RACE:一种研究新基因的有效方法

RACE（rapid amplificationofc DNA ends）技术是以PCR和RNA反转录为基础,通过部分已知基因序列（如EST）快速扩增cDNA的3′端或5′端未知序列区域,获得全长cDNA,研究新基因的一种有效方法。本文针对该项技术自身存在的优缺点,同时结合国内外的最新研究改进方案,对该技术作一概述。     

家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2C cDNA全长的克隆

目的克隆家族性急性髓系白血病相关新基因全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制。方法以构建的家族性急性髓系白血病抑制性？肖减性文库中1个有差异表达的新基因EST序列（zywb4）为基础,综合应用电子克隆和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆家族性急性髓系白血病相关新基因的全长cDNA。结果获得家族性急性髓系白血病差异表达新基因ELF2C的全长cDNA和432bp的开放阅读框（ORF）,Blast检索为一功能未知基因,被GenBank收录,注册号为DQ359746。结论成功获得一个家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2CcDNA全长,为进一步研究其功能提供了依据。     

高凝状态大鼠主动脉表达上调新基因HCR2的克隆及生物信息学分析

目的 获得高凝状态大鼠主动脉上调表达新基因HCR2的全长cDNA,并对该基因进行生物信息学分析。方法 从高凝大鼠主动脉中表达显著上调的序列标签（EST,GenBank登录号为BQ901227）出发,利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA end,RACE）和巢式PCR技术扩增其全长cDNA,利用NCBI的数据库对其进行生物信息学分析。结果 成功地获得了HCR2的全长cDNA,在GenBank中的登录号为AY234417。用RT-PCR证实HCR2是高凝大鼠表达上调基因。生物信息学分析显示,该基因cDNA序列全长为1275bp,定位于大鼠染色体4q11,编码由78个氨基酸组成、相对分子质量为8841．7、pI为8．59的蛋白质;无信号肽序列和跨膜序列,很可能是一种核蛋白;与已知蛋白无明显同源性。结论 HCR2的成功克隆为进一步研究其生物学功能及其在高血凝的发生、发展中的作用奠定了坚实基础。     

白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因的克隆与生物信息学分析

目的应用简并引物RT．PCR和RACE方法获取白纹伊蚊Rh类糖蛋白（Aedes albopictus rhesuslike glycoprotein,AaRh）基因的全长cDNA。方法根据冈比亚按蚊、埃及伊蚊等亲缘关系较近物种的Rh类糖蛋白同源性分析结果,在氨基酸高度保守区域184／343和219／337氨基酸位点设计2对简并引物,以白纹伊蚊雌蚊总RNA为模板,应用巢式RT—PCR扩增AaRh的基因片段。根据获得的AaRh基因部分序列,设计2对特异性引物AaRhGSP1、GSP2和AaRhGSP3、GSP4,应用5’RACE和3’RACE分别扩增AaRh基因的5’端和3’端cDNA片段,然后拼接出全长cDNA序列。通过在线生物信息学分析（NCBI和Expasy）,对目的基因序列进行生物信息学分析。结果应用2对简并引物进行巢式RT-PCR．获得379bpAaRh基因片段。应用5’RACE和3’RACE方法,分别获得AaRh基因5’端1008bp、3’端822bpcDNA序列,根据两个片段的首／尾共同序列拼接为1717bp的基因片段。该核苷酸序列经BLASTn分析显示,与埃及伊蚊Rh蛋白的一致性高达95％,鉴定其为白纹伊蚊Rh类糖蛋白基因。AaRh基因具有完整的开放阅读框,其ORF从第128位到1516位含1389bp,编码462个氨基酸。Expasy在线生物信息学程序分析显示,白纹伊蚊Rh类糖蛋白是一个整合膜蛋白,跨膜11次,58aa．446aa具有铵离子通道的结构功能域;理论等电点（pI）5．37,分子量49775．10Mr,laa-26aa可能为分泌信号肽序列;含有4个潜在的天冬酰胺糖基化位点和17个线性抗原决定簇,翻译后可能进行糖基化修饰,提示其为糖蛋白。结论成功获取AaRh基因的全长cDNA,生物信息学分析结果为AaRh蛋白的生物学特性和功能研究奠定了基础。     

