表达脑啡肽基因的单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的构建、包装和扩增

目的对单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒装载脑啡肽基因,并进行包装和扩增后,评价其在疼痛的转基因治疗上的作用.方法将pCMVHPPE质粒中的人前脑啡肽原基因插入单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒pHSVIRESlacZ,再用单纯疱疹病毒温敏株辅助在BHK-21细胞中包装、扩增,通过检测lacZ的表达反映扩增子病毒滴度.结果酶切鉴定证实重组子构建成功,重组扩增子质粒的包装、扩增由BHK-2l细胞的形态变化和X-gal原位检测载体lacZ的表达证实,扩增子假型病毒滴度达1×106TU/ml.结论本研究构建、包装、扩增的携带外源脑啡肽基因的假型病毒有较高感染性,这种扩增子病毒可作为疼痛基因治疗的实验研究的有力工具.     

应用cDNA RDA联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的方法学分析

目的探讨采用cDNA代表性差异分析法（representational difference analysis，RDA）联合cDNA阵列点杂交筛查差异表达基因的可行性及局限性。方法将17β雌二醇（E2）干预MG-63细胞cDNA分别制备成检测和驱赶扩增子进行消减杂交作为整个cDNA RDA的内部质控，以干预组扩增子、对照组扩增子和第4轮双向消减产物为模板，行内对照基因GAPDH的RT-PCR进行消减效率分析，Southem杂交证实消减产物来源，快速Northern杂交证实消减产物确实呈差异表达；克隆到pGEM-Teasy载体，转化JM109感受态细菌并铺Amp^＋／X-gal／IPTG琼脂皿得到差异表达文库，随机挑取白色单菌落培养后点成尼龙阵列膜，分别与干预组和对照组扩增子及第4轮消减产物杂交，得到差异表达克隆用于后续研究。结果内部质控结果显示，第3轮消减杂交后，PCR未见差异性产物扩增；cDNA RDA共得到3个雌二醇诱导表达上调条带和2个表达下调条带。Southern杂交结果显示在检测扩增子及第1～4轮差异产物中均可见阳性杂交信号，而驱赶扩增子中无杂交信号；快速Northern杂交证实干预组细胞总RNA的两处杂交信号均较对照组强；阵列膜同一克隆两个点对应的杂交信号呈高度相关一致性，共得到120个差异表达克隆（56个表达上调，64个表达下调）。结论cDNA代表性差异分析法联合cDNA阵列点杂交方法能有效快速高通量筛查E2诱导MG-63差异表达基因。     

腺病毒介导胸苷激酶基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生抑制作用的研究

目的探讨以腺病毒为载体介导胸苷激酶（tk）基因对静脉平滑肌细胞增殖及内膜增生的抑制作用。方法腺病毒载体携tk及β-半乳糖苷酶（lacZ）基因转染人的大隐静脉平滑肌细胞及大隐静脉片，以不同浓度的更昔洛韦（GCV）培养。通过X-gal染色观察标记基因lacZ的表达效率。将转染tk基因阳性与tk基因阴性的平滑肌细胞以不同的比例混合培养观察旁观者效应。将转染tk基因的静脉片在含有GCV的培养液中培养14d，取标本进行HE、VG染色，辅以计算机图像分析，观察内膜增生情况。结果腺病毒载体能有效地转染培养的平滑肌细胞和静脉片中的平滑肌细胞，外源基因表达持续14d。平滑肌细胞增殖受抑制程度与GCV的浓度和tk表达的水平呈正相关。转染lacZ的平滑肌细胞则不被GCV抑制。混合细胞培养（tk阳性及tk阴性细胞混合），当10％的细胞表达tk基因时，细胞生存率下降了55％。在静脉片培养实验中，tk／GcV组与对照组（lacZ／GcV和tk／GCV^-）比较，前者内膜增生60％受到抑制。结论tk基因合并GCV治疗具有抑制平滑肌细胞增殖和移植静脉内膜增生的作用，tk基因治疗具有旁观者效应。     

