FasL转染小鼠树突状细胞诱导异系T淋巴细胞凋亡的研究

目的:制备稳定表达FasL蛋白的小鼠骨髓源树突状细胞(DC)并探讨其体外诱导异系T淋巴细胞凋亡的机制。方法:采用培养基选择法体外培养小鼠骨髓源DC,脂质体法转染FasL基因至小鼠成熟DC,流式细胞仪检测转染前后FasL蛋白的表达。混合淋巴细胞培养,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC对异系T淋巴细胞增殖的影响,流式细胞仪检测诱导异系T淋巴细胞凋亡的能力。结果:体外培养可获得成熟的小鼠骨髓源DC,转染FasL基因的DC较未转染DCFasL蛋白表达明显升高,混合淋巴细胞培养结果显示,FasL转染后DC对异系T淋巴细胞刺激指数明显下降(P<0.01),且诱导T淋巴细胞凋亡的能力明显增加(P<0.01)。结论:培养基选择法可收获大量骨髓源DC,具有典型形态,高表达MHCⅡ和共刺激分子,所获骨髓源DC能激活初始型T细胞免疫应答。脂质体转染FasL基因至小鼠骨髓源DC,可以使DC高表达FasL蛋白。转染FasL的DC体外刺激异系T淋巴细胞增殖的能力下降,且能明显诱导T淋巴细胞凋亡。     

脂质体介导乙型肝炎病毒核心抗原基因转染人树突状细胞的效率

目的 观察脂质体介导HBcAg基因转染来源于人外周血单个核细胞(PBMC)树突状细胞(DC)的转染效率.方法 用HES离心沉淀法分离人外周血PBMC,经粒-巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养DC,培养第5天以阳离子脂质体为载体将报告基因GFP(DNA:脂质体比例为1:3、1:4、1:5、1:6)及HBcAg基因(DNA:脂质体1:5)导入DC,于72h经流式细胞仪检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达率,于48、72、96、120h流式细胞仪检测HBcAg的表达率.将基因转染后的DC 与自体淋巴细胞混合培养,检测其细胞内γ干扰素(IFN-γ)、IL-4表达水平.结果 倒置显微镜下观察脂质体转染后DC的的形态无明显变化.报告基因GFP与脂质体比例不同,其转染效率有差异,72h的表达率为37.12%(1:3)、48.55%(1:4)、52.13%(1:5)、50.75%(1:6).HBcAg基因转染DC后48、72、96、120h的HBcAg表达率分别为31.58%、55.80%、54.18%、56.99%.转染后DC与自体淋巴细胞混合培养后,淋巴细胞高表达IFN-γ,较少表达IL-4,呈现Th1为优势的免疫应答.结论 应用阳离子脂质体能有效的将HBcAg基因转染到人PBMC来源的DC,转染72h后抗原表达稳定;转染HBcAg基因的DC仍以诱导Th1免疫应答反应为主.     

树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞用于急性白血病治疗的研究

目的:探讨树突状细胞(DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)应用于急性白血病(AL)清除微小残留病(MRD)的方法、疗程、安全性和疗效.方法:34例共45例次AL患者均通过血细胞单采获得自体外周血单个核细胞,以细胞因子体外诱导获得DC和CIK,分别行皮下注射和静脉输注;治疗过程中观察不良反应及安全性;治疗前、后进行T细胞亚群、细胞因子水平、肿瘤坏死因子、微小残留病灶、血常规、骨髓涂片和融合基因等方面检测,评估疗效.结果:骨髓达到完全缓解的患者接受DC、CIK治疗,仅8例出现低热,可自行消褪,安全性良好;所有患者治疗结束后均处于血液学和遗传学缓解状态,T细胞亚群、细胞因子水平、肿瘤坏死因子和微小残留病灶检测取得满意结果;DC、CIK治疗同时可促进化疗后骨髓造血功能的恢复.结论:DC、CIK用于清除AL残留灶的治疗,安全有效,不良反应少,短期疗效肯定.     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的 探讨人树突状细胞(DC)融合肝癌细胞(HCC)体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用.方法 应用人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞(HerG2/DC)刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2/DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HerG2的特异性杀伤作用.结果 融合细胞HerG2/DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2/DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用.结论 人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫.     