蚊虫细胞色素P450基因系列研究

报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因（CYP450）系列研究结果,包括：①通过简并引物PCR分别从卷库蚊、白纹伊纹及中华按蚊中获得3个、2个、2个CPY4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT－PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得了白纹伊蚊CYP3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列。GenBank accession number分别为AF283836－AF283838（全长cDNA序列）和AF284782－AF2847830（非全长cDNA序列）,被国际P450命名委员会正式命名为CYP 6N3vl-v3（全长cDNA序列）和CYP 6N3v4、CYP6N4vl-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白蚊伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3076bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示：昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CPY6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示：蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标。     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

多疣壁虎降钙素基因相关肽基因的克隆及表达分析

目的克隆多疣壁虎降钙素基因相关肽（CGRP）基因的全长序列;研究CGRP在壁虎断尾损伤后脊髓再生过程中的表达变化。方法应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得壁虎CGRP的cDNA全长序列;制备壁虎断尾损伤模型,应用RT-PCR和原位杂交方法检测壁虎断尾后该基因在中枢神经系统的表达变化。结果 RACE方法获得CGRP cDNA全长序列1 002bp;RT-PCR检测结果表明,壁虎断尾损伤1d后断端近侧脊髓中mRNA表达呈明显上升趋势且转录水平最高（P〈0.05）;脊髓原位杂交结果显示,CGRP mRNA阳性信号主要分布于脊髓灰质中,白质中少量表达;断尾损伤后1 d阳性信号明显增强（P〈0.05）。结论该试验克隆得到了壁虎CGRP cDNA的全长序列;壁虎断尾损伤后1 d CGRP在断端近侧脊髓中的表达明显上调。神经系统合成分泌的CGRP可能参与调节免疫反应或伤口愈合。     

淡色库蚊抗药性相关基因--NYD-MLC2基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关基因NYD-MLC2的cDNA全长序列并鉴定其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因片段序列设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增NYD-MLC2基因3′、5′端,经对位拼接获得全长序列,并进行生物信息学分析;荧光定量PCR验证此基因在抗性和敏感品系的表达差异。结果:获得淡色库蚊NYD-MLC2cDNA全长序列,开放阅读框为630bp(GenBank/NCBIDQ140391),编码210个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-MLC2与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)一个未知功能的蛋白同源性最高,为91%;实时荧光定量PCR结果显示,NYD-MLC2在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的4.08倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-MLC2基因cDNA全长序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-MLC2与淡色库蚊溴氰菊酯抗药性相关,值得进一步研究。     

滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的 获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因（PpCAS）的全长cDNA序列,并进行序列分析。方法 利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3’及5’末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框（ORF）为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×10⁴,等电点（pI）为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60%～83% PpCAS蛋白。结论 从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。     

RACE技术扩增及克隆中华菊头蝙蝠ACE2基因

目的建立中华菊头蝠体内扩增血管紧张素转换酶2（ACE2）基因真核表达载体,研究SARS冠状病毒感染的跨种属传播机制。方法利用基因的种属保守性分别设计用于扩增5’未端和3’端cDNA的引物,从中华菊头蝠小肠组织中提取总RNA,在通过cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得cDNA5’端和3’端序列基础上,进一步PCR扩增ACE2开放阅读框并克隆到pcDNA3．1。结果成功获得了中华菊头蝠的ACE2基因全长序列,并构建了其真核表达载体pcDNA3．1／R—ACE2。结论利用RACE技术扩增并构建了中华菊头蝙蝠的ACE2的真核表达载体,为研究SARS冠状病毒感染与免疫及跨种属传播机制奠定了基础。     