大鼠鞘内注射含人前脑啡肽原基因单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子载体的镇痛效应

目的大鼠鞘内注射含人前脑啡肽原基因（HPPE）单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-Ⅰ）扩增子载体的镇痛效应。方法60只纯种雄性SD大鼠，采用改良Yaksh法进行鞘内置管后，随机分为生理盐水组（NS组，n=18）、空白载体pHSVIRES-LacZ组（SHZ组，n=18）、重组HSV-Ⅰ扩增子载体pHSVIRES-HPPE-LacZ组（SHPZ组，n=24），大鼠鞘内分别注射生理盐水、SHZ、SHPZ，1周后分别从NS组、SHZ组和SHPZ组中取11只、11只、16只大鼠，取脊髓组织，用X-gal染色原位法测定LacZ的表达，用RT-PCR方法测定HPPE mRNA的表达，用放免法测定L-脑啡肽（L-EK）含量，并测定注射SHPZ后3d、1周、2周、3周、4周、5周时热痛阈（用后爪缩腿潜伏期表示）。结果在体转染大鼠中枢神经细胞，外源脑啡肽基因能有效表达。与基础值比较，SHPZ组注射SHPZ后1～4周时热痛阈升高，于注射SHPZ后3周时达到高峰（P〈0．05）；与NS组及SHZ组比较，SHPZ组于注射SHPZ后1～4周时热痛阈升高（P〈0．05），注射SHPZ后1周时脊髓组织L-EK含量升高。结论大鼠鞘内注射SHPZ有明显的镇痛效应。     

不同转染方法对逆转录病毒转染效率影响的研究

目的探讨不同加样方法对逆转录病毒转染软骨细胞效率的影响。方法将构建并包装好的逆转录病毒重组基因PLNCX2-IL-1Ra—GFP分别采用以下加样转染方法进行转染并作对照研究，a）第1组：先加病毒上清，6h后补充培养液．b）第2组：先加病毒上清，隔夜补充培养液；c）第3组：先加病毒上清，6h后更换成培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6h后更换成培养液；d）第4组：先加病毒上清，6h后补充培养液，隔夜培养后弃液，重复先加病毒上清，6h后补充培养液；e）第5组：经典转染法，同时加病毒上清液和培养液。转染2d后免疫荧光显微镜下观察荧光显色，4周稳定转染后分别检测各组细胞培养液中NO含量，并用ELISA法检测上清液中hIL-1Ra的表达情况。结果酶切鉴定重组基因正确；免疫荧光显微镜观察可见绿色荧光显色；1～5组NO含量以第4组为最高，第5组为最低；ELISA检测1～5组培养液中hIL-1Ra的含量以第4组为最高，第5组为最低。结论四种不同加样转染方法的转染效率均高于经典法，其中以第4组为最好。     

心脏移植中经冠脉系统转基因的实验研究

目的 研究将外源基因转入移植心脏，进行基因治疗的可行性。方法 建立小鼠异位心脏移植模型，建立经冠脉循环系统灌注技术。将12只BAIB／c近交系小鼠随机分为转基因组和空白对照组，每组各6只(供、受者各3只)。转基因组经冠脉循环系统将携带报告基因-半乳糖苷酶基因(Lac-Z)的质粒载体(PSV-β-gal)／脂质体(DOSPER)混合物灌注入供心，而后进行异位心脏移植；对照组则灌注生理盐水。术后3d获取供心，作冰冻切片，经X-gal组织化学染色检测Lac-Z基因的转染和表达情况。结果 转基因组的3例供心都检测到Lac-Z基因的表达；其中有2例Lac-Z基因表达位于心室壁中层的心肌内，1例其表达位于心内膜下的心肌内。而在对照组则没有检测到Lac-Z基因。结论 以冠脉循环系统灌注的方式将质粒载体／脂质体的混合物灌注入供心，使外源基因转入供心并表达是可行的。     