分子嵌合MHC-Ⅰ基因对小鼠DC反应的研究

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制。方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组)。分别感染BALB/c小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞。分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数。结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞。病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17%。单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P<0.01)。结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低。     

The Research on Chimeric MHC-Ⅰ Gene Responsing to Allogeneic Dendritic Cells

目的:构建分子嵌合主要组织相容性复合体(MHC)-Ⅰ基因小鼠骨髓造血干细胞,并探讨其诱导脾脏T细胞对异基因小鼠树突状细胞(DC)反应的机制.方法:密度梯度法分离培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.构建携带C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ基因慢病毒载体(病毒感染组),携带无意义基因慢病毒载体(阴性对照组).分别感染BALB/c 小鼠骨髓造血干细胞,构建分子嵌合细胞.分别取病毒感染组、阴性对照组及未加入病毒的空白对照组造血干细胞输注BALB/c小鼠后7d,获取脾脏T淋巴细胞,分别与C57BL/6小鼠DC进行混合淋巴细胞培养,测定刺激指数.结果:成功体外分选及培养BALB/c小鼠骨髓造血干细胞.病毒感染组C57BL/6小鼠MHC-Ⅰ蛋白表达率可达98.17％.单向混合淋巴细胞培养结果显示,C57BL/6小鼠DC对输注病毒感染组细胞后BALB/c小鼠脾脏T细胞刺激指数明显降低(P＜0.01).结论:输注分子嵌合MHC-Ⅰ基因造血干细胞后,小鼠脾脏T细胞对异基因小鼠DC反应明显减低.     

树突状细胞疫苗对人肺腺癌GLC-82细胞体外杀伤作用的实验观察

目的 通过建立负载人肺腺癌细胞株GLC-82可溶性抗原的树突状细胞(DC)疫苗,探讨应用DC疫苗的致敏特异性杀伤性T细胞(CTL)体外杀瘤细胞的可行性和实验条件,为后期l临床应用提供实验依据.方法 通过用定量摩尔氯化钾提取法获得人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽(TSA),从人外周血单核细胞(PBMC)中用GM-CSF、白细胞介素-4和肿瘤坏死因子-α体外诱导扩增并鉴定获取DC,构建DC疫苗;利用DC疫苗刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖,诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL的可行性及MTT法检测该CTL对GLC-82、肺癌CALU-6和人红白血病K 562细胞的体外杀伤效应.结果 人PBMC体外经7d诱导出的DC,经形态学、免疫组化证实具有典型的树突状细胞特性;负载GLC-82抗原的DC疫苗能有效诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL,最适浓度为1:10;诱导活化的CTL对靶细胞的杀伤活性明显高于未经肿瘤抗原致敏的组.结论 诱导培养人外周血PBMC中的Mo可获取大量DC,诱导出的DC功能较强,适宜临床应用;DC疫苗能强烈刺激初始型同种异体T淋巴细胞增殖产生CD 8+表达增加的CTL;激活的CTL对肺癌靶细胞发挥高效而特异的细胞毒效应,对非肺组织瘤靶细胞也具有非特异性杀伤效应.     

负载肝癌排斥抗原肽的树突状细胞瘤苗活化T细胞的应用

目的　探讨负载肝癌排斥抗原肽SLIVHLNEV(C met突变肽 ) [1 ] 的树突状细胞瘤苗活化的T细胞在体外及裸鼠肝癌模型体内诱导的特异性抗肿瘤免疫。方法　用肝癌排斥抗原肽SLIVHLNEV致敏从脾脏中分离培养的树突状细胞 ,再与同源T淋巴细胞混合培养。乳酸脱氢酶 (LDH)释放法检测细胞毒作用。同时建立荷人肝癌细胞系HHCC的裸鼠移植瘤模型 ,观察DC瘤苗活化的T细胞预防移植瘤发生和抑制移植瘤生长的作用。结果　在体外实验中 ,DC瘤苗诱导的CTLs能够特异性杀伤HHCC肝癌细胞。在裸鼠模型中 ,CTLs不但能预防裸鼠移植瘤的发生 ,而且抑制裸鼠移植瘤生长。结论　负载肝癌排斥抗原肽SLIVHLNEV的树突状细胞瘤苗活化的T细胞在体外和裸鼠模型中均可诱导较强的抗肿瘤免疫     

