表达pCDR1 Th表位减毒鼠伤寒沙门菌株的构建

目的构建表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。方法全基因合成pCDR1两条核苷酸链,在C端加上6-His标签,退火互补后插入原核表达载体pYA3149中,构建重组质粒pR1,将该重组质粒转入鼠沙门菌终宿主菌株X4550,获得杂合菌株X4550（pR1）。体外诱导表达后斑点印迹鉴定表位肽的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。体外诱导后6h细菌裂解上清液中,检测到表位肽的表达,该蛋白能与鼠抗His单克隆抗体特异结合。重组菌株在体外营养选择压力下,可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。结论成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位的可口服减毒鼠伤寒沙门菌株。     

鼠精子表面蛋白cyritestin在沙门氏菌平衡致死系统中的高效表达

目的 松建表达鼠精子cyritestin蛋白的可口服减毒沙门氏菌活疫苗株。方法 将编码成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段插入含pUC复制子的表达载体pYA3339中,构建重组质粒pMCY,将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4550,获得杂合菌株X4550（pMCY）。应用 western blot对重组菌所表达的重组cyritestin蛋白进行免疫分析,结果 该无抗药性的杂合菌株在体外营养选择压力下可较稳定携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于Peyer‘s结、肠系膜淋巴结和脾脏。该重组菌可高水平表达重组cyritestin蛋白。结论 高效表达cyritestin蛋白的X4550（pMCY）疫苗株可用于免疫性避孕研究。     

表达鼠精子Cyritestin蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其鉴定

目的 构建表达鼠精子eyritestin蛋白的可口服减毒沙让氏菌活疫苗株。方法 应用质粒TAZ83／13，将之进行双酶切获得含有成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段。将其插入表达载体yA3149中，构建重组质粒pCFL。将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4632和X4550中，以获得重组菌株X4632（pCFL)和X4550（pCFL)。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下，可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。X4550(pCFL)在体内可较稳定地害居于Peyer‘s结，肠系膜淋巴结和脾脏；X4632（pCFL)可较稳定地定居于Peyer‘s结。二者均可表达被抗cyritestin单抗（mAb)识别的重组cyritestin蛋白。口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。结论 X4632（pCFL),X4550（pCFL)疫苗株的构建，为研究以cyritestin为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白在减毒鼠伤寒杆菌中的表达及 …

目的 采用作为疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统,构建能异源表达沙眼衣原体（Ｃｔ）主要外膜蛋白（ＭＯＭＰ）的重组菌株。方法 以Ｄ型Ｃｔ的ＤＮＡ为模板,用所设计的特异性引物扩增编码Ｃｔ ＭＯＭＰ高变区（ＶＤＩ～ＶＤＩＶ）基因,并将扩增产物定向克隆至质粒ｐＵＣ１９中。序列分析后,再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０互补的质粒ｐＹＡ３３４１中,以重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４５５０。结果 对构建的重     

重组流感病毒H1N1活菌疫苗的构建及其免疫效果的初步研究

目的获得两种流感病毒重组沙门氏菌X4550(asd-pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-NA)活菌疫苗,并对其免疫效果进行初步的研究。方法将本室已构建好的重组质粒pVAX1-HA及pVAX1-NA双酶切后得到HA、NA基因,将其克隆入asd-pVAX1构建重组的表达质粒。将重组质粒转染COS-7细胞,用免疫细胞化学方法鉴定重组质粒体外的表达。进一步将重组质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550,以2×109CFU/只的剂量三次口服免疫Balb/c小鼠。结果asd-pVAX1-HA和asd-pVAX1-NA均能在COS-7细胞中表达;免疫小鼠不仅可以检测到HA、NA特异性的血清IgG及IgA抗体;刺激黏膜免疫反应,产生sIgA抗体,而且能抵抗40LD50同型病毒滴鼻的攻击。结论H1N1流感病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌运送系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并且能够刺激机体产生保护性免疫应答。     

