刺五加的体细胞胚胎发生研究

目的用不同质量浓度2,4-D和外植体类型对刺五加体细胞胚胎诱导进行研究,为刺五加的资源保护和遗传工程提供理论依据。方法以刺五加的萌发3周幼苗和层积处理种子合子胚的胚根、下胚轴和子叶为外植体,考察不同激素对刺五加体细胞胚胎发生的影响。结果来自层积处理种子合子胚的外植体接种于附加0.5 mg/L2,4-D的MS或1/2MS培养基中体细胞胚胎诱导率(57.1%)和数量(3.3)最高。体胚在原培养基中即可发育成熟,转入降低2,4-D质量浓度的培养基后更有利于新体胚的产生和原有体胚的成熟。刺五加体胚的发育历程与合子胚相似。结论刺五加可以通过来自合子胚的外植体实现体细胞胚胎发生,体胚诱导率取决于2,4-D质量浓度和外植体的发育程度。     

刺五加叶柄的体细胞胚胎发生研究

目的 以来源广泛、原植物药用成分量可测定的刺五加叶柄为外植体，研究刺五加体细胞胚胎发生情况，为实现药用成分高产刺五加的快速繁殖奠定基础。方法 以 3 年生植株萌发 15 d 以内的刺五加复叶叶柄为外植体，考察 2，4- D 和 BA 对刺五加体细胞胚胎发生的影响。结果 28 d 培养后，2, 4-D 1.5 mg/L+BA 1.0 mg/L 处理的叶柄外植体中 71.4% 直接产生或经由愈伤组织间接产生了 8.5 个体胚。两种产生方式均可在诱导培养基中进行，但间接发生比例较少。转入相同或降低 2，4-D 质量浓度的培养基后，体胚渐次发育成熟。同时新的体胚也在逐渐产生，经由间接途径产生的体胚所占比例也随之上升。结论 刺五加可以通过萌发 15 d 以内的复叶叶柄外植体实现体细胞胚胎发生，体胚诱导率取决于 2，4-D 和 BA 的质量浓度。     

发根农杆菌Ri T—DNA对墨旱莲的遗传转化

目的 建立墨旱莲Eclipta prostrata的毛状根离体培养系统。方法 分别用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株感染墨旱莲的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系,测定了毛状根的生长细线;利用高压纸电泳法对毛状根进行-DNA转化的检测。结果 首次利用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株成功地从墨旱莲中诱志出毛状根;经高压纸电泳检测,墨旱莲毛状根中含有甘露碱,表明Ri质粒的T-DNA已整合进毛状根中。结论 墨旱莲毛状根离体培养的建立为进一步进行药物活性成分的工业化生产奠定了基础。     

药用植物商陆毛状根培养系统的建立

目的:建立药用植物商陆(Phytolacca acinosa Roxb.)的毛状根离体培养系统.方法:分别用发根农杆菌A4、R1600、C58C1 3个菌株感染商陆的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系;考察了影响毛状根生长的因素;测定了毛状根的生长曲线;利用PCR和高压纸电泳法对毛状根进行tDNA转化的检测.结果:利用发根农杆菌A4、R1600、C58C1 3种菌株成功地从商陆中诱导出毛状根;以水解酪蛋白为氮源、以麦芽糖为碳源最有利于商陆毛状根的生长;毛状根的生长曲线呈"S"形,24 d时质量达到最大(增长18倍);PCR及高压纸电泳检测结果表明Ri质粒的tDNA已整合进毛状根中.结论:成功建立了商陆毛状根离体培养系统,为进一步进行药用成分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基础.     

应用发根农杆菌Ri T-DNA建立菘蓝的毛状根优质株系和植株再生系统

目的：建立菘蓝（Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ）的毛状根离体培养系统,并诱导毛状根再生植株。方法：分别用发根农杆菌Ａ４,Ｒ１６０１和ＡＴＣＣ１５８３４三种菌株感染菘蓝的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系;测定了毛状根的生长曲线;在含不同激素的培养基上诱导毛状根再生植株;利用高压纸电泳法对毛状根和再生植株进行Ｔ－ＤＮＡ转化的检测。结果：首次利用发根农杆菌Ａ４,Ｒ１６０１和ＡＴＣＣ１５８３４三种菌株成功地从菘蓝中诱导出毛状根;菘蓝毛状根在含ＢＡ的ＭＳ培养基中成功地诱导出再生植株;经高压纸民泳检测,菘蓝毛状根及其再生植株中均含有甘露三,表明Ｒｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ已整合进毛状根和再生植株中。结论：菘蓝毛状根离本培养和植株再生系统的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基     

鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化

【目的】建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法。【方法】以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的MS培养基上,进行愈伤组织诱导和分化再生以根癌农杆菌EHA105／pcAMBIA1305．2进行转化,将外源GUS（β-葡萄糖醛糖苷酶）基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草,以组织化学染色法检测GUS活性,以聚合酶链反应（PCR）法鉴定基因组中的GUS基因。【结果】MS培养基中添加0．1mg／L α-夺乙酸（NAA）、2．0mg／L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）、0．5mg/L呋喃氨基嘌呤（KT）适于以鱼腥草叶片为外植体进行离体再生,出芽率达96．7％。潮霉素作为筛选试剂,使用浓度为2．5mg／L;头孢霉素作为抑菌剂,使用浓度为250mg／L。经感染的外植体中GUS反应呈阳性的占75．0％,8周统计抗性芽比率5．5％,PCR分析表明GUS基因已整合到鱼腥草基因组中。【结论】通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化,获得了较高的离体再生率,实现了鱼腥草的遗传转化。     

发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究

目的 筛选诱导广藿香毛状根的最佳条件,建立广藿香毛状根诱导体系,并以此体系作为下一步研究的基础.方法 采用共培养法,用发根农杆菌ATCC15834和C58C1,经预培养、侵染、共培养和除菌操作诱导广藿香外植体产生毛状根.结果 预培养时间为2d,乙酰丁香酮质量浓度为15 mg/L,侵染时间为25 min,共培养时间为2d,发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导率均达到最高,分别为83.3％和80.5％;PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表达,说明广藿香毛状根已经被成功诱导.结论 成功诱导并建立了广藿香毛状根诱导体系.     

根癌农杆菌介导的烟曲霉转化条件的优化

目的探讨根癌农杆菌介导烟曲霉的遗传转化及其影响因素。方法构建根癌农杆菌二元载体PDHt／SK，二元载体转化根癌农杆菌，分别对共培养温度（23、24、25、26、27、28）℃、媒介（尼龙膜、硝化纤维膜、液相静王培养）、共培养时间（12、24、36、48h）、预培养加乙酰丁香酮与否、加入乙酰丁香酮的浓度（100μg／ml、200μg／ml、300μg／ml、400μg／m1）；分生孢子与根癌农杆菌的不同比例（1：1、1：10、1；100、1：1000）进行根癌农杆菌介导烟曲霉的转化，观察上述条件下的根癌农杆菌介导的烟曲霉转化效率，用潮霉素抗性基因筛选转化子。结果共培养温度、转化媒介、共培养时间、共培养加入乙酰丁香酮不同的浓度、分生孢子与根癌农杆菌的不同比例均对根癌农杆菌介导烟曲霉转化效率产生影响，但是预培养加乙酰丁香酮与否对根癌农杆菌转化烟曲霉的效率影响不明显。结论根癌农杆菌可成功介导烟曲霉的遗传转化，其转化过程受诸多因素的影响。     

农杆菌介导的GUS基因在枳壳中的转移

用枳壳Ｐｉｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ Ｒａｆ．实生苗的上胚轴为材料，探索以根膛杆菌介导的ＧＵＳ基因在枳壳中的转移，结果表明；换菌剂选择头孢霉素较好；卡那霉素作为选择试剂，浓度为５０ｍｇ／Ｌ，外植体与农杆菌共培养时间以２～３ｄ为宜。ＧＵＳ基因瞬时表达检测，８０％的外植体呈阳性反应；ＧＵＳ基因稳定表达检测，抗性植株中，ＧＵＳ反应呈阳性所占比例为７０．０％。     

粟米草毛状根的研究

目的：建立粟米草（Ｍｏｌｌｕｇｏ ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌａ Ｌ．）的毛状根培养系统并研究毛状根的生长特性。方法：分别用发根农杆菌Ｒ１６０１,ＡＴＣＣ １５８３４和Ａ４感染粟米草无菌苗的子叶,获得毛状根,并筛选优质株系;用高压纸电泳法对毛状根进行甘露碱检测;测定其生长曲线;比较不同基本培养液、不同ｐＨ 值对毛状根生长的影响。结果：高压纸电泳结果显示,所获毛状根中均含有甘露碱,表明毛状根中确已转入发根农杆菌的Ｔ－ＤＮＡ;１／２ ＭＳ０培养液ｐＨ ５．４～５．８最适合粟米草毛状根的生长。结论：快速生长的粟米草毛状根在药用活性成分的生产上将具有较大潜力。