < 0.01)。 结论：健骨颗粒对肿瘤坏死因子α诱导的成骨细胞凋亡有一定的保护作用,可能通过提高Bcl-2的表达来实现。     

The effect of carbenoxolone on hippocampal formation theta rhythm in rats: In vitro and in vivo approaches

The role of gap junction (GJ) coupling in the generation of hippocampal formation theta rhythm was investigated in vitro, with use of brain slices, and in vivo, with use of urethane anesthetized rats. Carbenoxolone, the succinyl ester of glycyrrhetinic acid, and GJ blocker reversibly abolished hippocampal formation theta rhythm recorded in slice preparations and urethane anesthetized rats. The present study yielded novel data which demonstrated that the pattern of delay in blockage of theta rhythm after carbenoxolone treatment, and the pattern of theta recovery after administration of this agent, require a specific time period (2–3 h for delay and 8–12 h for recovery), one that can be demonstrated using different experimental protocols.     

人TN-R蛋白及其EGF-L片段抗血清对大鼠皮层神经元的影响

目的 制备Tenascin-R(TN-R)蛋白的EGF-L功能片段及该片段抗血清,联合TN-R蛋白研究其在体外对大鼠皮层神经元的作用,探讨该功能片段抗血清用于治疗中枢神经系统(CNS)损伤后轴突再生的可行性. 方法 制备人TN-R蛋白EGF-L片段抗血清,再以该抗血清联合TN-R蛋白包被多孔板形成不同的铺板状态,分EGF-L抗血清组、TN-R蛋白组、TN-R蛋白+EGF-L抗血清组,仅包被有多聚赖氨酸(PLL)处为对照组.单细胞悬液法原代培养大鼠皮层神经元24h后免疫荧光染色检测β-Ⅲ-tubulin,比较不同的铺板状态下所黏附的细胞数;7d后免疫荧光染色检测β-Ⅲ-tubulin,观察神经元的形态并比较神经元突起主干、分支点数量及突起总长度.小组织块法培养大鼠皮层神经元7d后观察包被的蛋白与PLL之间形成的边界对神经元突起生长的影响. 结果 成功制备高浓度的TN-R蛋白EGF-L片段抗血清.4组所黏附的细胞密度不同,比较差异有统计学意义(P＜0.05).与EGF-L抗血清组和对照组比较,TN-R蛋白组所黏附的细胞密度、神经元的突起主干、分支点数量及突起总长度较低,TN-R蛋白+EGF-L抗血清组上述指标均较高,差异有统计学意义(P＜0.05); TN-R蛋白组从组织块中迁徙出的细胞及细胞突起均几乎不能越过边界,TN-R蛋白+ EGF-L抗血清组可见有少量的细胞突起越过边界生长. 结论 TN-R蛋白EGF-L片段抗血清在体外能削弱TN-R蛋白对于神经元生长的抑制功能,有望将该抗血清用于体内,为CNS损伤后轴突再生创造有利的内环境.     

利培酮治疗儿童精神分裂症36例的疗效观察

目的 研究应用利培酮治疗儿童精神分裂症的疗效和安全性。方法 对36例9～15岁经CCMD-3诊断为儿童精神分裂症的患者,应用利培酮治疗12周,平均起始剂量(0.86±0.05)mg/日,平均治疗剂量为(3.44±1.08)mg/日,采用简明精神病量表(BPRS)评定疗效,锥体外系症状量表(ESRS)和实验室检查评价不良反应。结果 利培酮对儿童精神分裂症各种症状均有较好疗效,显效率为83％,有效率94.4％,不良反应主要有轻度的睡眠增多和锥体外系反应,其他不良反应少见。结论 利培酮对儿童精神分裂症疗效较好,不良反应少,依从性较好,值得推广使用。     

糖皮质激素作用下大鼠股骨远端松质骨超微结构改变：扫描电镜观察结果

背景：骨质疏松症中骨微结构的破坏是导致骨强度下降、骨脆性增加以及骨折发生率增加的重要原因。 目的：通过扫描电镜观察糖皮质激素作用下大鼠股骨远端松质骨超微结构的改变。 方法：3.5月龄SPF级雌性SD大鼠32只,随机分为2组,糖皮质激素组皮下注射甲泼尼龙3.5 mg/(kg•d)诱导糖皮质激素性骨质疏松,对照组皮下注射等量生理盐水。分别于干预4,9周后取大鼠股骨远端沿冠状面切开,蒸馏水冲洗骨髓腔,乙醇梯度脱水,表面喷金后利用扫描电镜观察大鼠股骨远端松质骨超微结构的改变。 结果与结论：与对照组相比,糖皮质激素组大鼠骨小梁数目减少,且骨小梁变细、变脆、连接中断,立体网状结构破坏,同时骨吸收面积增加,骨胶原排列紊乱,骨微损伤增加,且糖皮质激素干预4周组较干预9周组能更好地保持骨微结构。提示糖皮质激素可导致大鼠松质骨的骨量减少、骨三维网状结构破坏、骨吸收活动增强,从而导致骨脆性增加,骨生物力学性能下降。     