口服鼠疫F1-V重组融合基因DNA活菌疫苗的构建及免疫原性研究

目的 构建携带鼠疫耶尔森菌F1-V融合基因的重组减毒沙门菌苗,口服免疫Balb/c小鼠检测其免疫原性,为口服鼠疫活载体DNA疫苗研究打下基础.方法 将F1-V融合基因克隆到真核表达载体asd-pVAX1,进一步依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd-pVAX1/F1-V),提取重组质粒转染COS-7细胞并做免疫组化和Western-blot检测F1-V融合蛋白在细胞中的表达.以1×109CFU/只的剂量3次口服免疫Balb/c小鼠,ELISA方法检测血清中抗体水平.结果 构建的重组减毒沙门菌转染COS-7细胞后,免疫组化和Western-blot试验证明F1-V融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清有特异性抗体IgG产生.结论 构建的重组沙门菌能运送DNA疫苗到体内并成功释放质粒刺激机体产生特异性免疫应答,为口服鼠疫活载体DNA疫苗的黏膜免疫研究打下了基础.     

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的 构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础.方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd -pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd -pVAX1-BLS-L7/L12).以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价.结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生.通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主.结论 所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主.可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗.     

表达幽门螺杆菌hpaA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建和鉴定

目的：构建表达幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门低 疫苗菌。方法：用基因工程的方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261,提取重组疫苗菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆。用SDS－PAGE电泳和Western blot进行HpaA表达和鉴定。结果：经PCR和酶切证实,构建了含hpaA的重组原核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。HpaA能在疫苗菌中以二聚体形式表达,HpaA量约占全菌体蛋白量的17％,Westem blot证实其有免疫原性。结论：构建了表达H.pylori hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏疫苗菌,为探索制备H.pylori口服活疫苗尊定了基础。     

Survivin-△Ex3蛋白HLA-A2．1限制性CTL表位的基因疫苗抗肿瘤效果初探

预测并合成survivin-△Ex3 HLA-A2．1限制性CTL表位的基因疫苗,探讨携带表位基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗对小鼠移植肝癌模型的保护作用。将表位基因序列连接,构建pVAX1-STEs-EGFP真核表达载体,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗。实验动物分为未免疫对照组、口服沙门氏菌组、pVAX1质粒转染的减毒鼠伤寒沙门氏菌组;口服pVAX1-Survivin-△3（T34A）！ EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组和口服pVAX1-STEs ！ EGFP质粒转染的的减毒鼠伤寒沙门氏菌组。结果表明：在5组肿瘤模型小鼠中,肿瘤瘤块平均直径分别为：15．11±2．43 mm、13．70±2．97 mm、13．05±1．77 mm、7．46±2．61 mm、9．05±2．18 mm;表位疫苗组与其他组相比,有显著性差异（P＜0．01）。说明小鼠口服携带survivin-△Ex3 HLA-A2．1限制性CTL表位的基因疫苗后,能抑制小鼠肝癌细胞的增殖和扩散。     

表达幽门螺杆菌NAP基因的减毒沙门菌疫苗株的建立

目的：建立表达幽门螺杆菌(H．pylori)中性粒细胞活化蛋白(Hp—NAP)的减毒沙门菌疫苗株。方法：用PCR扩增Hp—NAP基因，并克隆至原核表达质粒pTrc99A中，经PCR及酶切鉴定后测定其基因序列，并与GenBank中相关序列的同源性进行比较。以重组质粒pTrc99A—NAP转化减毒伤寒沙门菌SL3261，培养后筛选阳性菌落，抽提质粒进行PCR及酶切鉴定。表达的Hp—NAP蛋白用SDS—PAGE进行鉴定，用薄层扫描分析蛋白含量。结果：核苷酸序列测定及同源性分析证实，克隆的Hp—NAP基因与GenBank中相关序列的同源性为98％(397／402)，氨基酸序列的同源性为98％(131／133)。以重组质粒pTrc99A—NAP转化的减毒沙门菌，可表达Mr约15000的Hp—NAP蛋白，表达量约占菌体蛋白量的37．5％。结论：建立了可表达Hp—NAP基因的减毒鼠伤寒沙门疫苗株，为进一步研制Hp口眼疫苗奠定了基础。     