家族性急性髓系白血病相关新基因FAMLF cDNA全长的克隆及其生物功能分析

目的 克隆家族性急性髓系白血病(AML)相关新基因cDNA全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制.方法 以构建的家族性AML抑制性消减文库中1个有差异表达的新基因EST序列zywb87(GenBank注册号CV973101)为基础,应用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆其全长cDNA,应用生物信息学对其功能进行初步分析,应用一步法半定量RT-PCR检测其在AML患者及正常人中的表达.结果 获得了家族性AML相关新基因FAMLF的cDNA全长,该基因定位于染色体lq31.3,cDNA全长2313 bp,开放读码框(ORF)为249 bp,编码82个氨基酸的蛋白质,含有信号肽,富含亮氨酸重复单位(LRR_SD22),内在固有无序结构域等功能区.Blast检索为功能未知的新基因,已被GenBank收录,并命名为FAMLF,核酸注册号为EF413001,蛋白质注册号为ABN58747.新基因FAMLF在AML患者中的表达明显高于正常人,差异有统计学意义(2.61±0.66 vs 0.97±0.51,P<0.01).结论 成功获得一个家族性AML相关新基因FAMLF cDNA全长,FAMLF基因在AML中高表达,可能是具有一定生物功能的新基因.     

淡色库蚊抗性相关基因--NYD-GBE基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因cDNA全长序列并验证其在抗性品系和敏感品系中的表达差异。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗性相关NYD-GBE基因片段设计引物,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)扩增糖原分支酶基因5′、3′端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行生物信息学分析。结果:获得淡色库蚊NYD-GBEcDNA全长序列,开放阅读框为2070bp(GeneBank/NCBIDQ102393),编码689个氨基酸。蛋白质序列分析显示,NYD-GBE与冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)和拟暗果蝇(Drosophilapseudoobscura)一个未知功能的蛋白同源性最高,为82%和72%,与人糖原分支酶的基因同源性次之为60%。荧光定量PCR结果显示,NYD-GBE在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中的表达量是敏感品系的19.7倍。结论:获得淡色库蚊抗药性相关NYD-GBE基因全长cDNA序列,并证实其在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系中高表达,提示NYD-GBE与淡色库蚊溴氰菊酯抗性相关,值得进一步研究。     

吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA克隆及序列分析

目的 克隆吴茱萸Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列。方法 根据已获得的吴茱萸Mn/Fe-SOD基因核心片段序列设计4条特异性引物,采用RACE和巢式PCR方法克隆获得吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA。结果 吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA序列共1 048 bp,包含一个687 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,共编码228个氨基酸。结论 首次从吴茱萸中克隆得到了Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列,为研究该基因在吴茱萸体内超量表达以提高植物抗逆性研究奠定基础。     

淡色库蚊抗药性相关新基因--视蛋白基因的克隆与分析

目的:获取淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因(NYD鄄OP)全长cDNA序列。方法:根据抑制性差减杂交(SSH)结合cDNA芯片分离获得的淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因的289bp片段,设计上、下游引物,分别以cDNA文库和反转录二链产物为模板,采用快速扩增cDNA末端法(rapidamplificationofcDNAend,RACE)扩增视蛋白基因5'、3'端,经对位拼接获得全长序列,并用相应的软件进行分析。结果:获得6个淡色库蚊视蛋白基因全长序列,开放阅读框分别为1116bp(GeneBank/NCBIAY297441,AY297442)及1119bp(GeneBank/NCBIAY297443,AY297444,AY299337,AY299338),以上序列经推导分别编码371及372个氨基酸。进行蛋白质序列分析,与烟草天蛾视蛋白的同源性是77%。结论:获得6个淡色库蚊抗药性相关视蛋白基因全长cDNA序列。     