CD_(44)v_6修饰DC融合瘤苗体外抗结肠癌作用的研究

目的小鼠提取的树突状细胞(DC)和小鼠结肠癌细胞CT26.WT共培养、融合,CD44v6基因来修饰融合细胞,研究CD44v6修饰DC融合瘤苗体外抗结肠癌的作用机制,为肿瘤预防及免疫治疗提供实验依据。方法①在聚乙二醇的作用下,DC细胞和CT26.WT细胞共培养、融合,利用HAT/HT筛选系统筛选出纯净DC融合细胞。在脂质体的作用下,将pBud-CD44v6转染到DC融合细胞中表达;②体外实验观察DC融合瘤苗对小鼠结肠癌细胞的杀灭作用。结果构建了基因CD44v6修饰的DC/CT26.WT肿瘤融合疫苗;实验组细胞的淋巴细胞毒(CTL)活性明显高于对照组。结论 CD44v6修饰的DC融合瘤苗可有效诱导T淋巴细胞产生强大抗结肠癌作用。     

致敏树突状细胞疫苗抗小鼠乳腺癌的实验研究

目的研究以EMT6乳腺癌细胞致敏的树突状细胞(DC)疫苗的抗肿瘤作用。方法无菌取小鼠骨髓细胞,在体外培养条件下经细胞因子诱导为DC,用EMT6肿瘤细胞冻融抗原冲击致敏DC,检测经DC免疫产生的细胞毒T淋巴细胞(CTL)体外杀伤肿瘤细胞的活性。建立EMT6荷瘤小鼠模型,随机分为实验组、实验对照组和空白对照组,于肿瘤接种后第7、14天给予相应DC疫苗治疗,观察致敏DC免疫对小鼠乳腺肿瘤模型的治疗作用。结果致敏DC诱导生成的特异性CTL在体外对肿瘤细胞可产生杀伤作用,与PBS对照组比较,差异有显著性(P<0.05);经致敏DC注射免疫后,小鼠移植瘤得到抑制,与PBS对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论以EMT6乳腺癌细胞致敏的树突状细胞(DC)疫苗在体外和小鼠体内均显示了抗肿瘤作用。     

耐药乳腺癌裸鼠模型免疫治疗初探

目的 耐药乳腺癌表现为治疗效果差,转移率高,死亡率高的一种恶性程度极高的肿瘤性疾病。有研究表明,细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在树突细胞（DC）辅助下,对耐药肿瘤细胞的杀伤能力可能超过T细胞。本实验利用DC与CIK联合培养,比较在不同条件下对乳腺癌多药耐药细胞株的杀伤效应。 方法 分离健康人外周血获得单个核细胞,分别诱导为树突细胞（DC）和CIK细胞,将人类乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的冻融物抗原冲击DC（AP-DC）,分别将DC与CIK细胞共培养（AP-DC+CIK 、DC+CIK）,CIK细胞单独培养作对照。用流式细胞仪分析细胞表型,酶联免疫吸附法（ELISA）测定分泌IL-12、TNF-α、IFN-γ和IL-2水平,MTT法测定细胞毒效应。结果 DC和CIK细胞共孵育,使CIK细胞的CD3CD56双阳性细胞的比例及分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2的水平增高,DC的成熟表型和分泌IL-12的水平增加,其中均以AP-DC+CIK组增高最为明显,和其他组间比较差异有统计学意义。对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的细胞毒效应,AP-DC+CIK组杀伤效应最强, 与DC+CIK组和CIK组比较差异均有统计学意义;结论 经耐药肿瘤抗原负载的DC与CIK共同作用后,其对耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR的抗瘤免疫能力最强,为临床治疗耐药肿瘤带来希望。     