An in vitro temporomandibular joint-nerve preparation for pain study in rats

A novel in vitro TMJ-nerve preparation was developed to quantitatively study peripheral sensory mechanisms of temporomandibular joint (TMJ). The TMJ region on one side (including mandibular head, disc, retrodiscal tissue and mandibular fossa) of adult Wistar albino rats was excised together with the auriculo-temporal nerve. The block was preserved in a modified Krebs-Henseleit solution saturated with O(2)/CO(2) (95/5%) gas mixture. Using a calibrated von Frey type apparatus, mechanical noxious stimulation was applied directly to various sites within the TMJ region. In addition, thermal and chemical noxious stimuli were also attempted. Stable recordings of single unit activities from the auriculo-temporal nerve could be obtained for as long as 5 h, which was sufficient to analyze the response properties of the TMJ units to various stimuli. This new preparation would be useful for investigating TMJ peripheral sensory mechanisms, especially pain, and potentially makes it possible to reveal neural mechanisms of temporomandibular arthralgia, a syndrome that has recently shown an increased incidence in clinical dentistry.     

Repetitive transcranial magnetic stimulation in rats: evidence for a neuroprotective effect in vitro and in vivo

In recent years, repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) of the human brain has been used as a therapeutic tool in a variety of psychiatric and neurological disorders. However, to understand the mechanisms underlying any potential therapeutic effects, and possible adverse effects, studies are necessary on how magnetic stimuli induced by rTMS interact with central nervous system (CNS) regulation. In the current study, we failed to find cognitive impairments or structural alterations in rat brains after 11 weeks of long-term treatment with rTMS, which if present would indicate neuronal damage. In contrast, our in vitro studies showed that magnetic stimulation analogous to rTMS increased the overall viability of mouse monoclonal hippocampal HT22 cells and had a neuroprotective effect against oxidative stressors, e.g. amyloid beta (Abeta) and glutamate. The treatment increased the release of secreted amyloid precursor protein (sAPP) into the supernatant of HT22 cells and into cerebrospinal fluid from rats. HT22 cells preincubated with cerebrospinal fluid from rTMS-treated rats were found to be protected against Abeta. These findings suggest that neurochemical effects induced by rTMS do not lead to reduced neuronal viability, and may even reduce the detrimental effects of oxidative stress in neurons.     

钛合金表面纳米结构对钙磷矿化物体外沉积及成骨细胞矿化功能的影响

背景：通过改变金属材料置入假体表面物理性质,可以增强细胞的成骨性能,表面纳米化处理是当前研究的一个重要方向。目的：通过测定纳米钛合金和未处理微米钛合金表面钙磷沉积量及成骨细胞在两种材料表面的钙化功能,评估材料表面纳米结构对钛合金生物相容性的影响。方法：采用表面机械研磨处理(SMAT)制备了表面纳米结构的Ti6Al4V钛合金,将钛合金表面的微米级晶粒转变为纳米尺寸的晶粒。实验分为微米合金和纳米合金组,将试样浸入模拟体液中浸泡21 d。分离新生乳鼠颅盖骨成骨细胞进行培养,将其分别接种到纳米表面和微米表面钛合金上进行共培养14 d。观察两组合金表面粗糙度、润湿角、材料表面钙磷沉积量、成骨细胞钙结节形成的情况。结果与结论：①基于SMAT技术的表面纳米钛合金表面得到粗糙表面,其组成的晶粒则为纳米量级,表面粗糙度(Ra)由 132.5 nm增加到4019.3 nm;接触角由57.26°减小到22.4°;表面能由39.4 mJ/m2增加到67.3 mJ/m2。②在无成骨细胞的模拟体液中沉积7,14,21 d之后,纳米Ti6Al4V合金表面的钙磷元素沉积量显著增加。③纳米钛合金表面形成的钙结节面积显著大于微米钛合金表面,培养14 d后前者约为后者的3倍。结果提示,表面纳米钛合金能明显促进成骨细胞的矿化,并增加表面钙磷的沉积,具有较好的生物相容性。关键词：纳米结构;Ti6Al4V;成骨细胞;矿化;钙磷沉积;纳米生物材料doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.12.016