表达肠出血性大肠杆菌 O157:H7 EspA 抗原的减毒沙门氏菌株的构建

目的 利用平衡致死系统构建表达O157:H7 EspA 的减毒鼠伤寒沙门氏菌.方法 构建表达EspA的重组质粒,再将其转入终宿主菌减毒鼠伤寒沙门氏菌x4550 株中构建成口服活疫苗株,用IPTG进行诱导表达,经聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westen-blot检测EspA蛋白的表达情况.并观察重组菌体外培养的稳定性.结果 利用宿主-载体平衡致死系统构建了表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌,经Tricine-SDS-PAGE电泳出现了1条Mr约21 000的蛋白条带,Westen-blot检测能与抗EspA的单克隆抗体发生特异性反应.且在没有选择压力的条件下体外能稳定地繁殖、生长和传代.结论 表达O157:H7 EspA的重组减毒沙门氏菌构建成功,为发展口服抗EHEC O157:H7的疫苗奠定了初步基础.     

堆型艾美耳球虫cSZ1基因在减毒沙门氏菌的表达及免疫保护效果研究

用PCR方法扩增堆型艾美耳球虫广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的阅读框架 (ORF) ,与质粒表达载体pYA3342连接后转化大肠杆菌E-coliX6 2 12 ,获得阳性重组质粒后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)X4 5 5 0。经IPTG诱导获得了cSZ1基因在减毒S typhimurium的高效表达 ,表达产物占菌体总蛋白的 9 2 % ,重组蛋白分子量约为 19kDa。将重组减毒S typhimurium分别以 10 8或 10 9CFU 鸡经口免疫 4日龄岭南黄肉鸡 ,免疫后两周血清中可检测到抗cSZ1的特异性IgG ,3周时抗体水平达到峰值 ;2 5日龄时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫后 3周 ,试验鸡分别经口攻击感染 5 0 0个E acervulina孢子化卵囊 ,结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线 ;计数攻虫感染后第 3 5～ 9 5天卵囊总产量 ,2个免疫组分别能降低 2 5 . 1%和 4 6 . 4 %的卵囊产生。     

重组沙门菌表达结核分枝杆菌ESAT-6及其特异性免疫应答分析

目的 分析重组沙门菌表达的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌性蛋白ESAT-6诱导的特异性免疫应答.方法 将ESAT-6蛋白编码基因导入原核表达载体pYA3333中,构建重组质粒pYA33-esat.通过电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550,获得重组菌X4550(33-esat).以每只105CFU剂量的重组菌滴鼻免疫C57BL/6小鼠,间隔18 d,在第2次免疫后10 d取免疫小鼠脾脏、肺脏、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)及派伊尔淋巴集结(Peyer's patch,PP)细胞,以ESAT-6多肽作为刺激原,检测特异性的IFN-γ分泌细胞和IL-4分泌细胞.同时,运用CFSE方法榆测了体内抗原特异性CTL效应.结果 经沙门菌表达并运送的Mtb抗原ESAT-6能诱导特异性的免疫应答.在肺脏及PP细胞巾,检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,免疫应答以Th1型为主.而在脾脏和MLN中,免疫应答呈现Th1/Th2混合应答.此外,体内CTL试验表明,重组菌能够诱导抗原特异的CTL效应,且特异性杀伤率为69.9%.结论 以滴鼻方式接种重组沙门菌,不仅能够诱导ESAT-6蛋白特异性的细胞免疫应答,还能激发特异的CTL效应,为结核病的防控提供了新的认识.