MTT法检测树突状细胞杀伤肿瘤细胞活性的实验研究

目的:用MTT法检测树突状细胞(DC)杀伤肿瘤细胞的活性.方法:将人外周血分离出单个核细胞,在细胞因子的刺激下形成DC,观察其细胞形态、增殖情况,采用MTT法检测DC对肿瘤K562细胞的杀伤活性.结果:DC培养至第1l天时,增殖高达120倍,经MTT法检测证实,DC对K562细胞的4h杀伤活性为3l%.结论:MTT法检测进一步证实了DC对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用.     

小檗碱对DC联合CIK杀伤HepG-2活性的影响

目的：探讨小檗碱对树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）杀伤HepG-2细胞活性的影响。方法：常规分离外周血单个核细胞并诱导生成DC和CIK;DC分成小檗碱组和阴性对照组,小檗碱组在培养48h时加入小檗碱;第8d观察形态并计数;收集培养上清液并测定IL-12水平：将Dc与cIK按不同比例共培养7d,计数各组CIK;MTT法检测CIK对HepG-2的杀伤率。结果：培养第8d小檗碱组DC较阴性对照组多（P〈0．01）;细胞培养上清液中IL-12水平无差别：小檗碱组DC诱导CIK数较阴性对照组多,两组CIK对HepG-2的杀伤率无明显区别。结论：小檗碱主要通过促进DC和CIK增殖发挥增强Dc—CIK群体杀伤肿瘤活性。     

Phthalate esters modulate the differentiation and maturation of mouse peripheral blood mononuclear cell-derived dendritic cells

Phthalate esters, such as di‐(2‐ethylhexyl) phthalate (DEHP), are widespread environmental contaminants. Previously, we have observed that DEHP exacerbates dermatitis elicited by mite antigen in NC/Nga mice. Also, DEHP enhances the functions of bone marrow‐derived dendritic cells (DCs) in vitro. The present study sought to investigate whether phthalate esters affect peripheral blood mononuclear cell (PBMC)‐derived DCs of NC/Nga mice. First, we studied the time course of DC generation from PBMCs and the dose dependency of granulocyte macrophage colony‐stimulating factor and interleukin‐4, and then determined the conditions under which DC differentiation and maturation are moderately induced from PBMCs. Under the conditions determined above, DEHP at 10 μ m significantly inhibited the expression of DC differentiation and maturation markers, such as CD11c, CD40, CD80, CD86 and CD205, whereas mono‐(2‐ethylhexyl) phthalate, a metabolite of DEHP, did not. Furthermore, the effects of DEHP on PBMC‐derived DCs were partially rescued by treatment with ICI 182,780, an estrogen receptor antagonist. Taken together, these results suggest that DEHP can modulate the differentiation and maturation of mouse PBMC‐derived DCs at least partially through activation of the estrogen receptor under our experimental conditions.     

幼年型类风湿关节炎患儿外周血中Th1与Th2比例失衡探讨

目的：探讨JRA患儿外周血中T辅助细胞(Thl／Th2)分布状态。方法：应用三色荧光标记法流式细胞仪检测25例JRA患儿外周血中Thl和Th2的百分率，以8位择期小手术儿童作对照。结果：显示JRA患儿外周血中Th2细胞较正常人少，但Thl数目则与正常人无异。结论：Th2细胞减少，可能是JRA致病原理之一。     

Cytotoxic T lymphocyte response induced by an improved synthetic lipopeptide vaccine against cervical cancer