p53病毒增强型质粒-脂质体复合物在自体移植静脉中的表达

目的 研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的外源性p53基因在自体移植静脉中的表达,以寻找预防移植血管再狭窄的方法。方法 应用亚克隆技术,构建了人全长野生型p53基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体,通过阳离子脂质体DOSPER介导,转染体外培养的血管平滑肌细胞及自体移植静脉,用逆转录聚合酶链反应技术分析外源基因mRNA的表达,免疫组织化学方法检测基因表达产物。结果 外源性p53基因在培养血管平滑肌细胞和自体移植静脉中表达出相应的mRNA和蛋白质。结论 病毒增强型质粒－脂质体复合物可将外源性p53基因成功导入自体移植静脉并有效表达,p53病毒增强型质粒－脂质体昨合物可作为移植静脉病基因治疗的载体系统。     

BMP-4基因在成纤维细胞内的表达

目的：构建ｍＢＭＲ－４真核表达载体并转染成纤维细胞，观测外源基因在靶细胞内的表达及对细胞表现型的影响。方法：利用基因重组技术构建ｍＢＭＰ－４基因真核表达载体ｐＣＲ３．１ｕｎｉ－ｍＢＭＰ－４；利用基因转染技术体外转染ｍＢＭＰ－４基因至成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３，转染的细胞用Ｇ４１８筛选，利用斑点杂交和免疫组化检测转染４周后外源基因表达的情况。结果：琼脂糖电泳证明ｍＢＭＰ－４真核表达载体ｐＣＲ３．１ｕｎｉ     

p53病毒增强型质粒在血管平滑肌细胞中的表达

目的研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的P~（53）基因在血管平滑肌细胞中的表达。方法构建带有野生型P~（53）基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体，通过阳离子脂质体介导，转染血管平滑肌细胞。PCR检测外源基因整合，RT－PCR分析外源基因mRNA的表达，免疫组织化学检测基因表达产物。结果P~（53）基因转染血管子滑叽细胞表达相应的mRNA和蛋白质。结论血管平滑肌细胞可作为心血管疾病基因治疗的靶细胞．所构建的P~（53）腺相关病毒增强型质粒可作为基因治疗的载体。     

强力霉素调控表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

目的构建受强力霉素（Dox）调控表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株（IAST）。方法采用脂质体介导法将重组质粒pRevTREhPPE和调节质粒pRevTet-On分别转染逆转录病毒包装细胞PT67；将含有RevTet—On和RevTRE／hPPE病毒上清感染IAST，得到稳定表达脑啡肽的IAST／Tet-On／hPPE细胞株，实时定量PCR检测Dox定量调控该细胞株前脑啡肽原（hPPE）基因的表达，免疫细胞化学及放射免疫分析法检测Dox定量调控该细胞株中脑啡肽的表达。结果IAST／Tet-On／hPPE细胞株中，hPPE基因的表达和脑啡肽的分泌受Dox调控，Dox浓度为100～5000nedml时，随着Dox浓度增高，hPPE基因的表达和脑啡肽的分泌增加，Dox浓度为5000ng／ml时达峰值。结论成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的IAST。     

转乙型肝炎病毒x基因肝癌细胞株的建立

目的 建立表达转乙型肝炎病毒Ｘ基因（ＨＢＸ）的人肝癌细胞株,为研究ＨＢＸ基因与肝癌生物学行为间的关系提供模型。方法 以聚合酶链反应（ＰＣＲ）法从３．２ｋｂ 型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因组中主增ＨＢＸ基因,亚克隆至逆转 功体,磷酸钙共沉淀法将其导入包装细胞系,以含病毒的培养上清感染人肝癌细胞系ＱＧＹ７７０１,新霉素（Ｇ４１８）筛选,ＰＣＲ与反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）鉴定。结果 ＰＣＲ法从ＨＢＶ基因     