兔大电导钙敏感性钾离子通道β亚基的克隆及生物信息学分析

目的:克隆新西兰白兔大电导钙敏感性钾离子通道(BKCa)β亚基基因,观察其组织分布,并对其进行生物信息学分析. 方法:采用3'及5'cDNA末端快速扩增(RACE)及RT-PCR技术从兔Oddi括约肌(SO)组织获得BKCa通道β亚基的全长cDNA序列. 并应用生物信息学方法分析该基因的同源性、蛋白结构域及跨膜拓扑结构. 结果:兔BKCa通道β亚基基因cDNA全长为1168 bp,开放读窗长度为576 bp,编码191个氨基酸. 生物信息学分析表明该基因核酸序列及氨基酸序列与人类及其它哺乳动物有很高的同源性;拓扑结构为两次跨膜蛋白,具有4个功能结构域,含有1个磷酸化位点及2个N-糖基化位点. 结论:首次成功地从兔SO组织克隆出BKCa通道β亚基基因,获得新GenBank号DQ821756,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇氧化还原酶全长cDNA的克隆与分析

目的：克隆兔肝辅酶Ⅱ依赖性视黄醇氧化还原酶（NRDR）的全长cDNA，并分析其特征。方法：根据GenBank中已发表的NRDR的cDNA部分序列信息，运用cDNA末端快速扩增技术得到全长cDNA，然后利用生物信息学的方法对其进行分析。结果：得到NRDR全长cDNA序列，并提交到GenBank。分析发现该cDNA具有短链脱氢酶（SDR）家族的保守模序，而且在5’端同一个读码框架内有2个起始密码子。结论：新克隆的NRDR全长序列在GenBank编号为DQ229110，NRDR蛋白属于SDR家族。     

建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析

目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶（squalene synthase,SS）进行基因全长的克隆和生物信息学分析。方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究。结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1 577 bp,包含一个长1 230 bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性。预测该蛋白的相对分子质量为4.68×10⁴,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸（DXXDD）的保守功能域。结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

日本血吸虫中国大陆株琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白的克隆与表达

目的：克隆日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（sjSDISP）全长编码基因,并对所获基因在大肠杆菌中进行表达。方法：根据基因库中SjSDISP对应的EST（BU804141）以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgtl1多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板,采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3′端和5′端进行扩增、测序,用电子软件拼接成全长cDNA,将其克隆到表达载体pGEX-4T-1上,经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶消化、PCR和测序鉴定后,选择阳性克隆进行表达及Western印迹分析。结果：获得1071bp全长cDNA,其理论推导为编码278个氨基酸残基的蛋白质。SjSDISP基因在大肠杆菌BL2．中获得良好表达。该融合表达产物相对分子质量约为56kD,且能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别。结论：编码日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白全长cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达获得成功。     

RACE法在连翘花蕾全长cDNA文库构建中的应用

目的建立新的连翘花蕾全长cDNA文库构建方法。方法应用GeneRacer^TM试剂盒,采用改良RNA连接酶介导的快速扩增cDNA末端（RNA ligase-mediated rapid amplication of cDNA ends,RLM—RACE）技术构建连翘花蕾全长的cDNA文库,通过计算菌落数、蓝白斑数、酶切鉴定、序列分析等手段评价文库质量。结果通过增加模板用量的方法成功构建了连翘花蕾全长cDNA文库,该文库容量为3．47&#215;10^5,重组率为81．6％,插入片段多集中在500—1000bp之间,所占比例为71％;随机测序的cDNA克隆中均含有完整开放阅读框的全长cDNA序列。结论应用RACE法成功构建了连翘花蕾全长cDNA文库。     

葡萄胎发病相关新基因的克隆

目的筛选和克隆与葡萄胎发病相关的新基因。方法采用抑制性消减杂交方法，建立葡萄胎组织与正常早孕绒毛组织间的差示cDNA文库，从中筛选出新基因序列，并克隆其全长。结果从差示cDNA文库中共筛选出28个克隆，测序结果提示含10种基因序列，其中3个基因片段被确认为功能未明的新基因，并获得其中一条基因的全长序列（按克隆序列号命名为F10）。结论F10等新基因可能与葡萄胎的病理发生发展密切相关。