AIM: To explore cytotoxic T lymphocyte (CTL) response induced by the lipopeptide vaccine against cervical cancer. METHODS: The immunological effect inducing CD8+ T cell-mediated cytotoxicity was investigated in human leukocyte antigen (HLA)-A2 transgenic mice and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy HLA-A2.1+blood donor. The activity of specific CTL was measured by using a standard 4 h( 51)Cr release assay. The content of major histocompatibility complex (MHC) I on T2 cells and the expression of immune molecules on dendritic cells (DC) were detected by flow cytometry, and the concentrations of interleukin (IL)-12 and interferon-gamma were determined by ELISA. RESULTS: The lipopeptide induced a strong epitope-specific CTL response both in vivo (transgenic mice) and in vitro (human PBMC). This CTL induction was critically dependent on the presence of the helper T lymphocyte epitope in transgenic mice, and the presence of a lipid tail bypassed the need for an adjuvant. The stability and persistence of the antigenic complex formed with the lipopeptide increased in comparison with the CTL parental peptide. The lipopeptide could induce the production of IL-12 in DC, but not the maturation of DC directly. CONCLUSION: The combination of CTL and the T helper epitope and lipid molecule can remarkably improve the immunogenicity of the CTL peptide, the mechanism of which is associated with an increase in the stability and persistence of the antigenic complex formed with the lipopeptide and in the production of IL-12 in DC induced by the lipopeptide. The lipopeptide can be considered a more effective vaccine type for human being.     

恶性腹腔积液来源的树突状细胞与CIK共培养后对结肠癌细胞体外杀伤作用的研究

目的探讨恶性腹腔积液来源的树突状细胞（DC）与CIK细胞共培养后对SW620结肠腺癌细胞的体外杀伤作用。方法分离15例结肠癌患者的腹腔积液培养获得成熟DC,分离健康人外周血培养获得CIK细胞,DC细胞与CIK细胞共培养,流式细胞仪鉴定表型,MTT法检测各组对结肠癌细胞的体外杀伤作用。结果恶性腹腔积液中存在DC前体细胞,经体外细胞因子诱导培养后可获得成熟的DC细胞,高表达HLA—DR、CD80、CD83、CD86分子。DC与CIK共培养对SW620结肠腺癌细胞的杀伤作用较单独CIK组有明显差异（P〈0．05）。结论腹腔积液中存在DC前体细胞在体外诱导培养可获得功能正常的成熟DC细胞,与CIK共培养后可增强其体外杀伤毒性。     

High amounts of beta-endorphin in peripheral blood mononuclear cells from HANE patients.

We measured peripheral blood mononuclear cells (PBMC) beta-endorphin (BE) in patients suffering from hereditary angioneurotic edema (HANE), a disease attributed to C1-esterase inhibitor (C1INH) deficiency inherited as an autosomal dominant trait. Two orders of considerations prompted us to undertake the study reported herein: the presence of elevated plasma BE concentrations in HANE and the demonstration of BE-immunoreactivity in human unstimulated peripheral blood leukocytes obtained from healthy volunteers. Our results show that patients suffering from HANE have a very high BE presence in uncultured, unstimulated PBMC and in unstimulated PBMC cultured for 48 h. At this time high BE concentrations are detected in the culture supernatants. These observations suggest that in HANE patients the same factor(s) involved in causing increased secretion and release of BE from the pituitary (and, in turn, increased plasma BE levels) can play a relevant role also in the determination of high BE presence in PBMC and BE release from the cells.     

冻融人外周血树突状细胞基因疫苗体外抗肿瘤活性研究

目的观察EB病毒潜伏膜蛋白重组腺病毒(rAd-EBV-LMP2)转染的冻融人外周血树突状细胞(DC)诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗肿瘤活性。方法人外周血来源的单核细胞经细胞因子扩增培养为成熟DC,液氮冻存;rAd-LMP2重组腺病毒转染冻融DC制备疫苗。动态观察细胞形态学特征,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖活性,以及诱导的CTL对肿瘤细胞的杀伤活性。结果rAd-LMP2转染的冻融DC疫苗具有形态迥异、多突起的典型形态学特征,其刺激同种T淋巴细胞的增殖能力明显高于对照组(P<0.01),能诱导高效的CTL活性(P<0.01),与新鲜DC疫苗差异无统计学意义(P>0.05)。结论rAd-LMP2转染冻融DC疫苗在体外能激发较强的EBV-LMP2特异性的功能性CTL,为EBV相关的鼻咽癌(NPC)的免疫治疗提供策略。