人前脑啡肽原基因修饰人骨髓间充质干细胞系的构建

目的 构建人前脑啡肽原(PENK)基因修饰的并可稳定分泌脑啡肽蛋白的人骨髓间充质干细胞系(hMSCs).方法 采用脂质体法将PENK基因逆转录病毒载体质粒(pBABE-PENK)转染至Phoenix-293T细胞,收集病毒上清液感染hMSCs细胞,经过嘌呤霉素筛选得到稳定表达PENK基因的hMSCs细胞株(hMSC-PENK细胞).以转染空载体细胞作为对照,即hMSC-pBABE细胞.采用RT-PCR法检测PENK mRNA的表达,免疫荧光法测定亮氨酸脑啡肽(LEK)的表达,ELISA法测定细胞培养上清液LEK浓度.结果 与hMSCs细胞和hMSC-pBABE细胞比较,hMSC-PENK细胞PENK mRNA和LEK表达上调,细胞培养上清液中LEK浓度升高(P＜0.05或0.01).结论 PENK基因修饰的hMSCs可表达PENK基因并分泌脑啡肽蛋白,成功构建了稳定分泌镇痛物质的细胞系.     

构建携带hTERT基因的慢病毒重组载体及其包装和表达

目的构建含hTERT基因的慢病毒重组载体,进行病毒包装并检测hTERT在293T细胞中的表达。方法PCR扩增hTERT．插入慢病毒载体,并与包装质粒转染293T细胞,进行病毒包装,并测定其滴度。Western—Blot检测慢病毒液感染293T细胞后hTERT的表达。结果成功构建了含hTERT的慢病毒重组载体,滴度为2．79×10^7Tu／mL,Western-B10t检测显示慢病毒液感染的293T细胞中hTERT基因高表达。结论含hTERT的慢病毒重组载体成功构建并包装后能够顺利感染293T细胞．并阳性表达目的基因。     

改良法构建Ⅱ型重组腺相关病毒介导人TIMP1基因及鉴定

目的改良法构建携带金属蛋白酶抑制剂1（TIMP1）基因的Ⅱ型重组腺相关病毒（rAAV2）。方法采用PCR法从pDNR-LIB质粒中扩增人全长TIMP1基因，利用基因重组的方法将TIMP1全长cDNA插入通用型AAV2载体质粒pSNAV的多克隆位点，构建成pSNAV-TIMP1；用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中，G418细胞筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK21／rAAV2-TIMP1；用具有rAAV2包装功能的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒（rHSV1-rc／△UL2）感染BHK-21／rAAV2-TIMP1，纯化后得到rAAV2-TIMP1。结果用改良法成功构建rAAV2-TIMP1，病毒滴度达到1×10^12v.g．／ml。结论成功构建rAAV2-TIMP1，为其进一步应用于基因治疗的研究提供实验基础。     

人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒在原代培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中的表达及其作用

目的:观察腺相关病毒载体介导的人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因在原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞的表达及其作用,探讨其应用于勃起功能障碍(ED)基因治疗的可行性。方法:原代培养的SD大鼠CCSM细胞随机分为4组:实验组、空病毒组、示踪剂组和对照组,分别以可分泌表达hCGRP重组腺相关病毒VssH-GCMV-hCGRP、空病毒VssHGCMV和表达绿色荧光蛋白(GFP)重组腺相关病毒VssCMV-GFP进行体外转染或不予任何处理。采用斑点印迹试验检测培养液中的hCGRP和放射免疫法检测转染细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)水平,观察hCGRP和示踪剂GFP的表达及其对CCSM细胞的影响。结果:重组腺相关病毒载体能有效地将外源基因hCGRP导入大鼠CCSM细胞并稳定表达,与空病毒组和对照组相比,该病毒明显刺激大鼠CCSM细胞中cAMP水平升高[(48.7±1.1)nmol/L对(12.3±1.2)nmol/L和(7.8±1.4)nmol/L,P均<0.01],培养液中可检测到免疫反应性hCGRP。结论:可分泌表达生物活性肽重组腺相关病毒基因转移系统可有效进行多肽类在CCSM细胞过表达,并影响该细胞的cAMP水平,可被应用于ED的基因治疗。     

ANG-1基因重组腺病毒载体的构建及其转染骨髓问充质干细胞的实验研究

目的构建携带大鼠血管生成素．1（angiopoietin-1,ANG．1）基因的重组腺病毒载体,并检测其转染对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stemcells,BMSCs）活力的影响。方法RT-PCR法获取大鼠ANG-1基因并亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,经测序无误后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183中同源重组。重组质粒pAdEasy-1-ANG-1经鉴定后转染293细胞进行病毒包装扩增。体外转染BMSCs,检测转染后BMSCs中ANG-1的表达。MTT法评估常氧及缺氧环境下ANG-1对BMSCs的影响。结果重组腺病毒载体pAdEasy-1-ANG-1经测序及酶切鉴定正确;BMSCs经转染ANG-1基因后表达ANG-1。MTT法检测提示常氧及缺氧条件下转染前后BMSCs活性的差异均无统计学意义（缺氧组与缺氧下转染组相比,P〉0-05;常氧组与常氧下转染组相比,P〉0-05）。结论成功构建大鼠ANG-1基因重组腺病毒载体,且其转染在体外不影响BMSCs的活性。     

携带Vasohibin基因的8型重组腺相关病毒的制备及在肌肉组织中的表达

目的克隆Vasohibin基因，包装制备成8型重组腺相关病毒，感染肌肉组织，并观察其在肌肉组织中的表达。方法以Vasohibin基因全长cDNA为模板，应用聚合酶链反应（PCR）方法扩增出Vasohibin基因，采用三质粒磷酸钙共转染HEK293细胞，包装制备成8型重组腺相关病毒，感染小鼠（6只）肌肉组织，免疫组织化学方法检测Vasohibin基因的表达，肌肉组织内染有棕色信号者为阳性。结果成功克隆Vasohibin基因，并制备成8型重组腺相关病毒，感染肌肉组织后实验组小鼠肌肉组织切片呈现广泛棕黄色阳性信号，阳性率为100％（6／6），对照组呈阴性（0／6），未见有阳性表达。结论8型重组腺相关病毒能够有效介导Vasohibin基因在小鼠肌肉组织中的表达。     

大鼠PnNOS基因修饰脂肪源性干细胞的构建

目的 构建过表达大鼠阴茎神经源性一氧化氮合酶（PnNOS）基因大鼠脂肪源性干细胞（ADSCs）,为基因修饰ADSCs移植治疗勃起功能障碍（ED）大鼠模型提供种子细胞.方法 获取大鼠PnNOS基因,并与线性化的腺病毒真核表达载体pDC315-EGFP定向克隆连接.构建正确的pDC315-PnNOS-EGFP穿梭质粒转染293 T细胞,采用Western Blot检测PnNOS基因在293 T细胞中的表达情况.利用AdMax腺病毒包装系统包装产生重组腺病毒,包装后扩增纯化并测定病毒滴度.PnNOS基因重组腺病毒转染大鼠ADSCs,观察GFP表达情况和Western Blot检测PnNOS基因表达情况.结果 经PCR鉴定、限制性酶切分析、测序鉴定和目的质粒Western Blot表达检测鉴定,证实pDC315-PnNOS-EGFP重组腺病毒载体构建成功.重组腺病毒包装成功且病毒滴度为5.0×109 PFU/ml.Western Blot于大鼠ADSCs中检测到约161 KDa大小条带,其与PnNOS蛋白分子量大小基本相一致.结论 大鼠PnNOS基因修饰的ADSCs构建成功,从而为基因修饰ADSCs移植治疗ED提供了良好的基因工程细胞.     

血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。